Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.
Abstract
Exosomes, um tipo de nanovesicle liberado de todos os tipos de células, pode ser isolado de qualquer fluido corporal. O conteúdo de exosomes, incluindo proteínas e RNAs, é exclusivo para as células do qual eles são derivados e podem ser usados como indicadores de doença. Vários protocolos comuns de enriquecimento, incluindo ultracentrifugação, rendem exosomes carregado com contaminantes de proteína solúvel. Especificamente, nós encontramos que as proteínas mais abundantes no sangue muitas vezes co purificam com exosomes e podem confundir a jusante proteomic estudos, frustrar a identificação dos candidatos de biomarcador de baixa abundância. De preocupação adicional é a reprodutibilidade de quantificação de proteína exossomo devido inconsistente representação dos níveis de proteína não-exosomal. O protocolo detalhado aqui foi desenvolvido para remover as proteínas não-exosomal que purificam co juntamente com exosomes, adicionando o rigor do processo de purificação do exossomo. Cinco métodos foram comparados usando emparelhado plasma de sangue e soro de cinco doadores. Usando nanopartículas, acompanhamento, análise e ensaio de ácido da proteína de bicinchoninic micro a análise revelou que um protocolo combinado utilizando cromatografia de exclusão de ultrafiltração e tamanho rendeu o enriquecimento de vesículas ideal e remoção de proteína solúvel. Mancha ocidental foi utilizado para verificar que as proteínas do sangue abundante esperado, incluindo albumina e apolipoproteínas, foram esgotadas.
Introduction
Exosomes são nanovesicles (variando em tamanho de 30 nm a 150 nm) lançado por quase todas as células no corpo humano facilitar a comunicação célula a célula processa1,2. Curiosamente, a composição do exosomes muda dependendo das células de origem, bem como o estado de saúde do indivíduo3,4,5. Além disso, exosomes pode ser obtido em vários fluidos biológicos tais como: saliva, urina e de sangue2. Devido estas características, exosomes são considerados para ser uma boa fonte de biomarcadores da doença. Infelizmente, não há nenhum método padrão para a isolação de exosomes. Alguns laboratórios consideram centrifugação várias etapas, com uma etapa final de alta velocidade a 100.000 x g usando gradientes de densidade, como o método padrão-ouro para exossomo isolamento. No entanto, estudos recentes têm mostrado que ultracentrifugação induz agregação de exosomes com proteínas solúveis e outras exosomes, além de afetar a integridade do exossomo, ambos os quais podem dificultar a aplicações a jusante6,7 . Outros métodos comuns de isolamento do exossomo incluem, mas não estão limitados a: precipitação por comercial polietileno glicol (PEG) com base em reagentes, ultrafiltração centrífuga e cromatografia de exclusão-tamanho (SEC). Os reagentes comerciais usando polímeros de polietileno glicol (PEG) enriquecem exosomes, causando-lhes para precipitar e formar um pellet. Limitações de utilização deste polímero são contaminação residual polímero PEG e uma abundância de proteínas solúveis não-exosomal no produto final. Ultrafiltração utiliza centrifugação para purificar e concentrar-se vesículas usando uma membrana de celulose; exosomes são mantidos acima do filtro, enquanto as impurezas menores e outras proteínas atravessam a membrana7,8. Assim como outros métodos, ultrafiltração centrífuga tem uma capacidade limitada para purificar exosomes devido a manutenção de altos níveis de proteínas não-exosomal, incluindo agregados e complexos da proteína. Finalmente, purificação SEC usa resina porosa para separar moléculas por tamanho. SEC tem mostrado resultados promissores, superando a maioria dos problemas experientes com outros métodos, capturando a maioria das proteínas contaminantes e preservando a integridade exosomal, desde que o isolamento é baseado na gravidade ou sistemas de baixa pressão7, 9. No entanto, o isolamento co de proteínas maiores agregados e lipoproteínas10 durante o SEC afeta a pureza da preparação final exossomo. Enquanto alguns métodos foram testados para a purificação do exossomo de sobrenadantes de cultura de células e plasma7ou apenas plasma9,11, não há nenhuma informação sobre o desempenho dos métodos diretamente comparando o sangue plasma e soro do mesmo indivíduo.
Aqui, focalizamos a purificação do sangue exosomes, comparando uma variedade de fluxos de trabalho para determinar se as técnicas de enriquecimento de vesículas são traduzíveis entre plasma e soro. Nanopartículas, acompanhamento, análise e borrão ocidental foram usadas para quantificar as diferenças na composição de concentração, a pureza e a proteína exossomo em produtos finais. O método final, detalhado no presente protocolo, aumenta o número de vesículas e reduz os níveis de proteína não-exosomal. Importante, uma redução drástica das proteínas co precipitantes comuns, incluindo albumina e apolipoproteínas é demonstrada. A abundância destas duas proteínas no sangue e a frequência em que eles co purificam com exosomes causas inconsistências entre as amostras "purificadas", desviando as análises a jusante. Este protocolo inclui o uso de uma resina SEC comercialmente disponível; a resina é composta de grânulos porosos em que proteínas menores que 700 kDa podem inserir os grânulos. Uma vez dentro, as proteínas são retidas por um ligante de octylamine. O eluato é composto de exosomes e moléculas maiores que 700 kDa12. Além disso, a fim de reduzir a proteína agregados e apolipoproteínas que evade armadilhas do grânulo, incluímos um protease digestão passo do fluxo de trabalho. Atualmente, não existe única técnica capaz de maximizar o rendimento do exossomo reduzindo co purificação proteínas não-exosomal. Este estudo mostra que um protocolo de purificação que combina um pré-tratamento de digestão de protease com vários métodos de purificação e recuperação pode ser usado para aumentar o rendimento do exossomo e pureza de sangue soro e plasma.
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Protocol
Este trabalho foi determinado a não ser sujeito humano pesquisa sobre revisão inicial da Colorado State University institucional Review Board (IRB), como todas as amostras humanas foram obtidas como amostras de identificados da biorepositórios Bioreclamation IVT e foram recolhidos no âmbito de protocolos IRB aprovado.
1. preparação da amostra bruta (Plasma ou soro) por vesículas maior granulação e restos celulares
Nota: Consideração de segurança: plasma, soro e outros fluidos biológicos são materiais de risco biológico e devem ser manuseados com cuidado especial, enquanto usava o equipamento de protecção pessoal básico, incluindo luvas e jaleco. É altamente recomendável que as amostras biológicas são processadas em uma biossegurança do armário; Se não disponível, o uso de óculos de proteção é recomendado.
- Equilibrar um soro ou uma amostra de plasma, colocando o tubo sob condições não-tremendo em um frigorífico de 4 ° C durante a noite (de qualquer -20 ou armazenamento-80 ° C).
- Alíquota de 250 µ l da amostra em um tubo de microcentrifugadora usando uma pipeta de 1.000 µ l.
- Centrifugar a amostra a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
- Utilizando uma pipeta de 200 µ l, remover 200 µ l do sobrenadante apurado e adicioná-lo para um novo tubo de microcentrifugadora. Evite qualquer material granulado ao transferir o sobrenadante. Descarte o material granulado.
- Quantificar o teor de proteína da amostra por ensaio de bicinchoninic ácido (BCA), usando o protocolo do fabricante. Para realizar o ensaio, dilua a amostra 01:50 em 1 x tampão fosfato salino (PBS). Teste cada amostra em duplicado.
Nota: Use 1X PBS em todo o protocolo, salvo indicação em contrário. Em média, 200 µ l de esclareceu soro ou plasma (depois de 18.000 x g) irá produzir 15 mg de proteína total. Outros tipos de amostra, com teor de proteínas inferior ou superior, podem exigir diluições adicionais do BCA. - Alíquota 10 mg da amostra em um tubo de microcentrifugadora novo. Use a concentração obtida na etapa 1.5 para calcular o volume correspondente da amostra. Alíquota da amostra com uma pipeta de 200 µ l.
Nota: Recomenda-se armazenar a amostra restante a-80 ° C. Alíquota da amostra em diferentes tubos de 10 mg por tubo para evitar o congelamento-descongelamento múltiplos ciclos no futuro usar.
2. digestão de proteínas do sangue não-exosomal
Nota: A etapa de digestão é projetada para reduzir as proteínas não-exosomal que co podem purificar com exosomes. Se a preservação das proteínas de superfície exossomo é necessária para as análises a jusante, isso deve ser levado em consideração que essa etapa tem o potencial de interferir com esta análise. A detecção do exosomal CD63, uma proteína de superfície exposta tetraspaninas, não foi significativamente negativamente impactada por este processo.
- Prepare a solução de proteinase K em uma concentração de 500 µ g/mL de PBS. Adicione a quantidade correspondente de proteinase K em um tubo cônico. Em seguida, adicione o buffer e o vórtice por 30 s, 3x à temperatura ambiente.
- Adicionar 50 µ l de solução de proteinase K, à alíquota de amostra de 10 mg e misture suavemente pipetando acima e para baixo usando uma pipeta de 200 µ l.
- Incubar a amostra a 37 ° C em banho-maria por 30 min. lugar o tubo em uma cremalheira do tubo do flutuador e evitar a imersão completa do tubo no banho para evitar possíveis fugas.
- Transferir a amostra e suporte flutuante para um banho de água 60 ° C durante 10 min, para inactivar a proteinase K.
3. remoção de pequenas proteínas e peptídeos por ultrafiltração centrífuga
- Enxágue com um dispositivo de ultrafiltração contendo 100 kDa filtro de corte (MWCO) de peso molecular com prévio de PBS para usar. Faça isso adicionando-se 500 µ l de PBS para o filtro, usando uma pipeta de 1.000 µ l. Gire o dispositivo a 3.700 x g por 5 min. Descarte qualquer retentate restante, bem como o eluato.
Nota: A capacidade de volume de amostra do dispositivo ultrafiltração deve ser 0,5 mL - 4 mL para assegurar que o volume final de amostra reduzida de 50 µ l é alcançável. - Tomar a amostra do passo 2.4 e aumentar o volume de 500 µ l, adicionando PBS. Pipete a amostra para o dispositivo de ultrafiltração previamente enxaguado.
Nota: Em média, o volume de amostra da etapa 2.4 é 185 µ l (120 a 150 µ l de amostra e 50 µ l de solução de proteinase K). - Coloque o dispositivo de ultrafiltração em uma centrífuga de bancada de ângulo fixo a 3.700 x g a 4 ° C até que a amostra tem reduzir a um volume de 50 µ l.
Atenção: Quando utilizar dispositivos de ultrafiltração com capim pela raiz volume, deve ter cuidado para evitar a secura completa da membrana filtro durante as etapas de centrifugação. - Adicione 500 µ l de PBS directamente para o filtro de membrana e a pipeta e descer 5 vezes. Centrifugue a etapa 3.3. Execute esta etapa de lavagem, um total de 3 vezes.
- Transferi o retentate final 50 µ l em um tubo de microcentrifugadora novo.
- Lavar o filtro de membrana com 200 µ l de PBS, pipetagem acima e para baixo 10 vezes e transferir a lavagem ao tubo de passo 3.5.
- Coloque o suporte do filtro na posição inversa em um tubo novo. Execute uma recuperação de rotação inversa por 5 min a x 2.000 g para recuperar a amostra restante da membrana. A amostra com a amostra da etapa 3.5 de piscina.
4. purificação das vesículas por cromatografia de exclusão (SEC)
- Adicione 850 µ l de chorume SEC, com grânulos tendo um MWCO de 700 kDa, em uma coluna de fluxo de gravidade vazio, tampado com uma pipeta de 1.000 µ l. Coloque as colunas em um tamanho apropriada cremalheira equipada com uma bandeja de gotejamento.
- Destampe a parte inferior da coluna e deixar que o líquido Escorra por 5 min. Uma vez drenado, adicione 10 mL de PBS para lavar a resina. Permitir que 20 min. para a lavagem escorrer da coluna.
- Coloque o concentrado, proteinase K tratada amostra da etapa 3.5 em um tubo cônico de 15 mL e aumentar o volume da amostra de 5 mL, adicionando PBS com uma pipeta sorológica. Misture o tubo delicadamente agite-o por 1 min e em seguida, aplicar lentamente a amostra para a coluna preparada na etapa 4.2 com uma pipeta sorológica.
Nota: Depois de remover a tampa da coluna, a amostra fluirá através da resina por gravidade; a amostra de 5 mL completamente fluirá através da coluna em 10 min. - Colete o fluxo através de um novo tubo cônico de 15 mL.
- Usando uma pipeta sorológica, aplica o material coletado para a resina novamente para remover qualquer material restante abaixo de 700 kDa.
- Colete o fluxo através de um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a resina duas vezes, adicionando 1 mL de PBS. Coletar o fluxo através do tubo da etapa 4.5; o volume total final será de aproximadamente 7 mL.
Nota: Após a etapa 4.6, a amostra será diluída cerca de 35 vezes do volume da amostra original; as etapas a seguir irão reduzir o volume e concentrar a amostra exossomo purificado.
5. concentração de Exosomes purificado e quantificação de proteínas totais
- Lave um dispositivo de ultrafiltração com um filtro MWCO 3 kDa com antes da PBS utilização, conforme descrito na etapa 3.1.
- Adicionar a amostra da etapa 4.6 para o dispositivo de ultrafiltração e centrífuga em um rotor de balde balançando a 3.700 x g a 4 ° C. Buffer passará através do filtro e pode ser descartada. Exosomes concentrado será retida acima do filtro. Centrifugar a amostra até o volume acima do filtro (retentate) é reduzido a 200 µ l.
- Transferi o retentate para um novo tubo de microcentrifugadora.
- Lave o filtro de membrana com 200 µ l de PBS pipetando sobre a membrana 10 vezes e a lavagem de transferência ao tubo da etapa 5.3. Isto permitirá a coleção de qualquer amostra exossomo residual.
- Traga o volume até 500 µ l de amostra adicionando PBS. Misture lentamente pipetando acima e para baixo 10 vezes.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras devem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite ou a-20-80 ° C para armazenamento a longo prazo. - Quantificar o teor de proteína da amostra por meio de ensaio BCA, usando o protocolo do fabricante. Dilua a amostra 01:10 e 01:50 em PBS. Execute cada amostra em duplicado.
Nota: Começando com 10 mg de proteína total do soro ou plasma, o rendimento de proteína total em exosomes purificado da etapa 5.6 é, em média, 150 µ g. diluições adicionais podem ser necessárias se amostras diferente de soro ou plasma são usadas; rendimento pode variar com o tipo de amostra.
6. quantificação e dimensionamento de Exosomes por nanopartículas acompanhamento análise (NTA)
- Adicionar 5 µ g de exosomes purificado (conforme quantificada em 5.6) a 1 mL de PBS e vórtice por 15 s na baixa e média velocidade.
- Coloca a amostra em uma seringa descartável 1 mL. Se disponível, defina a seringa em uma bomba de seringa automática definida para injetar a amostra diluída exossomo a uma taxa de 30 µ l/min.
- Realizar medições de NTA usando as configurações de captura de vídeo: tela com ganho de nível 3-4 e câmera de 12-13.
- Definir o roteiro de análise executar três repetições técnicas por um período mínimo de 30 s usando um fluxo constante para cada replicar. Para a análise, defina o limite de captura em 5.
Nota: Detalhes sobre a utilização da seringa automática e configurações de captura de vídeo estão disponíveis na referência13. Configurações de captura e análise de NTA devem ser consistentes através de diferentes amostras, para assegurar a comparabilidade.
7. determinação da redução de proteína solúvel
- Adicionar 1-10 µ g de exosomes purificado de tampão de amostra SDS e executar eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) usando um Gel de Bis-Tris 4-12% em 1 x MES SDS, executando o buffer para 35 min a 200 V. transferência resolveu proteínas para uma membrana de nitrocelulose 0,2 µm, aplicando uma tensão o f 50 V para 1-1.5 h realizar análise ocidental do borrão para avaliar a presença de albumina, apolipoproteínas A e B e o marcador de exossomo CD 63 seguindo metodologias padrão.
Nota: Protocolos completo para os métodos em 7.1 podem ser encontrados na referência14; especificamente, SP007: execução de géis de poliacrilamida e SP011: protocolo de Western blot. - Separar 10 µ g de exosomes purificada usando a página como no passo 7.1 e mancha as bandas de proteínas usando corante coomassie, seguir as recomendações padrão, para visualizar a variação de proteína e redução entre amostras.
Nota: Para mais informações sobre o protocolo para borrões ocidentais específicos para CD63 são descritas por Diaz et al. 15
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Representative Results
Os dados apresentados abaixo foram obtidos utilizando amostras de plasma e soro pareadas de cinco doadores de sangue saudáveis. Para determinar os efeitos de cada etapa de processamento, foram realizadas cinco variações do protocolo apresentado, e remoção de proteínas de recuperação e não-exossomo exossomo foram comparados. Os métodos julgados incluídos: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2) ultrafiltração 100 kDa; 3) proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultrafiltração 100 kDa e 5) Proteinase K, ultrafiltração 100 kDa + SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa.
Coletivamente, todos os métodos que envolvem SEC 700 kDa (1, 4 e 5) produziram um número significativamente maior de vesículas por micrograma de proteína nos dois tipos de amostra, soro e plasma (figura 1A-B). No entanto, o método 5 gerado um número significativamente maior de vesículas por micrograma de plasma em relação ao soro (Figura 1). Por outro lado, a concentração de proteína em amostras purificadas exossomo foi significativamente menor enquanto estiver usando os métodos baseados em kDa 700 SEC (1, 4 e 5). One-Way ANOVA e Tukey múltiplas comparações testes mostraram que a concentração de proteína final após métodos 2 e 3 foram significativamente maiores do que a concentração de proteína final após métodos 1, 4 e 5 (p < 0,001). As diferenças foram consistentes usando plasma ou soro, no entanto, com o método 1 a concentração de proteína final de exosomes purificado foi significativamente maior (teste t, p < 0,05) quando usando soro (Figura 2A). Para avaliar a distribuição de proteína de exosomes purificado por cinco diferentes métodos, 10 µ g da amostra de cada método foram resolvidos em uma página e corados com corante coomassie. Os resultados sugerem que a maioria das proteínas presentes no exosomes"purificado" de métodos 2 e 3 foi albumina representada pela banda forte ~ 65 kDa (Figura 2B).
O próximo passo foi confirmar o aumento na pureza de exosomes isoladas, baseado na presença da albumina, proteína mais abundante no sangue. O processo de ultrafiltração mostrou uma marcado concentração de albumina na fração de exosomal que foi parcialmente reduzida por pré-tratamento da amostra com proteinase K (Figura 3A, as travessas S e P). A inclusão da SEC 700 kDa no processo diminuiu a quantidade de albumina (Figura 3A, pistas S1/P1 e P4/S4), mas a combinação de SEC 700 kDa, proteinase K e ultrafiltração mostrou a mais eficiente remoção de albumina de exosomes purificado ( Figura 3A, lane P5/S5). Estudos recentes têm mostrado que a apolipoproteínas também são comumente co isoladas durante exossomo purificação10,16. Especificamente, ApoB, que está presente em lipoproteínas de baixa densidade, foi encontrado para ser altamente concentrada em exosomes purificado do sangue humano10. Portanto, avaliamos o isolamento co das lipoproteínas ApoB e ApoA-1. Métodos de ultracentrifugação e a combinação de ultracentrifugação e SEC 700 kDa mostraram uma quantidade semelhante de ApoB em comparação com a quantidade detectada no soro e plasma por western blot (Figura 3B, pistas S1/P1, P2/S2 e S4/P4; Figuras complementares 1/2). Curiosamente, a adição de proteinase K resultou na degradação completa da ApoB da amostra purificada (Figura 3B, pistas P3/S3 e S5/P5). Da mesma forma, ApoA-1, o componente de proteína principal de lipoproteínas de alta densidade no plasma humano, foi reduzida em todos os métodos envolvendo SEC 700 kDa ou proteinase K (Figura 3). Embora, tanto com a albumina, a ultrafiltração MWCO 100 por conta própria foi incapaz de reduzir significativamente a quantidade de co, purificando ApoA-1.
Finalmente, para determinar o efeito de proteinase K em proteínas expostos na membrana externa de exosomes, nós avaliamos a presença da CD63 tetraspaninas, uma proteína de marca de exosomes. Uma análise de Western blots mostrou que a proteína não só era detectável em métodos usando proteinase K (Figura 3D, as travessas P3/S3 e S5/P5), mas as bandas para CD63 método 5 tinham um sinal mais intenso (Figura 3D, pistas P5/S5). Este achado sugere método 5 produz uma concentração mais elevada de exosomes ou o aumento da ligação de anticorpos CD63 devido à diminuição dos agregados de proteínas associadas com a superfície do exossomo.
Figura 1 : Rendimento do exossomo de plasma e soro após cinco métodos de purificação diferente. (A) concentração de exosomes obtidos de plasma (n = 5). (B) concentração de exosomes obtidos de soro (n = 5). (C) comparação entre os números de exosomes por micrograma de proteína de 5 conjuntos emparelhados de plasma e soro. Números sobre o representam eixo x cada método usado, 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2 = ultrafiltração 100 kDa; 3 = proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltração 100 kDa e 5 = Proteinase K, ultrafiltração 100 kDa + SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa. Em A e B, as diferenças foram calculadas por One-Way ANOVA e Tukey é testes de comparações múltiplas. Em C, as diferenças entre soro e plasma por método foram calculadas pelo teste-t. p < 0,05; Barras de erros: 95% de intervalo de confiança. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Rendimento de proteína em exosomes purificado de plasma e soro usando cinco métodos diferentes. (A) comparação entre o rendimento de proteína total no exosomes purificados obtidos de plasma e soro (n = 5). (B) imagem representativa de uma coloração coomassie de 10 µ g de exosomes purificado resolvido por SDS-PAGE; n = 1, emparelhado plasma e soro. Os números na figura representam cada método, 1 = SEC 700 kDa + 3 ultrafiltração kDa; 2 = ultrafiltração 100 kDa; 3 = proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltração 100 kDa e 5 = Proteinase K, ultrafiltração 100 kDa + SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa. Na A, as diferenças entre plasma e soro-derivado amostras foram calculadas pelo teste-t. p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Redução dos contaminantes normais de exosomes isoladas de sangue humano e estabilidade da proteína CD63 hallmark. Avaliação de borrão ocidental de: (A) de albumina, 1 µ g por via; (B) Apolipoprotein B, 1 µ g por via; e (C) Apolipoproteína A1, 10 µ g por via; (D) CD63, 1 µ g por faixa. L = escada; S = soro bruto; P = plasma bruto. Exossomo purificado: usando 5 diferentes métodos de purificação. Os números na figura representam cada método, 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2 = ultrafiltração 100 kDa; 3 = proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltração 100 kDa e 5 = Proteinase K, ultrafiltração 100 kDa + SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa. Resultados representativos do pareadas de soro e plasma de um paciente; as tendências foram consistentes entre as amostras de doadores. Carregamento de proteína variou por blot; normalização baseou-se na determinação de BCA da concentração total da amostra. Carga de proteínas totais por raia foi especificada para cada borrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: Original não cortada ocidental borrões da Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2: quantificação de densidade de albumina, ApoB, ApoA-1 e bandas de CD63 da Figura 3; Utilizou-se software ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um método otimizado para aumentar a pureza e o rendimento de exosomes de sangue irá aumentar a capacidade de precisão meu vesículas extracelulares como fonte de biomarcadores para várias doenças. O padrão métodos atualmente usados para isolar exosomes, especificamente, ultracentrifugação e métodos de precipitação, tem várias desvantagens incluindo exossomo agregação e granulação de proteínas solúveis7,17, 18. Como alternativa, o uso do SEC mostrou uma melhoria significativa exossomo isoladamente, protegendo exosomes de agregação e melhorar a remoção de contaminantes comuns não-exosomal proteínas9,11,18 , 19. no entanto, apolipoproteínas10, vesículas maiores e agregados de proteínas, incluindo albumina, são muitas vezes co isolados com exosomes, se SEC sozinho é usado. Dois críticos passos da ajuda do protocolo apresentado em superar as duas últimas limitações mencionadas. Primeiro, a centrifugação da amostra em 18.000 x precipitados de g, a maioria das vesículas maiores presentes na amostra de soro ou plasma. Em segundo lugar, o pré-tratamento das amostras de soro ou plasma com proteinase K, uma serina protease com ampla especificidade20, é fundamental para reduzir a quantidade de albumina e as apolipoproteínas a-1 e B associado com o exosomes durante a purificação. Nós combinamos o uso da proteinase K com um passo de ultrafiltração usando uma membrana com um MWCO de 100 kDa para eluir parcialmente pequenas proteínas e peptídeos, e depois adaptamos a utilização de uma resina SEC com um MWCO de 700 kDa para limpar mais pequenas peptídeos/proteínas do exosomes. Esta resina, originalmente otimizada para isolamento do vírus, captura restantes grandes proteínas e/ou complexos sob 700 kDa. O princípio de isolamento de resina SEC permite uma recuperação suave do exosomes, desde que o fluxo da amostra através da resina é impulsionado pela gravidade. Isto permite menos agregação e a integridade retida de exosomes, superando duas das principais limitações dos métodos baseados em ultracentrifugação. Por último, foi demonstrado por Borges et al . que a diluição do plasma antes do processamento do SEC melhora exossomo recuperação21. Neste protocolo, incluímos uma etapa de diluição antes da SEC para aumentar o tempo de contato da amostra com a resina.
Uma limitação importante do protocolo apresentado é o potencial digestão das proteínas na membrana exosomal pelo tratamento de proteinase K. Isso pode prejudicar a jusante experimentos se as proteínas de membrana de superfície exposta são necessárias para as análises a jusante, incluindo borrão ocidental, ELISA, ou citometria de fluxo. Para testar parcialmente o efeito de proteinase K em proteínas de membrana associada, analisamos as amostras de protease-tratados para a presença de CD63, uma proteína de tetraspaninas, que está normalmente presente em exosomes. Estes resultados mostraram que uso de proteinase K, com as condições descritas do tempo de digestão e concentração não conduziu à degradação significativa do CD63. No entanto, a nova avaliação da estabilidade da proteína da membrana-associado com base em interesses específicos de investigação será necessária.
Em conclusão, o protocolo apresentado oferece diversas vantagens sobre os métodos atuais existentes. Cada passo incluído no protocolo tem demonstrado em estudos independentes para ser benéfico para a pureza do exosomes: granulação de maior vesículas, soro ou diluição do plasma e SEC. Additionally, como mencionado acima, uma etapa de digestão da protease foi incluída para remover apolipoproteínas e agregados de proteínas, bem como uma concentração passo no final do processo de purificação que beneficia rendimento e estabilidade do exossomo. Finalmente, este protocolo pode ser facilmente adaptado para isolar exosomes de amostras de volume maiores como urina ou sobrenadantes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por fundos internos da CSU (para KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (um subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) e a Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1039688) (para KMD/NKG). Agradecemos a experiência de pesquisa do NSF para programa de Verão de alunos de graduação (REU) Universidade Estadual do Colorado para suporte adicional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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