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Cancer Research

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

doi: 10.3791/57448 Published: April 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Abstract

Tumorigenicity는 종양을 형성 하는 암 세포의 기능 대량. 널리 사용 방식은 셀 tumorigenic 확인 암 세포와 immunodeficient 쥐를 피하 주입 되 고 만져 서 후 종양 질량을 측정 하 여. 암 세포의 Orthotopic 주사 가장 밀접 하 게 공부 되 고 종양의 기원의 조직 microenvironment에이 종이 식을 소개 하고자 합니다. 뇌 암 연구의 암 세포는 뇌의 독특한 microenvironment에서 종양 형성과 분석 수 있도록 intracranial 주입을 필요 합니다. Vivo에서 이미징 intracranial xenografts의 즉시 orthotopically engrafted 쥐의 종양 질량을 모니터링합니다. 여기 우리 뇌 종양 xenografts의 형광 분자 단층 (FMT)를 사용 하 여를 보고합니다. 암 세포는 먼저 가까운 적외선 형광 단백질으로 불리고 하 고 immunocompromised 쥐의 뇌에 주입. 동물 다음 시간의 연장된 기간 동안 종양 질량에 대 한 정량적 정보를 검색 합니다. 셀 라벨 미리 각 마우스에서 종양의, 재현성, 비용 효과적이 고 신뢰할 수 있는 정량화 할 수 있습니다. 우리는 이미징 기판, 주입에 대 한 필요성을 제거 하 고 따라서 동물에 스트레스 감소. 이 접근의 제한; 매우 작은 질량을 감지 하는 무 능력에 의해 표시 됩니다. 그러나, 그것은 다른 기술 보다 더 큰 대 중을 위한 더 나은 해결책이 있다. 그것은 약물 치료의 효 험 또는 glioma 셀 라인 및 환자 파생 된 샘플의 유전 변경 평가에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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암은 산업화 된 세계에서 인간에서 질병 관련 된 죽음의 주요 원인 중 하나입니다. 매우 높은 사망자와 새로운 처리는 시급히 필요. 세포종 님 (GBM)는 매우 치명적인 뇌 암, 뇌 종양, 실질, 그리고 면역 세포의 이질적인 인구의 구성 유형의 이다. 미국의 중앙 두뇌 종양 레지스트리 따르면 기본 악성 및 비 악성 뇌종양의 발생률 100000 당 대략 22 경우입니다. 약 11, 000의 새로운 사례는 20171미국에서 진단 되는으로 예상 된다.

전 임상 연구는 마약, 절차, 또는 인 간에 있는 테스트 전에 효과적 치료의 가능성을 조사. 전 임상 연구의 초기 실험실 단계 중 하나는 인간의 종이 식 모델로 정의 호스트 유기 체에 이식 하는 암 세포를 사용 하 여 약물 치료에 대 한 잠재적인 분자 표적 식별 됩니다. 이 컨텍스트에서 intracranial 뇌 종양이 종이 식 모델 환자 파생 xenografts (PDXs)를 사용 하 여 널리 사용 된 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답, 연구와 바이오 마커 개발에 대 한 더 많은 최근 마약 검사, 및 맞춤 의학2,,34.

가장 저렴 하 고 비-침략 적 vivo에서 이미징 intracranial xenografts 모니터링 하는 방법 중 하나입니다 생물 발광 영상 (BLI)5,6,,78. 그러나, 일부 씨 한계는 기판 관리 및 가용성, 효소 안정성, 그리고 가벼운 냉각 및 수집9이미징 동안 비 산을 포함 합니다. 여기 우리는 이미징 방법 전 임상 세포종 모델을 모니터링 하는 대신 적외선 FMT를 보고 합니다. 이 방법, 신호 수집 및 intracranially 이식된 PDXs의 정량화에 표현 한 근 적외선 형광 단백질 iRFP72010,11 (FP720 이제 되 나) 또는 turboFP635 (이제 되 나 FP635), 이미징 시스템 FMT와 함께 수행 됩니다. FMT 기술을 사용 하 여, 종양 수 orthotopic 모니터링 비보 전에, 동안, 또는 치료, 임상 관찰에 대 한 비-침략 적, 기판 및 양적 방식.

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Protocol

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실험적인 연구 동물 lentivirus transduce 암 세포를 같은 전염 성 요원의 활용 기관 동물 관리 프로그램 및 기관 biosafety 위원회에 의해 사전 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 캘리포니아 대학 샌디에고 (UCSD)의 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. FP635 또는 FP720 구문 세포종 세포의 라벨

  1. 생산 및 Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 lentivirus 정화 12
  2. DMEM 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 15 cm 접시; 인간의 glioma 셀 라인에서 문화 약 2.0 x 106 셀 DMEM과 문화 2.0 x 106 인간의 세포종 환자 파생 (GBM-PDX) 분야 또는 F12 B27와 1:1 매체와 인간 재조합 표 피 성장 인자 (EGF, 20 ng/mL) 및 FGF 보완 / (10 ng/mL) T75 플라스 크에.
  3. 모든 셀에서 37 ° C, 5% CO2, 그리고 100% 상대 습도 유지 합니다.
  4. 세포 분열
    1. Glioma 셀:는 상쾌한 접시에서 제거 하 고 glioma 세포를 트립 신 1 X의 3-5 mL를 추가.
    2. GBM 분야: 15 mL 튜브에 세포를 pipetting으로 세포를 수집.
      1. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 실 온에서 5 분 동안 200 x g에 GBM 분야 아래로 회전 합니다.
      2. 제거는 상쾌한 고 세포 분리 솔루션의 3-5 mL를 추가 합니다.
    3. 10-15 분 동안 37 ° C에서 모든 셀을 품 어.
  5. 조심 스럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 세포 분열 (분야 및 glioma 셀 완료 해리) 및 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 여러 번 위아래로 pipetting으로 매체의 5 mL로 세포를 resuspend. Trypan 블루 제외 하 여 세포 생존 능력을 결정 합니다.
  7. 플레이트 1.0 x 106 10 cm 접시에 대상 셀의 pipetting으로 매체의 5 mL와 함께.
  8. 감염 (MOI) Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 5의 다양성에서 형광 단백질을 표현 lentivirus와 셀 transduce 12 고 37 ° c.에 품 어
  9. 24 시간 후 transduced 세포에서 매체를 제거, 신선한 매체의 5 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 추가 48 h에 대 한 품 어
  10. 1.4-1.6 단계에 설명 된 대로 단일 셀 서 스 펜 션에 감염 된 세포를 분리. 5 분 동안 200 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 솔루션을 정렬의 500 µ L에서 resuspend (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 %FBS).
  11. FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱. 공동의 4', 죽은 세포를 제외 하려면 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride 1 µ L/mL로 세포 얼룩. 네거티브 컨트롤 흐름 cytometer 게이츠를 설정 하는 데 필요한 (비 불리고 세포와 세포 transduced 비 DAPI 스테인드 /).
  12. Basu 에 설명 된 대로 솔루션을 정렬에 DAPI 음수가 형광 양성 세포를 정렬 13, 15 mL 원뿔 튜브로 정렬된 셀을 수집.
  13. 5 분 동안 200 x g에서 정렬된 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 문화 매체의 5 mL에 resuspend. 시드 pipetting으로 10 cm 접시에 정렬 된 셀입니다. 적어도 48 72 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  14. 해리 셀 정렬된 셀 확장 단계 1.4-1.6 그리고 vivo에서 실험에 대 한 여러 요리에 도금.
    셀 정렬 준비 및 정화에 대 한 자세한 내용은 참고: Basu 외. 13

2. intracranial 주입 세포종 세포 iRFP 태그의 Immunodeficient 마우스

참고: 시작 하기 전에 수술, 수술 실 및 도구 절차에 대 한 깨끗 한 되어 있는지 확인. Immunodeficient athymic 누드 (Foxn1nu) 남성 또는 여성 쥐, 4-5 주 오래 된과 intracranial 주사에 대 한 17-19 g 사이 사용 합니다. 도착 후 그리고 수술 전에 동물은 적어도 3 일 동안 보관 한다.

  1. 세포 준비
    1. 수확 하 고 형광 긍정적인 glioma 셀 단일 세포 현 탁 액 (1.4-1.6 단계)로 해리 동물 당 주입 당 PBS의 2-5 µ L에서 0.5 또는 1.0 x 106 셀 resuspend. 얼음에 장소와 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱.
  2. 마 취 준비 및 관리
    1. 케 타 민 (100mg/kg) 및 마우스 몸 무게의 20 그램 당 xylazine (10 mg/kg)를 포함 하는 염 분 해결책의 200 µ L를 준비 합니다. 그리고 무게는 동물 마 취의 적절 한 복용량을 계산.
    2. 마 취의 복 주사를 제공 하 고 탈수를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용. 이 단계에 대 한 자세한 내용은 참조 캐슬 린 외. 14 장소 37 ° c.에 미리 데워 진된 물 열 패드에 동물
    3. 그는 동물은 취 발가락 핀치 응답 (페달 반사), 모니터링 하 여 일반적으로 5-10 분 이내 확인 하십시오.
  3. Intracranial 주입
    1. 5 µ L 로드 세포 현 탁 액 및 프로브 홀더에서 마운트 해밀턴 주사기 (바늘 무뚝뚝한 끝).
    2. 작은 동물 정위 적 프레임에 마우스를 놓고 귀 바, Cetin 외. 설명된 내용을 따라 니 어댑터를 사용 하 여 머리를 수정 15
    3. 70% 에탄올과 betadine 솔루션으로 머리를 소독. 있는지 확인 외과 사이트 완료 살 균 합니다. 작은 메스와 중간 절 개를 수행 하 고 피부와 연결 어 조직.
    4. 해밀턴 주사기는 micromanipulator를 사용 하 여 bregma 지점에 놓습니다.
    5. 프로브 홀더 1.0 m m anteroposterior와 2.0 m m 측면 bregma 지점에서 이동 합니다. 이 위치를 연필로 표시 합니다.
    6. 이 위치에서 주의깊게 확인 구멍 두개골에 micromotor 휴대용 드릴 혈관 표시 될 때까지 아래쪽으로 약간의 압력을 적용 하 여. 거미 집 모양의 교 및 뇌 실질을 방해 하지 않습니다.
    7. 버 구멍에 바늘을 소개 하 고 사전 pial 표면 아래 3.0 m m.
    8. 볼륨 (2-5 µ L) 및 유량 (1 µ L/min) 사출 동력된 stereotaxic 인젝터를 사용 하 여 설정 하거나 수동으로 주사를 수행 합니다.
    9. 주입 후 1.0 m 마다 1 분을 오름차순으로 바늘을 점차적으로 제거 하 고 70% 에탄올 주사 사이트를 청소 합니다.
    10. 가까운 피부 상처 수술 스테이플 또는 외과 봉합 (바늘이 라고도 함) 하 여 고 캐슬 린 외. 14 대 한 자세한 내용입니다은.
  4. 동물 복구
    1. 동물 물 열 패드 (37 ° C)에 전송 하 고 전체 복구까지 체온, 호흡 속도 심장 박동을 모니터링. 표준 프로토콜 당 무 통을 관리 합니다.
      참고: 정위 적 절차에 대 한 자세한 내용은, 수술, 그리고 좌표를 참조 다른 보고서5,,1415.

3. FMT 이미징

참고: 실험 목표에 따라 iRFP 태그 세포종 세포 수 모니터링 비보 전에, 하는 동안, 또는 치료 후. 목적, 이미징 동물 isoflurane 유도 챔버를 사용 하 여 anesthetize, 스캔 및 이미지 FMT 영상의 도킹 스테이션에서 동안 이미징 카세트에서 유지.

  1. 감 금 소 및 isoflurane 유도 실에서 장소에서 동물을 제거 합니다. 챔버를 닫고 산소 흐름 및 기화 기 3-5%.
  2. 동물을 모니터링 때까지 그것은 완전히 마 취, 일반적으로 1-2 분 무 의식 내의 동물 해야 응답 하지 외부 자극에.
  3. 약 실에서 마 취 동물을 제거 하 고 동물에에서 넣어 이미징 카세트 헤드 어댑터를 먼저 배치 하 여 아래로 향하게 하는 동물을 배치 하 여 다음. 머리는 카세트의 중앙에 위치 하 고 있는지 확인 합니다.
  4. 상단에 카세트의 상단 접시를 놓고 17 m m까지 조정 노브를 조입니다.
  5. 일단 그 동물 안전에 이미징 카세트, 카세트는 isoflurane 동물 마 취 유지 하 양수는 FMT 영상의 내부 도킹 스테이션에 삽입 하 여 이미지를 진행.
  6. 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭 하 여 영상 및 분석기 소프트웨어를 실행 합니다.
  7. "실험적인 탭" 창에서 "데이터베이스" 및 "연구 그룹"을 선택 합니다.
  8. "스캔 탭" 창에가 고 "제목 선택"을 클릭 하 여 이미지에 주제를 선택 합니다. 또한, "레이저 채널" 패널에 레이저 채널을 선택 합니다. FP635 표시 된 셀에 대 한 "레이저 채널 635 nm"를 선택 하 고 "채널 680 nm 레이저" FP720 표시 된 셀을 선택 합니다.
  9. "스캔 탭" 창에서 "캡처" 옵션을 클릭 하 여 이미지를 취득 합니다. 다음을 클릭 하 고 소스 위치, 일반적으로 동측 측에 대 한 20-25 소스 내에서 수를 결정된을 캡처한 이미지에서 검색 필드를 끌어 검색 필드를 조정 합니다.
  10. "재건 대기열에 추가" 옵션 확인 하 고 "검색 탭" 창에서 "스캔"을 누르십시오.
  11. 스캔 완료 될 때까지 하 고 영상 카세트 도킹 스테이션에서 제거.
  12. 카세트의 상단 플레이트를 제거 하 고 감 금 소 동물 다시 넣습니다.
  13. 동물의 나머지 부분에 대 한 3.1 3.12 단계를 반복 합니다.

4. 이미지 분석

  1. 영상 및 분석기 소프트웨어에서 "분석 탭" 창을 선택 합니다.
  2. 데이터 집합의 "분석 탭" 창 "데이터 집합 선택" 패널에서 "+" 버튼을 클릭 하 여 분석을 로드 합니다.
  3. 이미지 "분석 탭" 창에서 로드 되 면 "분석 탭" 윈도우의 왼쪽된 상단에 있는 둥글지 아이콘을 선택 하 여 관심 (ROI) 분석의 영역을 수행 합니다.
  4. 오른쪽 "분석 탭" 창에서 "임계값" 열을 클릭 하 여 "통계 데이터" 패널에서 0 임계값을 조정 합니다.
  5. "통계 데이터" 패널의 총 가치는 쥐의 뇌에 이식 하는 형광 태그 세포종 세포에서 신호를 나타냅니다.
  6. 동물의 나머지 부분에 대 한 4.2-4.4 단계를 반복 합니다. 로드 하거나 클릭 하 여 새로운 주제를 제거는 "+" 또는 "−" 버튼, "분석 탭" 창의 "데이터 집합 선택" 패널에 각각.
    : FMT 이미징 및 소프트웨어 동작에 대 한 자세한 내용은 참고20.

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Representative Results

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세포종 세포 U87EGFRvIII (U87 셀-EGF 수용 체 변형 III 표현) 1.2 단계에 따라 경작 했다. Lentivirus 생산과 단계 1.1에 따라 정화 했다. 바이러스 농도 p24에 의해 결정 되었다 ELISA 분석. 셀은 lentivirus 단계 1.8에 따르면 적외선 형광 단백질을 운반으로 불리고 있었다. FP72010,11 인코딩 플라스 미드 박사 V.V. Verkhusha에서 제공한 친절 하 게 그리고 FP635 벡터 상업용 공급 업체에서 구입한. 대상 셀 FACS 상위 10% 형광 세포 인구 (그림 1A)에 대 한 풍부 하 게 정렬 했다. 형광 신호를 증가 형광 단층 촬영 시스템의 감도 향상 시킵니다. Orthotopic 이식 전에 붙일 라는 세포의 신호 강도 확인 하기 위해 우리 FMT 영상의 유령 카세트를 사용 합니다. 특히, U87EGFRvIII-TurboFP635 및 U87EGFRvIII iRFP720 셀 트립 신, 및 1 x 105, 1 x 106, 해리 했다 그리고 1 x 107 셀 얼음 차가운 PBS의 100 µ L에 각각 resuspended 분석 했다. FMT 영상 검출에 4 채널 수: 635 nm, 680 nm, 750 nm, 그리고 780 nm. 먼 적외선 채널 750 nm와 780 nm 근처-적외선 형광 단백질 사용 (데이터 표시 되지 않음)에서 같은 파장에서 아무 방출 때문에이 분석에 적합 하지 않습니다. 따라서, 우리는 635에서 방출 신호 분석 및 680 nm. 그림 1에서 보고는 형광 신호 모두 FP635에 대 한 이미지와 강도 정량화 (그림 1B, C) 및 FP720 (그림 1D, E), 셀 숫자 증가 함에 따라 비례적으로 증가. 메모의, FP635에 대 한 방출은 표시 680 nm 채널에만 635 nm 채널. FP720에 대 한 방출 표시 됩니다 반면, 635 nm 채널에만 680 nm 채널. 그러면이 두 후보 형광 단백질 연구 세포의 2 개의 인구에 표시 될 수 있습니다 하 고 동시에 적외선 형광 라벨 근처 2을 사용 하 여 모니터링에 적합.

U87EGFRvIII 셀 적외선 형광 단백질 근처 표시 orthotopic 주입 그리고 vivo에서 종양 성장 모니터링 사용 했다에 설명 된 대로 단계 2.1-2.4. 우리 다른 암 세포 유형 사이의 종양 성장 차이 제외 하는 같은 셀 라인, , U87EGFRvIII, 다른 형광 태그로 표시 된 사용. 쥐는 U87EGFRvIII TurboFP635 셀, U87EGFRvIII-iRFP720 셀 또는 2 셀 라인의 동일한 조합 (1:1)와 함께 주입 했다. PBS의 5 µ L 볼륨에서 5 x 105 셀의 총 4-5 주에 intracranially 오래 된 immunocompromised athymic 누드 마우스 정위 적 시스템과 다음 단계 2.3-2.4 해밀턴 주사기를 사용 하 여 주입 했다. 마 취는 마 취 제/xylazine의 복 주입에 의해 달성 되었다. 동물 물 열 패드를 사용 하 여 주입을 통해 따뜻한 보관 하 고 고통의 어떤 표시 든 지에 대 한 확인 했다. 종양 engraftment 및 성장 했다 다음 이미징 시스템 FMT에 의해 모니터링 됩니다. 검색 세션 동안 쥐 3 %isoflurane 챔버 (3.1-3.12 단계)를 사용 하 여 일시적으로 취 했다. 쥐 다음 이미징 카세트에 배치 되었고 레이저 스캔 카메라 내부 이미지. 각 마우스는 635를 사용 하 여 검색 및 680 nm 채널. 신호 부 량 시간이 지남에 기록 했다 그리고 마우스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 신경학 상 증 후의 개시에서 안락사 되었다. 그림 2A에 표시 된 대로 U87EGFRvIII TurboFP635 방출 신호 635 nm 채널에서 분명 고 최소한의 배경 신호 680 nm 채널 (그림 2B, C)에 기록 되었다. 에 대비, U87EGFRvIII-iRFP720 셀 635 nm 채널 (그림 2D-F)에 약간의 배경을 보여주는 680 nm 채널에서 내보냅니다. 마지막으로, U87EGFRvIII TurboFP635 세포와 U87EGFRvIII iRFP720 세포의 1:1 믹스와 함께 주입 하는 쥐 두 채널에서 (그림 2G-) 실험의 기간에 대 한 증가 신호를 보여주었다. 이러한 데이터는 암 세포 인구의 듀얼 vivo에서 이미징 적외선 형광 단백질을 활용 가능 하다는 것을 보여준다. 데이터는 또한 다른 형광 단백질 그들의 신호 방출에는 다른 강도가지고 나타냅니다. 여기, FP720 신호 강도 FP635, 암 세포의 작은 인구를 검출 하는 비-침략 적 모니터링 설정에서에서 감도 증가 함께 뛰어난 했다.

전 임상 모델에서 tumorigenicity에 암 관련 유전자의 유전자 침묵의 효과이 프로토콜 연구를 하실 수 있습니다. 이 목표를 위해 GBM-분야 (GSC23 및 GSC11) 교양된 (1.2 단계) 그리고 FP720-lentivirus (단계 1.8)으로 불리고. FP720을 표현 하는 셀 FACS 1.11-1.13 단계에서 설명한 대로 정렬 했다. FP720 레이블 셀 공동 transduced lentivirus 인코딩 shRNA DAXX (shDaxx,) 또는 나 516shRNA 제어 (shLuc)을 대상으로 했다. 셀 5 일 동안 배양 했다 단일 셀 서 스 펜 션으로 해리 그리고 1 x 106 세포 intracranial 주입에 대 한 PBS의 3 µ L에서 resuspended 했다. ShRNA DAXX 타겟팅의 효능 반전 녹음 방송 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) GSC23에 의해 확인 되었다 (그림 3A)와 GSC11 (그림 3C). GBM-iRFP720/shRNA 셀 stereotactically 단계 2.3-2.4에 따라 immunodeficient 쥐가 주입 했다. 동물 신경 징후에 대 한 관찰 했다 하 고는 xenografts의 상대 형광 신호 단계 3.1 4.6에 따라 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 FMT 이미징 시스템에 의해 분석 되었다. FMT의 대표 이미지 shDAXX/GBM-구체 shControl를 이식 하는 동물에 비해와 engrafted 생쥐에서 감소 형광 신호를 표시 (그림 3B 그림 2D) 확인 두 GBM 분야 모델에 대 한 우리의 이전 찾기16 DAXX 억제 임상 세포종 모델에서 종양 성장 누르는.

Figure 1
그림 1: 팬텀 및 FACS 분석에 대 한 셀을 사용 하 여 표준 곡선. (A) 대표 FACS 히스토그램의 FP720-및 FP635-U87EGFRvIII 셀 (왼쪽 및 오른쪽 패널, 각각)를 표현 적외선 형광 단백질을 인코딩 lentivirus glioma 세포 감염 되었습니다 및 FASC FP720 또는 FP635 단백질의 가장 높은 표현을 위한 풍부 하 게 정렬. 대표 이미지 획득 U87EGFRvIII-TurboFP635 (B)와 U87EGFRvIII-iRFP720 (D)의 영상 및 분석기 소프트웨어 가상 카세트를 사용 하 여 셀 정지 상위 패널 680 nm 채널에 635 nm 채널 및 아래쪽 패널에 신호를 나타냅니다. 셀에 증가 수 신호 시각화 증가에 대응 했다. 신호 부 량 (C) U87EGFRvIII-TurboFP635 U87EGFRvIII-iRFP720 (E)의 세포 635 nm 및 680 nm 채널. 상대 형광 단위 색상 막대에 표시 됩니다. 오차 막대 세포 현 탁 액 당 3 다른 검사에서 S.E.M.를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 뇌 종양이 종이 식 모델 U87EGFRvIII를 사용 하 여 셀에 스캔 한 다른 채널. 635에서 형광 신호의 대표 이미지 및 intracranially U87EGFRvIII-turboFP635 (A), (D), U87EGFRvIII-iRFP720와 U87EGFRvIII-iRFP720의 혼합 조합 (1:1) 이식 동물에서 680 nm 채널: U87EGFRvIII-turboFP635 셀 (G). 이미지는 첫 번째 검색 후 5 일에 인수 했다. (B, E, H) 신호 강도 5 일의 기간 동안 각 마우스에 대 한 모니터링. 각 마우스 635 nm 채널 (파란색 막대)와 635 nm 채널 (빨간색 막대) 스캔 했다. 막대의 가장 가벼운 그늘 컬러 스캐닝과 어두운 그늘의 1 일 날 5 나타냅니다 나타냅니다. (C, F, I) (파란색) 635 nm 채널에서 신호 강도 대 한 직접적인 비교를 보여주는 상대 형광 정량화 그리고 680 nm 채널 마우스의 전체 일대에 (빨간색). 상대 형광 단위 색상 막대에 표시 됩니다. 데이터는 3 다른 동물에서 표준 편차와 함께 평균 값을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 전 임상 세포종에 입을 유전자 모델 FMT를 사용 하 여. GSC23에서 실시간 정량 Pcr에 의해 DAXX 의 유전자 표정 분석 (A) 및 GSC11 제어 (shLuc) 및 FP720 (C) glioma 환자 파생 셀 lentivirus 인코딩된 shRNAs DAXX (shDaxx) 또는 shRNA 타겟팅으로 불리고. Orthotopically의 680 nm 채널에서 형광 신호의 대표 이미지 engrafted GSC23-iRFP720 (B)와 GSC11-iRFP720 (D) 환자에서 파생 된 세포 이식 쥐. 강한 형광 신호는 shRNA DAXX (shDaxx) (패널의 하단 부분), 이식 마우스에 비해 shRNA 제어 (shLuc) (패널의 상단 부분)를 이식 하는 동물에서 관찰 DAXX 저해 종양 억제를 나타내는 전 임상 glioma 모델 형광 분자 단층에 의해 결정에서 성장. 상대 형광 단위 색상 막대에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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종양 xenografts 암 연구에 광범위 하 게 사용 되 고 다양 한 잘 설립 된 이미징 기술 개발 되었습니다: 라스; 자기 공명 영상 (MRI); 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 계산 된 단층 촬영 (CT); FMT입니다. 각이 방법 마다 장점과 단점을 함께 제공 하지만 궁극적으로 제공 하는 정보의 종류와 서로 보완. 가장 일반적으로 사용 되는 vivo에서 이미징 기술 중 하나입니다 씨5,6,,78. 라스 및 FMT 두 세포 공학 (luciferase 효소 또는 적외선 형광 단백질) 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 필요 합니다. 씨는 더 작은 종양 질량에 대 한 민감한 하지만 최대 배포 10-12 분;에 신체에 도달 하는 기판 (소)의 복 주입 필요 하지만 가벼운 냉각 및 수집, 이미징 동안 산란 그리고 기판 클리어런스 자주 발생 하는9. FMT, 대신, 동물에 어떤 추가 기판 관리를 필요로 하지 않습니다 그리고 그 신호는 안정적이 고 시간이 나 효소 안정성의 독립. 또한, FMT, 같은 실험 조건에서 사용 될 때 재현할 수 반 정량적 데이터를 제공 합니다. 라스 및 FMT 공간적 해상도;를 제공 하지 않습니다. 그러나, 커플링이 방법을 CT 스캔 주소와 함께이 문제.

A CT 검사 측정 광자의 감쇠 신호 교차 동물의 몸 하 고 이상적인 신체 구조를 식별 합니다. 그러나, 부드러운 조직 대비, 작은 intracranial 종양의 검출을 방해할 수 있습니다,이 방법은17,18에 대 한 제한 사항입니다. 한 추가적인 CT의 단점은 방사선 및 대상 세포에 있는 분자 변화를 일으킬 수 대비 미디어의 사용입니다. A CT 검사는 포도 당 아날로그, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; 같은 방사선된 추적기를 사용 하 여 애완 동물 결합 될 수 있다 하지만이 또한 작은 동물의 생리 적 일부 프로세스를 방해할 수 있습니다. 반면, FMT 종양을 측정 하기 위해 모든 삽입 된 기판 필요 하지 않습니다 질량과 그것 종양 물질 대사, 염증, angiogenesis, apoptosis, 및 붙일 레이블된 biomarkers19를 사용 하 여 다른 표식 측정 가능 하다.

전반적인 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 가장 유용 하 고 다양 한 방법 중 하나는 MRI입니다. MRI의 사소한 제한 낮은 수집 시간, 애완 동물, 보다 낮은 감도 일부 악기 관련 유사18,20에서 찾을 수 있습니다.

여기, 우리는 전 임상 세포종 모델에 대 한 대체 방법으로 FMT 메서드를 보고합니다. 미리 적외선 형광 성 단백질 (그림 1A-E) 대상 셀의 라벨 및 스캔 후 이식 immunocompromised 동물에 형광 단층 촬영 이미징 시스템으로 구현할 수 있습니다. FMT 메서드는 전 임상 세포종 모델에 대 한 대체 방법으로는 보도 했다. 이 방법으로 이미징 기판 및 비-침략 적 방식 적용, 동물 낮은 스트레스 환경에 보관 됩니다 및 깊은 조직 정량화 될 수 있다 (그림 2A-, 그림 3A, B)을 수행. 이 프로토콜16뇌 종양 대 한 새로운 치료 목표를 식별 하 고 새로운 druggable 신진 대사 분자22, 조사를 전 임상 glioma 모델21, 조합 치료의 효능을 연구에 적용 될 수 있습니다. 후 경로23또는 방사선 (되지 않은 데이터)와 함께에서 새로운 화학요법 에이전트 및 다른 전 임상 연구에 적용. 우리 또한 사용 여기 제안는 듀얼 vivo에서 이미징 접근으로 FMT의 두 개 공존, 서로 다른, 하지만 종양 세포 인구는 의미 분석.

FMT와 함께 몇 가지 제한이 자동 형광 신호를 방해할 수 있는 일부 기관에서 생성 된 같은 고려 사항으로 촬영 해야 합니다. 예를 들어 murine 비장 및 간 방출 자동-형광 680 nm 채널에만 635에 nm. 따라서, FMT 관련 실험 절차 이러한 장기와 관련 된 FP635 같은 다른 적외선 형광 단백질을 사용 하 여 수행 되어야 합니다. 우리가 사용 하는 누드 foxn1-형광 신호 기록;에 간섭을 유발 하지 않도록 누드 마우스 돌연변이 다른 마우스 모델을 사용 해야 하는 경우 동물의 관심 영역을 면도 하는 것이 좋습니다. 또한,이 방법은 또한 검출 하는 매우 작은 종양 질량에서 제한 됩니다. 우리의 경험에서는, 신호 대 잡음 비율 향상 종양으로 질량은 더 큰, 아직 생쥐에서 어떤 신경 증상의 발병 하기 전에. 사실, 주입 orthotopically PDXs에 이전 실험에서 우리 종양 부담 또는 약물 관리21인 고통의 흔적 없이 마우스에 적어도 2 주 동안 약을 처방 하는 동안 종양을 감지할 수 있었다. 궁극적으로, 각 셀의 행 및 삽입 된 셀의 수의 공격 각 실험의 길이 결정 합니다. 데이터 보기는 선형 비례 신호 (그림 1B-E), 및 세포의 수와 관계 종양 질량 및 신호 (그림 2); 하지만 다른 세포 선 및 적외선 단백질 종양 질량 및 셀의 숫자 사이 일반적인 신호 상관 관계를 적용할 수 없습니다. 각 셀 라인/적외선 형광 단백질 조합에 대 한 신호는 실험적으로 결정 되어야 합니다. 또한, 팬텀 (그림 1B, D)를 사용 하 여 셀의 분석에서 얻은 신호 일치 하지 않습니다 신호에 intracranial xenografts에서 신호에서 감쇄는 마우스의 두개골으로 인해 발생.

영상 및 분석기 소프트웨어 임계 처리 하실 수 있습니다. 비록 우리가 여기 어떤 임계값을 사용 하지 않은, 배경 잡음의 진정한 신호 존재에 개조에 의해 삭제 될 하는 경향이 제공 어떤 이식된 세포 없이 동물을 검색 합니다. 몇 가지는 종이 식의 신호 강도 영향을 미칠 요인과 고려에 보관 해야 합니다: 각 적외선 형광 단백질은 다른 방출 스펙트럼과 강도, FP720와 실험적으로 사용 되는 형광 단백질10 중 하나 되 고 ,11; 각 셀 라인 따라서 최대 형광을 얻을 수에 영향을 미치는 단백질 생산의 풍부한, 아직 제한, 금액에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, FMT 영상 특정 화합물에 대 한 내부 표준 곡선으로 설치, 따라서, 그것은 어떤 화합물은 가장 가까운 방출 스펙트럼을 고려 하는 중요 한 셀 레이블을 사용 하는 적외선 형광 단백질을. 잘 용납, 비록 적외선 단백질8,9의 overexpression에 의해 중재 잠재적인 세포 독성 효과 결정 하는 것이 좋습니다. 또한,이 좋습니다 실험적인 그룹 당 적어도 8의 쥐의 동료를 사용 하 여 데이터와 마우스, 수술 또는 암 세포 engraftment 다양성의 손실 될 수 있습니다; 그럼에도 불구 하 고,이 연구에 통계적 의미를 추가합니다. 또한 순차적으로 1 일 이상에 대 한 동물 코 호트를 검사 하 고 영상 카세트 깊이 변화 이후 동시에 신호 방출 분석 하는 것이 좋습니다 하 고 형광 신호 재건 최종 신호 정량화를 방해할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 분석기 소프트웨어 수 있습니다 사소한 변화에 대 한 레이저 강도 (에서 높은 하 고 매우 높은 정상), 우리의 경험에의 하면 최종 결과 극적으로 다른. 비용 효율성에 관한 한 마지막 참고는 이미징 시스템 FMT 쉽게 하는 데 도움이 그것의 구입 및 유지 보수 비용 부담 다른 실험실 중 핵심 계기로 공유할 수 있습니다. 결론적으로는 FMT 간단 하 고 신뢰할 수 있는 종양 성장 vivo에서 의 실험 및 전 임상 평가 만드는 귀중 한 자원 이다.

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Disclosures

저자 관심 없음 충돌 선언합니다.

Acknowledgments

우리 닥터 프레드릭 랭, 메릴랜드 앤더슨 암 센터를 GBM PDX neurospheres에 대 한 감사합니다. 이 작품은 패배 GBM 연구 협력, 국가 뇌 종양 학회 (프랭크 나리), R01-NS080939 (프랭크 나리), 제임스 미 맥도 넬 재단 (프랭크 나리);의 자회사에 의해 지원 되었다 호르헤 베 니 테 스는 수상에서에 미국 뇌 종양 협회 (ABTA);에 의해 지원 되었다 Ciro Zanca 미국-이탈리아어 암 재단 박사 후 연구 친교에 의해 부분적으로 지원 되었다. 프랭크 푸 르 나리 암 연구에 대 한 루드비히 연구소에서 추가 지원과 급여를 받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

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References

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<em>Vivo에서</em> 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영
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Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

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