Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

הזרקה תוך-גולגולתי Orthotopic של תאים סרטניים שימש בחקר הסרטן ללמוד ביולוגיה גידול במוח, התקדמות, התפתחות, תגובה טיפולית. כאן אנו מציגים פלורסצנטיות מולקולרית טומוגרפיה של גידול xenografts, אשר מספק הדמיה intravital בזמן אמת, כימות של גידול המוני במודלים פרה גליובלסטומה.

Abstract

Tumorigenicity היא היכולת של תאים סרטניים בצורת גידול בנפח גדול. בגישה בשימוש נרחב כדי לקבוע אם התאים נמצאים tumorigenic היא על ידי הזרקת עכברים immunodeficient subcutaneously עם תאים סרטניים, מדידת המסה הגידול אחרי זה הופך להיות גלויים ולא מוחשי. זריקות Orthotopic של התאים הסרטניים שואפים להציג את xenograft ב microenvironment הדומה ביותר את רקמת המוצא של הגידול נחקר. חקר סרטן המוח דורש הזרקה תוך-גולגולתי של תאים סרטניים כדי לאפשר את היווצרות הגידול וניתוח ב microenvironment ייחודי של המוח. אין ויוו ההדמיה של xenografts תוך-גולגולתי מנטרת באופן מיידי גידול המוני של עכברים orthotopically engrafted. כאן אנחנו מדווחים על השימוש של קרינה פלואורסצנטית מולקולרית טומוגרפיה (FMT) של המוח גידול xenografts. התאים הסרטניים קודם transduced עם יד חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום, לאחר מכן מוזרק במוח של עכברים immunocompromised. החיות נסרקות כדי לקבל מידע כמותי על המסה הגידול על פני תקופה ארוכה של זמן. תא תיוג מראש מאפשר כימות נטל הגידול בתוך העכבר כל העלות האפקטיבית, לשחזור ואמין. אנחנו ביטלה את הצורך הזרקת סובסטרטים הדמיה, ובכך להפחית את הלחץ על בעלי החיים. מגבלה של גישה זו מיוצגת על ידי חוסר היכולת לזהות גושים קטנים מאוד; עם זאת, יש רזולוציה טובה יותר עבור גושים גדולים יותר מאשר שיטות אחרות. ניתן להחיל אותה כדי להעריך את היעילות של טיפול תרופתי או שינויים גנטיים של שורות תאים glioma ודוגמאות נגזר החולה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים של מחלות הקשורות מקרי מוות בקרב בני-האדם בעולם המתועש. עם מספר ההרוגים גבוה ביותר, טיפולים חדשים נדרשים בדחיפות. גליובלסטומה (GBM) הוא סוג קטלני ביותר של סרטן במוח, המורכב אוכלוסיות הטרוגניות של תאי המוח גידול, סטרומה, ואת המערכת החיסונית. לפי הרישום גידול המוח המרכזי של ארה ב, השכיחות של גידולים במוח העיקרי ממאיר, שאינם ממאירים הוא כ 22 מקרים לכל 100,000. כ 11,000 תיקים חדשים צפויים להיות מאובחנים בארה ב 20171.

מחקרים פרה לחקור את הסבירות של סמים, נוהל או טיפול יעיל לפני בדיקות אצל בני אדם. אחד הצעדים המוקדמים מעבדה מחקרים פרה הוא זיהוי פוטנציאל מטרות מולקולריות לטיפול סמים באמצעות תאים סרטניים מוטמן בתוך אורגניזם המארח, כהגדרתו xenograft האנושי מודלים. בהקשר זה, של xenograft גידול מוח תוך-גולגולתי באמצעות החולה נגזר xenografts (PDXs) היה בשימוש נרחב ללמוד ביולוגיה גידול במוח, התקדמות, התפתחות, תגובה טיפולית, ואף לאחרונה לפיתוח סמנים ביולוגיים, סמים הקרנת, ומותאמת אישית רפואה2,3,4.

אחד הכי פולשני ובמחיר ויוו הדמיה שיטות לעקוב אחר xenografts תוך-גולגולתי היא ביולומינסנציה הדמיה (בלי)5,6,7,8. עם זאת, מספר מגבלות רבנות בלי לכלול המצע המינהל, זמינות, יציבות אנזים, אור שכבתה ואת פיזור במהלך הדימות רכישת9. כאן מדווחים על FMT אינפרא-אדום כחלופה הדמיה שיטה לפיקוח גליובלסטומה פרה מודלים. זו שיטה, רכישת אות, כימות של PDXs intracranially מושתל, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי-סגול iRFP72010,11 (מעתה ואילך כינה FP720) או turboFP635 (מעתה ואילך כינה FP635), הוא הופיע עם FMT מערכת הדמיה. באמצעות הטכנולוגיה FMT, orthotopic גידולים יכולים להיות במעקב בבית vivo לפני, במהלך או לאחר טיפול, בצורה לא פולשנית ללא סובסטרט, כמותיים על תצפיות פרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השימוש של חיות מחקר ניסיוני מדבקים, כגון lentivirus כדי מגלי התאים הסרטניים, מחייבים אישור מראש על-ידי התוכנית המוסדית טיפול בבעלי חיים, בידי הוועדה המוסדית אבטחה. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו (UCSD).

1. תיוג של גליובלסטומה תאים עם FP635 או FP720 לבנות

  1. לייצר ולטהר lentivirus לפי הפרוטוקול המתואר על-ידי. Tiscornia et al. 12
  2. תרבות כ 2.0 x 106 תאים קו תא glioma האנושי DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS) בקערה בגודל 15 ס מ; או תרבות 2.0 x 106 גליובלסטומה האדם החולה נגזר (GBM-PDX) ספירות עם DMEM/F12 בינוני 1:1 עם B27 תוספת פלוס האנושי רקומביננטי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF; 20 ng/mL), FGF (10 ng/mL) בבקבוקון T75.
  3. לשמור על כל התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 100% לחות יחסית.
  4. לבטל את התאים.
    1. עבור התאים glioma: להסיר את תגובת שיקוע של הלוחות והוספת 3-5 מ של טריפסין 1 X בתאי glioma.
    2. עבור GBM ספירות: לאסוף את התאים על ידי pipetting התאים לתוך צינור 15-mL.
      1. ספין למטה הכדורים GBM-200 g x עבור 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחן בטמפרטורת החדר.
      2. הסר את תגובת שיקוע והוסף 3-5 מ של פתרון ניתוק התא.
    3. דגירה כל התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  5. בזהירות מביצועם בתאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים (להבטיח כי הספירות ותאים glioma יושלמו חלופה מועדפת) ו ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.
  6. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים 5 מ של מדיום על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. לקבוע את הכדאיות התא על ידי trypan blue הדרה.
  7. צלחת 1.0 x 106 תאי היעד בקערה ס מ-10 עם 5 מ של בינוני על-ידי pipetting.
  8. מגלי תאים עם lentivirus המבטאים חלבונים פלורסנט-ריבוי של זיהום (MOI) 5 כפי שמתואר על ידי. Tiscornia et al. 12 דגירה ב 37 º C.
  9. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום של התאים transduced, הוסף 5 מ של בינוני טריים ולאחר תקופת דגירה של 48 שעות נוספות ב 37 º C.
  10. לבטל את התאים הנגועים להשעיה תא בודד כפי שמתואר צעדים 1.4-1.6. ספין למטה התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות ו resuspend ב µL 500 של מיון פתרון (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% FBS).
  11. Pipette התליה תא לתוך צינורות FACS. שיתוף מכתים את התאים עם 1 µL/mL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) כדי לא לכלול תאים מתים. פקדים שלילי נדרשים כדי להגדיר את השערים cytometer זרימה (שאינם transduced תאים ותאים שאינם transduced / דאפי צבעונית).
  12. למיין את התאים פלורסנט-חיובי/דאפי-שלילי לתוך מיון הפתרון, כפי שתואר על ידי. Basu et al. 13, ולאסוף את התאים ממוינים לתוך צינור חרוטי 15-mL.
  13. ספין למטה בתאים ממוינים ב g x 200 עבור 5 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend ב 5 מ של תרבות בינוני. זרע בתאים ממוינים מנה ס מ-10 על ידי pipetting. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48-72 שעות.
  14. הרחב את התאים ממוינים לפי בריא התאים ביצוע השלבים 1.4-1.6 ו ציפוי מנות מרובות לניסויים ויוו .
    הערה: לקבלת פרטים נוספים אודות התא מיון והכנה טיהור, ראה Basu. et al. 13

2. תוך-גולגולתי הזרקת תאי גליובלסטומה מתויג iRFP לתוך Immunodeficient עכברים

הערה: לפני תחילת הניתוח, ודא חדר ניתוח והכלים הם נקיים עבור ההליך. השתמש immunodeficient athymic בעירום (Foxn1nu) זכר או נקבה עכברים, בין בן 4-5 שבועות 17-19 ג'י לזריקות תוך-גולגולתי. צריך להיות בו חיות לפחות 3 ימים לאחר הגעתו, לפני הניתוח.

  1. הכנה תא
    1. הקציר מביצועם פלואורסצנט תאים חיוביים-glioma להשעיה תא בודד (שלבים 1.4-1.6), resuspend 0.5 או 1.0 x 10 תאים6 µL 2-5 ל- PBS לכל זריקה לכל חיה. Pipette התליה תא לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge מקום על קרח.
  2. ניהול והכנה של הרדמה
    1. להכין µL 200 תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) לכל 20 גרם של משקל הגוף העכבר. שוקל החיות ולחשב את המינון המתאים של הרדמה.
    2. לספק זריקה בקרום הבטן של הרדמה, להחיל משחה אופטלמולוגיות לעיניים כדי למנוע התייבשות. לפרטים נוספים אודות שלב זה ראה קתלין. et al. 14 מקום בעל החיים על משטח המים מראש ומחוממת תרמי ב 37 º C.
    3. בדוק כי החיות הן ומורדמת באמצעות ניטור התגובה קמצוץ הבוהן (רפלקס פדלים), בדרך כלל בתוך 5-10 דקות.
  3. הזרקה תוך-גולגולתי
    1. לטעון µL 5 של המזרק המילטון (בוטה קצה המחט) עם תא הבולם, טען בעל רגש.
    2. מקם את העכבר בתוך מסגרת סטיאוטטי בעלי חיים קטנים ולתקן את הראש באמצעות פסי האוזן ואת המתאם החותכת בעקבות הפרטים המתוארים Cetin. et al. 15
    3. לחטא את הראש עם 70% אתנול וביו -betadine פתרון. ודא שבאתר כירורגית היא להשלים סטרילי. לבצע חתך באמצע עם אזמל קטן ולהפריד את העור ואת רקמות החיבור.
    4. מקם את המזרק המילטון על הנקודה bregma באמצעות micromanipulator.
    5. להעביר את המכשיר מחזיק 1.0 מ מ anteroposterior ו- 2.0 מ מ לרוחב נקודת bregma. סמן עמדה זו עם עיפרון.
    6. במיקום זה, בזהירות תעשה חור בגולגולת עם מקדח ידניים micromotor על ידי הפעלת לחץ קלה כלפי מטה עד כלי הדם לנראה. לא לשבש parenchyma מאטר והמוח מעידה.
    7. להציג את המחט לתוך החור burr ולקדם 3.0 מ מ מתחת לפני השטח pial.
    8. כוונן את עוצמת הקול (µL 2-5) ואת קצב הזרימה (µL 1/דקה) של הזרקת באמצעות מזרק stereotaxic ממונע או לבצע ידנית את הזריקה.
    9. אחרי הזריקה, הסר את המחט בהדרגה לפי בסדר עולה 1.0 מ מ לכל 1 דקות ולנקות ההזרקה עם 70% אתנול.
    10. קרוב לעור פצע עם תפרי ניתוח או על-ידי הפיכת התפרים כירורגי (המכונה לעתים קרובות תפרים) ולראות את קייטלין. et al. 14 לפרטים נוספים.
  4. שחזור בעלי חיים
    1. להעביר את החיה מים תרמיים פנקס (37 מעלות צלזיוס) ונטר את טמפרטורת הגוף, קצב הנשימה, קצב הלב, עד החלמה מלאה. לנהל נגד כאבים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.
      הערה: לקבלת מידע נוסף על הליך סטיאוטטי, ניתוח, קואורדינטות, ראה אחרים דוחות5,14,15.

3. FMT הדמיה

הערה: על פי המטרה ניסיוני, גליובלסטומה מתויג iRFP תאים יכולים להיות פיקוח ויוו לפני, במהלך או לאחר טיפול. הדמיה מטרה, עזים ומתנגד בעלי החיים באמצעות חדר אינדוקציה איזופלוריין, לשמור במגרה הדמיה במהלך סריקה, ואת התמונה בתחנת עגינה של הצלם FMT.

  1. הסר את החיה הכלוב ואת המקום בבית הבליעה אינדוקציה איזופלוריין. לסגור את התא, הפעל זרימת החמצן ואת מכשיר אידוי 3-5%.
  2. לפקח על החיה עד אותו. הוא לגמרי מורדם, בדרך כלל בתוך 1-2 דקות הכרה חיות כדאי לא להגיב לגירויים חיצוניים.
  3. להסיר את החיה anesthetized מן החדר ולשים החיה הקלטת הדמיה על-ידי הצבת את מתאם ראש תחילה, ולאחר מכן על-ידי הצבת החיה פונה כלפי מטה. ודא כי הראש ממוקם במרכז הקלטת.
  4. למקם את הפלטה בקלטת על העליונה, והדק את ידיות התאמת עד 17 מ"מ.
  5. פעם זה החיה שמורה בחדר בקלטת הדמיה, המשיכו הדמיה על-ידי הוספת את הקלטת בתחנת העגינה פנימי של הצלם FMT, איפה איזופלוריין נשאבים לשמור את החיה מורדם.
  6. להפעיל את התוכנה imager, מנתח על-ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
  7. בחלון "ניסיוני tab", בחר את "מסד נתונים" ואת "קבוצת לימוד".
  8. ליד החלון "הכרטיסייה סריקה" ובחר את הנושא את התמונה על ידי לחיצה על "בחר נושא". כמו כן, בחרו בערוץ לייזר שבלוח "לייזר ערוץ". עבור התאים התווית על-ידי FP635, בחר "ערוץ 635 ננומטר לייזר", ולאחר עבור התווית על-ידי FP720 תאים, בחר ""ערוץ 680 nm בלייזר.
  9. רוכשים תמונה על-ידי לחיצה על האפשרות "ללכוד" חלון "הכרטיסייה סריקה". לאחר מכן, להתאים את השדה סריקה על ידי לחיצה וגרירה בתחום הסריקה. בתמונה שנלכדה למספר נחושים ממיקומי המקור, בדרך כלל בתוך 20-25 מקורות עבור הצד חולשת.
  10. בחר באפשרות "הוסף לתור שחזור" ולחיצה על הכפתור "סרוק" בחלון "הכרטיסייה סריקה".
  11. המתן עד הסריקה הושלמה, ואז להסיר את הקלטת הדמיה מתחנת העגינה.
  12. להסיר את הפלטה בקלטת ולמקם מאחור בעלי חיים לתוך הכלוב.
  13. חזור על השלבים 3.1-3.12 עבור שאר החיות.

4. תמונות ניתוח

  1. התוכנה imager, מנתח, בחר את חלון "ניתוח tab".
  2. טען את ערכת הנתונים ואת הנושא לנתח באמצעות לחיצה על לחצן "+" שבלוח "בחירת הנתונים (dataset)" חלון "ניתוח tab".
  3. לאחר התמונה נטענה בחלון "ניתוח tab", לבצע את האזור של הריבית (ROI) ניתוח על-ידי בחירה בסמל האליפסואיד, מלון הפינה השמאלית העליונה של חלון "ניתוח tab".
  4. התאם את הסף לאפס שבלוח "נתונים סטטיסטיים" על-ידי לחיצה ימנית העמודה "סף" חלון "ניתוח tab".
  5. סה כ ערך שבלוח "נתונים סטטיסטיים" מייצגת את האות מתאי גליובלסטומה מתויג פלורסנט מושתל במוח העכבר.
  6. חזור על הצעדים 4.2-4.4 שאר החיות. לטעון או להסיר את נושא חדש על-ידי לחיצה "+" או "−" כפתור, בהתאמה, בחלונית "בחירת הנתונים (dataset)" חלון "ניתוח tab".
    הערה: לקבלת מידע נוסף אודות FMT הדמיה ותפעול התוכנה, ראה20-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastoma תאים U87EGFRvIII (תאים U87 יתר ביטוי variant קולטן EGF III) היו תרבותי על פי השלב 1.2. Lentivirus והופק מטוהרת על פי שלב 1.1. ריכוז ויראלי נקבע על ידי p24 אליסה ניתוח. התאים היו transduced עם lentivirus נושאת אינפרא-אדום פלואורסצנטי חלבונים על פי שלב 1.8. פלסמיד קידוד FP72010,11 בחביבות סופק על ידי ד ר V.V. Verkhusha, וקטור FP635 נרכש מספק מסחרי. התאים היעד היו FACS ממוין להעשיר לאוכלוסיה העליון 10% ביותר פלורסנט תא (איור 1 א'). הגדלת האות פלורסנט משפרת את הרגישות של מערכת טומוגרפיה זריחה. כדי לאמת את עוצמת האותות של תאים עם תוויות fluorescently לפני ההשתלה orthotopic, השתמשנו בקלטת פנטום של הצלם FMT. באופן ספציפי, U87EGFRvIII-TurboFP635 ו- U87EGFRvIII-iRFP720 התאים היו חלופה מועדפת עם טריפסין, עונה 1 פרק 105, עונה 1 פרק 106, ועונה 1 פרק 107 תאים היו resuspended ב µL 100 ל- PBS קר קרח, בהתאמה מנותח. םלצה FMT מאפשר זיהוי 4 ערוצים: 635 nm, 680 nm, 750 ננומטר, 780 ננומטר. ערוצי רחוק אינפרא-אדום 750 ננומטר, 780 nm אינם מתאימים לניתוח זה כי אין פליטה באורכי גל כזה מסגול פלורסנט החלבונים בשימוש (נתונים לא מוצג). לכן, ניתחנו את האותות פליטה בעומק 635 nm ו 680 ננומטר. דיווח באיור1, פלורסנט האות כימות התמונה ואת העוצמה עבור שני FP635 (איור 1B, ג), FP720 (איור 1D, E), אשר יגבירו באופן יחסי כמו עליות מספר תאים. ראוי לציין, הפליטה עבור FP635 מוצגת בערוץ 635 nm אך לא את הערוץ nm 680. לעומת זאת, הפליטה עבור FP720 מוצגת בערוץ nm 680 אך לא את הערוץ 635 ננומטר. זה מה שעושה. אותם שני חלבונים פלורסנט מועמד מתאים ללימודי שבו שתי אוכלוסיות של תאי ניתן שכותרתו ופיקחו בו זמנית באמצעות שני תוויות פלורסנט אינפרא-אדום.

U87EGFRvIII תאים עם תוויות ליד חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום אז שימשו orthotopic הזרקת וניטור ויוו הגידול בצמיחה, כפי שמתואר צעדים 2.1 2.4. השתמשנו באותו תא קו, קרי, U87EGFRvIII, עם התגים שונה פלורסנט, תוויות לשלול גידול צמיחה ההבדל בין סוגי תאי סרטן. העכברים הוזרקו תאים U87EGFRvIII-TurboFP635, U87EGFRvIII-iRFP720 תאים או שילוב שווה (1:1) של הקווים תא שני. סך של 5 x 105 תאים נפח 5 µL של PBS הוזרקו intracranially אל תוך 4-5 שבועות הישן immunocompromised athymic עירום עכברים באמצעות מערכת סטיאוטטי ומזרק המילטון, 2.3 השלבים הבאים-2.4.... הרדמה בוצעה על ידי הזרקה בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים. החיות היו חימם ברחבי הזריקה באמצעות משטח מים תרמיים, בדקו סימני מצוקה. Engraftment גידול וצמיחה היה אז בפיקוח על FMT מערכת הדמיה. במהלך המפגשים סריקה, העכברים היו מרדימים באופן זמני באמצעות תא איזופלוריין 3% (שלבים 3.1-3.12). העכברים היו לאחר מכן להציב על קלטת הדמיה, עם תמונה בתוך הלייזר סורקת את המצלמה. כל עכבר שנסרק באמצעות של 635 nm וערוצי nm 680. כימות אות הוקלט במשך הזמן, עכברים היו מורדמים מיד עם תחילת סימפטומים נוירולוגיים, על פי הנחיות טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC). כמצוין איור2 א, אות פליטה U87EGFRvIII-TurboFP635 היה ניכר בערוץ 635 nm, רקע מינימלי אות הוקלט בערוץ nm 680 (דמויות 2B, ג). לעומת זאת, U87EGFRvIII-iRFP720 תאים הנפלטים בערוץ nm 680 מציג רקע הקטנה בערוץ 635 nm (2D דמויותF). לבסוף, עכברים מוזרק עם שילוב 1:1 של U87EGFRvIII-TurboFP635 תאים ותאים U87EGFRvIII-iRFP720 הראו אות מוגבר בשני ערוצים עבור משך הזמן של הניסוי (דמויות 2Gאני). נתונים אלו מראים שאפשר לנצל חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום עבור כפול ויוו הדמיה של אוכלוסיות תאים סרטן. הנתונים גם להצביע על חלבונים שונה פלורסנט שיש עוצמה שונות של פליטה האות שלהם. כאן, עוצמת אות FP720 היה מעולה כדי FP635, עם רגישות מוגברת באיתור אוכלוסיות קטנות יותר של תאים סרטניים באווירה ניטור לא פולשנית.

ההשפעות של ג'ין להחרשת גנים הקשורים לסרטן ב- tumorigenicity במודלים פרה ניתן גם ללמוד עם פרוטוקול זה. עבור מטרה זו GBM-הספירות (GSC23 ו- GSC11) היו בתרבית (שלב 1.2), transduced עם FP720-lentivirus (שלב 1.8). התאים לבטא FP720 היו FACS מוינו כפי שתוארה קודם לכן בשלבים 1.11-1.13. תאים התווית על-ידי FP720 היו transduced משותפת עם קידוד lentivirus shRNA מיקוד daxx ב (shDaxx) או פקד shRNA (shLuc) בגיל MOI 516. התאים היו תרבותי במשך 5 ימים הפומבית להשעיה תא בודד, עונה 1 פרק 106 תאים היו resuspended ב µL 3 ל- PBS להזרקה תוך-גולגולתי. היעילות של shRNA מיקוד daxx ב אושר ע י שעתוק במהופך כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (RT-qPCR) ב GSC23 (איור 3 א), GSC11 (איור 3C). תאים GBM-iRFP720/shRNA היו stereotactically מוזרק את סטריאטום של עכברים immunodeficient, על-פי השלבים 2.3 2.4. חיות נצפו סימנים נוירולוגיים, האות פלורסצנטיות היחסי של xenografts נותחו על ידי מערכת הדמיה FMT, לכמת באמצעות ניתוח תוכנה, על-פי השלבים 3.1-4.6. להחליפן בתמונות של FMT להראות אות פלורסצנטיות ירידה בעכברים engrafted עם shDAXX/GBM-הספירות בהשוואה חיות. מושתל shControl (איור 3B ו איור דו-ממדי) עבור שני הדגמים ספירות-GBM, המאשר שלנו מציאת הקודם16 כי עיכוב daxx ב represses הגידול במודלים פרה גליובלסטומה.

Figure 1
איור 1: רגיל עקומות באמצעות תאים עבור פנטום וניתוח FACS. (א) נציג FACS היסטוגרמות של FP720 - ו FP635-U87EGFRvIII לבטא תאים (שמאל וימין לוח, בהתאמה). Glioma התאים היו נגועים lentivirus קידוד חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום וממוינות FASC להעשיר עבור הביטוי הגבוהה ביותר של החלבונים FP720 או FP635. להחליפן בתמונות להשיג התוכנה imager, מנתח של U87EGFRvIII-TurboFP635 (B), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) השעיות תא שימוש בקלטת פנטום. לוחות העליון מייצגים את האות 635 nm ערוץ והתחתון הפאנלים בערוץ nm 680. לודיג התא מספר התכתב לעלייה אות חזותי. האות כימות של U87EGFRvIII-TurboFP635 (ג) ו- U87EGFRvIII-iRFP720 (E) תאים ב- 635 nm וערוצי nm 680. יחידות קרינה פלואורסצנטית יחסית הם הצביעו על סרגל הצבע. קווי שגיאה לייצג S.E.M. בין 3 סריקות שונות לכל תא ההשעיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מודל xenograft של גידול במוח באמצעות U87EGFRvIII תאים ערוצים שונים שנסרקו ב. להחליפן בתמונות של פלורסנט אות ב- 635 nm וערוצי nm 680 מחיות intracranially מושתל עם U87EGFRvIII-turboFP635 (א), U87EGFRvIII-iRFP720 (D) שילוב mix (1:1) של U87EGFRvIII-iRFP720: תאים U87EGFRvIII-turboFP635 (G). תמונות נרכשו ביום 5 לאחר הסריקה הראשונה. (B, E, H) אות עוצמת ניטור עבור כל העכבר על פני תקופה של 5 ימים. כל עכבר שנסרק בערוץ 635 nm (סרגל כחול), התעלה 635 nm (ברים אדומה). הגוון הבהיר ביותר של פס צבע מייצג יום 1 של סריקה של הגוון הכהה מייצג היום 5. (ג, נ, אני) קרינה פלואורסצנטית היחסי כימות מציג השוואה ישירה של עוצמת האות מן התעלה 635 nm (כחול) וערוץ 680 nm (אדום) במדגם כולו של עכברים. יחידות קרינה פלואורסצנטית יחסית הם הצביעו על סרגל הצבע. נתונים מציגות את ערכי מרושע עם סטיית תקן של 3 בעלי חיים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ג'ין להשתיק ב גליובלסטומה פרה מודלים באמצעות FMT. ניתוח ביטוי גנטי של daxx ב מאת RT-qPCR, GSC23 (א) ו- GSC11 (ג) glioma נגזר החולה תאים transduced עם מקודד lentivirus shRNAs מיקוד daxx ב (shDaxx) או shRNA ובקרה (shLuc) FP720. להחליפן בתמונות של פלורסנט אות מן התעלה nm 680 של orthotopically engrafted עכברים. מושתל GSC23-iRFP720 (B) ותאים GSC11-iRFP720 (D) נגזר החולה. קרינה פלואורסצנטית חזקה האות הוא ציין בבעלי. מושתל shRNA שליטה (shLuc) (החלק העליון של החלונית) בהשוואה עכברים. מושתל shRNA-daxx ב (shDaxx) (בחלק התחתון של החלונית), המציין כי עיכוב DAXX מדכאת את הגידול הצמיחה במודלים פרה glioma נקבעים על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית. יחידות קרינה פלואורסצנטית יחסית הם הצביעו על סרגל הצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הגידול xenografts היו בשימוש נרחב בחקר הסרטן, מספר טכניקות הדמיה ומבוססת פותחה: רבנות בלי; תהודה מגנטית הדמיה (MRI); טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), שחושב טומוגרפיה ממוחשבת (CT); FMT. כל הגישות הללו מגיע עם היתרונות והחסרונות, אך בסופו של דבר משלימים אחד את השני עם הסוג של המידע. אחד ה הנפוץ ויוו הדמיה טכנולוגיה היא מתה על5,6,7,8. מתה על FMT שניהם דורשים תא הנדסה (עם אנזימים לוציפראז או חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום) אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. מתה על רגיש יותר עבור ההמונים גידול קטן אך דורש בקרום הבטן הזרקה של מצע (luciferin), אשר מגיעה תפוצה מקסימלית בגוף 10-12 דקות; אבל אור שכבתה פיזור במהלך הדימות רכישה, המצע סיווג להתרחש בתדירות גבוהה9. FMT, במקום זאת, אינה דורשת כל הניהול המצע נוספים לבעלי והוא אות שלו יציב, ללא תלות בזמן או אנזים יציבות. בנוסף, FMT, כאשר נעשה שימוש באותם תנאים ניסיוני, מציע לשחזור נתונים כמותיים למחצה. מתה על וגם FMT לא מציעים רזולוציה מרחבית; עם זאת, צימוד שיטות אלה עם סריקת כתובות בעיה זו.

סריקת סי. טי מודד את הנחתה של פוטונים כאשר האות חוצה את הגוף בעל חיים זה אידיאלי בזיהוי מבנה גופם. ניגוד רקמות רכות, אשר עשויים להפריע הגילוי של גידול קטן תוך גולגולתי, עם זאת, מגבלה זו הגישה17,18. חיסרון נוסף אחד של CT הוא השימוש של קרינה ומדיה ניגודיות, אשר יכול לגרום לשינויים בתאי המטרה. סריקת סי. טי יכול להיות משולב עם חיית המחמד, אשר משתמשת radiolabeled המשדרים כמו גלוקוז אנלוגי, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; אבל זה יכול גם להפריע כמה תהליכים פיזיולוגיים של חיות קטנות. לעומת זאת, FMT אינו זקוק לכל המצע מוזרק כדי למדוד את הגידול בנפח גדול וזה אפשר למדוד את חילוף החומרים של גידול, דלקת, אנגיוגנזה, אפופטוזיס, סמנים אחרים באמצעות סמנים ביולוגיים שכותרתו fluorescently19.

בסך הכל באחת הטכניקות הכי שימושי, רב-תכליתי עבור הדמיה ויוו הוא ה MRI. מגבלות קלות של ה MRI ניתן למצוא בזמן הרכישה נמוך, רגישות נמוכה יותר מאשר לחיות מחמד, כמה וריאציות הקשורות לכלי18,20.

כאן, אנו מדווחים השיטה FMT כאמצעי חלופי עבור מודלים של גליובלסטומה פרה. תיוג מראש של התאים היעד עם חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום (איור 1 א'E) וסריקה שלאחר ההשתלה בבעלי חיים immunocompromised יכולה להיות מושגת באמצעות מערכת הדמיה של טומוגרפיה זריחה. דיווחנו השיטה FMT כאמצעי חלופי עבור מודלים של גליובלסטומה פרה. בשיטה זו הדמיה מוחל בצורה נטולת המצע, לא פולשנית, חיות נשמרים בסביבה מתח נמוך, כימות רקמות עמוק וניתן לבצע (איור 2Aאני, איור 3 א, ב'). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד יעילותם של טיפולים קומבינטורית glioma פרה מודלים21, כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשות עבור גידולים במוח16, וכדי לחקור druggable מולקולות מטבולי חדש22, מסלולים epigenetic23, או סוכנים כימותרפיות חדשים בשילוב עם הקרנות (נתונים שלא פורסמו), וחלים עליהם מחקרים פרה אחרים. אנו גם מציעים כאן השימוש של FMT כמו יישום כפול ויוו הדמיה הגישה, כאשר שני קיימים משותף, אבל שונה, אוכלוסיות תאים סרטניים נועדו להיות מנותח.

כמה מגבלות עם FMT חייב להילקח בחשבון, כגון auto-זריחה המופקים בכמה איברים. יכולים להפריע האות. לדוגמה, מאתר את הטחול והכבד פולטים קרינה פלואורסצנטית אוטומטי בערוץ nm 680. אבל לא בעומק 635 ננומטר. לכן, נהלים ניסיוני הקשורות FMT מעורבים איברים אלה חייב להתבצע באמצעות חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום אחרים, כמו FP635. השתמשנו עירום foxn1-מוטציה עכברים בעירום כדי למנוע הפרעה בהקלטה אות זריחה; אם צריך לשמש מודל העכבר שונים, מומלץ לגלח את תחום העניין של בעלי החיים. בנוסף, גישה זו היא גם מוגבלת באיתור ההמונים גידול קטן מאוד. מניסיוננו, משפר יחס אות לרעש כמו הגידול בנפח גדול הופך גדול יותר, עוד לפני תחילת כל סימפטום נוירולוגיות בעכברים. למעשה, בניסויים קודמים שנערכו על PDXs orthotopically מוזרק, היינו מסוגלים לזהות גידולים במהלך משטר הסמים לפחות 2 שבועות אצל עכברים בלי שום סימן. של מצוקה עקב הגידול נטל או סמים המינהל21. בסופו של דבר, התוקפנות של כל שורת תאים, מספר התאים מוזרק יקבע את האורך של כל ניסוי. הנתונים להציג קשר גומלין פרופורציונליים ליניארי בין מספר התאים ושידור (איור 1BE), גידול המוני של אות (איור 2); אבל לא ניתן להחיל על האות כללי מתאם בין הגידול המונית ומספר תאים על פני שורות תאים שונים וחלבונים אינפרא-אדום. האות עבור כל שילוב של חלבון פלואורסצנטי קו/אינפרא אדום תא להיקבע מדעית. יתר על כן, האות המתקבל הניתוח של התאים באמצעות הפאנטום (איור 1B, D) אינו תואם לאות מן xenografts תוך-גולגולתי כמו הנחתה אות מתרחשת עקב הגולגולת של העכבר.

התוכנה imager, מנתח לאפשר קביעת סף. אמנם אנחנו לא השתמש בכל סף כאן, סריקה בעלי חיים ללא תאים מושתל נותן רעש רקע אשר נוטה להיות חוסל על ידי שחזור בנוכחות של אות אמת. מספר גורמים משפיעים על עוצמת האות xenograft ואני חייב להישמר בחשבון: כל חלבון פלואורסצנטי אינפרא-אדום יש ספקטרום פליטה שונים ועוצמה, עם FP720 להיות אחד החלבונים פלורסנט ביותר בשימוש השפעול10 ,11; כל שורה התא מאפשר שופע, עדיין מוגבל, כמות ייצור החלבון, ובכך להשפיע על ידי קרינה פלואורסצנטית המרבי השגה. לבסוף, םלצה FMT ההתקנה עם עקומות תקן פנימי עבור תרכובות ייעודיות, לכן חשוב לקחת בחשבון אילו המתחם יש ספקטרום הפליטה הקרוב ביותר אל החלבון הניאון אינפרא-אדום נהגו לסמן את התאים. למרות נסבלת היטב, מומלץ לקבוע תופעות אפשריות ציטוטוקסיות בתיווכו של ביטוי של חלבונים אינפרא-אדום8,9. יתר על כן, אנו ממליצים להשתמש גדודים של עכברים לפחות 8 לכל קבוצה ניסיונית, כמו אובדן נתונים, עכברים, בשל הליך כירורגי או השתנות ב engraftment תאים סרטן, עלול להתרחש; בכל זאת, זה מוסיף מובהקות סטטיסטית המחקר. אנו ממליצים גם באופן סדרתי סרוק עוקבה בעלי חיים של יותר מיום אחד ולנתח הפליטה האות באותו זמן, מאז וריאציות העומק קלטת הדמיה, שחזור האות פלורסנט עשויים להפריע כימות אות סופית. כדי לפתור בעיה זו, מנתח התוכנה מאפשרת עבור שינויים משניים בעוצמת לייזר (מנורמלי גבוה וגבוה מאוד), למרות מניסיוננו התוצאה הסופית אינה שונה באופן דרמטי. הערה סופית אחת ביחס עלות-תועלת היא כי ניתן לשתף בקלות FMT מערכת הדמיה כמכשיר הליבה בין מעבדות שונות, דבר שעוזר לכסות את עלות רכישה ותחזוקה. לסיכום, FMT הוא משאב יקר שעושה ניסויים פרה הערכות של ויוו הגידול קל ואמין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר פרדריק לאנג, MD Anderson Cancer Center עבור GBM-PDX neurospheres. עבודה זו נתמכה על ידי התבוסה GBM מחקר שיתופי, חברת בת של המוח גידול חברה לאומית (פרנק Furnari), R01-NS080939 (פרנק Furnari), קרן מקדונל ס ג'יימס (פרנק Furnari); חורחה בניטז נתמכה על ידי פרס מן האגודה המוח אמריקאי הגידול (ABTA); קירו Zanca מומן בחלקו על ידי מלגת פוסט-דוקטורט קרן סרטן אמריקאי-איטלקי. פרנק Furnari מקבל משכורת ותמיכה נוספים ממכון לודוויג לחקר הסרטן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18, (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7, (5), 462-477 (2017).
  3. Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33, (22), 2472-2480 (2015).
  4. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  5. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
  6. Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25, (5), 527-533 (2009).
  7. Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. Springer. New York. 97-111 (2017).
  8. Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4, (6), 592-598 (2009).
  9. Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. Humana Press. 1-18 (2014).
  10. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10, (8), 751-754 (2013).
  11. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29, (8), 757-761 (2011).
  12. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1, (1), 241-245 (2006).
  13. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1, (6), 3166-3173 (2007).
  16. Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
  17. Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11, (11), e0165994 (2016).
  18. Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. (2017).
  19. Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358, (6367), (2017).
  20. Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51, (5), 465-478 (2017).
  21. Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31, (12), 1212-1227 (2017).
  22. Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30, (5), 683-693 (2016).
  23. Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60, (2), 307-318 (2015).
קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה <em>In Vivo</em> של גליובלסטומה Xenografts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter