Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma
Summary
Ortotópico inyección intracraneal de células del tumor se ha utilizado en la investigación del cáncer para el estudio de la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica. Presentamos la tomografía molecular fluorescencia de xenoinjertos tumorales, que proporciona en tiempo real imágenes intravital y cuantificación de un tumor masivo en modelos preclínicos de glioblastoma.
Abstract
Colonización es la capacidad de las células cancerosas forman un tumor masa. Un enfoque ampliamente utilizado para determinar si las células son tumorigenic es inyectando ratones inmunodeficientes por vía subcutánea con células de cáncer y midiendo la masa de tumor después de se vuelve visible y palpable. Orthotopic inyecciones de células de cáncer tienen como objetivo introducir el xenoinjerto en el microambiente que más se asemeja al tejido de origen del tumor en estudio. Investigación de cáncer del cerebro requiere inyección intracraneal de las células cancerosas para permitir la formación de tumores y el análisis en el microambiente único del cerebro. La proyección de imagen en vivo de xenoinjertos intracraneales monitorea instantáneamente la masa tumoral de orthotopically engrafted ratones. Aquí divulgamos el uso de la tomografía molecular de la fluorescencia (FMT) de xenoinjertos de tumor de cerebro. Las células cancerosas son transduced en primer lugar con cerca de proteínas fluorescentes infrarrojos y luego se inyecta en el cerebro de ratones inmunodeprimidos. Los animales se analizan a continuación para obtener información cuantitativa sobre la masa tumoral durante un periodo prolongado de tiempo. Células previamente etiquetado permite la cuantificación efectiva, reproducible y confiable de la carga del tumor dentro de cada ratón. Eliminó la necesidad de inyectar de sustratos y por lo tanto reduce el estrés en los animales. Una limitación de este enfoque está representada por la incapacidad para detectar masas muy pequeñas; sin embargo, tiene mejor resolución para masas más grandes que otras técnicas. Puede ser aplicado para evaluar la eficacia de un tratamiento farmacológico o alteraciones genéticas de líneas celulares de glioma y de muestras de paciente derivado.
Introduction
El cáncer es una de las principales causas de muertes relacionadas con la enfermedad en seres humanos en el mundo industrializado. Con un altísimo número de muertos, nuevos tratamientos son urgentemente necesarios. Glioblastoma multiforme (GBM) es un tipo muy letal de cáncer de cerebro, compuesto por poblaciones heterogéneas de células stromal e inmune del tumor de cerebro. Según el registro de tumores de cerebro Central de los Estados Unidos, la incidencia de tumores cerebrales primarios malignos y no malignos es aproximadamente 22 casos por cada 100.000 personas. Se espera que aproximadamente 11.000 nuevos casos diagnosticados en los E.e.u.u. en 20171.
Estudios preclínicos investigan la probabilidad de que un medicamento, procedimiento o tratamiento sea efectiva antes de la prueba en seres humanos. Uno de los primeros pasos de laboratorio en estudios preclínicos es identificar posibles dianas moleculares para el tratamiento de drogas mediante el uso de las células cancerosas implantadas en un organismo anfitrión, definido como modelos de xenoinjerto humana. En este contexto, modelos de xenoinjerto de tumores cerebral intracraneal con xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) han sido ampliamente utilizados para estudiar la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica y más recientemente para el desarrollo de biomarcadores, la droga screening y personalizada medicina2,3,4.
Uno de lo más económico y no invasivo en vivo imágenes métodos para monitorear xenoinjertos intracraneales es bioluminiscencia imagen (BLI)5,6,7,8. Sin embargo, algunas limitaciones de BLI incluyen administración de sustrato y la disponibilidad, estabilidad de la enzima y luz apagando y dispersión durante la proyección de imagen de adquisición9. Aquí divulgamos el FMT infrarrojo como alternativa de método para monitorear modelos preclínicos de glioblastoma. En este método, adquisición de señal y cuantificación de PDXs intracranially implantados, expresan una proteína fluorescente infrarroja iRFP72010,11 (denominada en adelante como FP720) o turboFP635 (en adelante denominados como FP635), se realiza con un sistema de imagen de FMT. Usando la tecnología de la FMT, la ortotópica de tumores pueden ser monitoreado en vivo antes, durante o después del tratamiento, de una manera no invasiva, libre de sustrato y cuantitativa para las observaciones preclínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenoinjertos tumorales se han utilizado en la investigación del cáncer y se ha desarrollado una serie de técnicas de imagen bien establecidas: BLI; resonancia magnética (MRI); tomografía de emisión de positrones (PET), computada (CT); FMT. Cada uno de estos enfoques viene con pros y contras, pero al final se complementan con el tipo de informaciones. Uno de los más utilizados en vivo tecnología de imagen es BLI5,6,7</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center para GBM-PDX neuroesferas. Este trabajo fue apoyado por la derrota GBM investigación colaborativa, una filial de la sociedad nacional de cerebro Tumor (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), la James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benítez fue apoyada por un premio de la Asociación Americana de Tumor cerebral (ABTA); Ciro Zanca fue parcialmente financiado por una beca de investigación postdoctoral de la Fundación de cáncer americano italiano. Frank Furnari recibe salario y apoyo adicional del Instituto Ludwig para la investigación del cáncer.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
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