Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57471
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 3, 4
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

Summary

Formalin-fast parafin-embedded prøver representerer en verdifull kilde til molekylær biomarkers menneskelige sykdommer. Her presenterer vi en laboratorie-baserte cDNA biblioteket forberedelse protokoll, opprinnelig designet med fersk frosne RNA og optimalisert for analyse av arkiverte microRNAs fra vev lagret opp til 35 år.

Abstract

-Arkiverte, klinisk klassifisert formalin-fast kan parafin-embedded (FFPE) vev gi nukleinsyrer for retrospektiv molekylære studier av hudkreft. Ved å bruke ikke-invasiv eller pre-ondartet lesjoner fra pasienter som senere utvikler invasiv sykdom, kan gene expression analyser bidra til å identifisere tidlig molekylær endringer som disponerer til kreftrisiko. Det har vært godt beskrevet at nukleinsyrer utvinnes fra FFPE vev har gjennomgått alvorlige fysiske skader og kjemiske modifikasjoner, som gjør sin analyse vanskelig og krever tilpasset analyser. MicroRNAs (miRNAs), men som representerer en liten klasse av RNA molekyler som dekker bare opp til ~ 18 – 24 nukleotider, har vist seg å tåle langtidslagring og har vært vellykket analysert i FFPE prøver. Her presenterer vi en 3 barcoded komplementære DNA (cDNA) bibliotek forberedelse protokoll spesielt optimalisert for analyse av små RNAs Hentet fra arkiverte vev, som nylig ble vist for å være robust og svært reproduserbar når bruker arkivert klinisk prøver lagret for opp til 35 år. Dette biblioteket preparatet er godt tilpasset multiplex analyse av kompromittert/degradert materiale der RNA prøver (opptil 18) er samskrevet med personlige 3' barcoded kort og deretter samlet sammen for påfølgende enzymatisk og biokjemiske forberedelser før analyse. Alle renselser utføres av polyakrylamid gel geleelektroforese (side), hvilke innrømmer størrelse-spesifikke valg og enrichments barcoded liten RNA arter. Dette cDNA biblioteket preparatet er godt tilpasset til minutt RNA innganger, som en pilot polymerasekjedereaksjons (PCR) tillater fastsetting av en bestemt forsterkning syklus å produsere optimale mengder materiale for neste generasjons sekvensering (NGS). Denne tilnærmingen ble optimalisert for bruk av dårligere FFPE fra prøver arkivert for opp til 35 år og gir svært reproduserbar NGS data.

Introduction

miRNAs er bemerkelsesverdig godt bevart i formalin-fast parafin-embedded (FFPE) prøver1,2,3. Tidligere arbeid har vist at uttrykket av disse korte regulatoriske ikke-koding enkelt strandet RNA molekyler kan evalueres vellykket med totalt RNA fra FFPE prøver og gi relevant genuttrykk data i forhold til den opprinnelige friskt vev4,5,6,7,8. Sammenlignet med stor størrelse messenger RNAs, som har vist seg å være kritisk påvirket av FFPE vev behandling (formaldehyd, varme, uttørking, etc.), endogen RNases, og alderen av prøver, den lille størrelsen på miRNAs (~ 18-24 nukleotider) synes å gjøre dem motstandsdyktig mot nedbrytning og elastisk for langvarig lagring, viste også gjennom miRNA uttrykk studier som overgår høy gjennomstrømming mRNA studier i arkiverte prøver9. miRNA uttrykk studier med arkiverte klinisk prøver, som er hovedsakelig utført i småskala analyser, har vist at enkelt eller multiplekset kvantitative PCR analyser, ulike typer microarray teknologi og sist NGS kan brukes til å vurdere uttrykk for bevarte miRNAs etter optimalisering av disse analyser10,11,12,13,14.

Gitt at feilregulering miRNA uttrykk har vært forbundet med utvikling av en rekke menneskelige malignitet, og at det er potensielt en enorm tilførsel av klinisk kommenterte arkiverte prøver, det er blitt klart at disse små RNA molekyler er en lovende kilde til potensielle kreft biomarkers15,16,17,18. Bruk av en høy gjennomstrømming gene expression teknologi som NGS har fordelen av å gi en global evaluering av alle miRNA transkripsjoner sammenlignet med målrettet teknologier som PCR og/eller microarrays19. Derfor var en optimalisert, rimelig og enkelt gjeldende protokoll for cDNA biblioteket utarbeidelse av små RNAs fra eldre arkiverte prøver for NGS optimalisert for å aktivere store retrospektiv studier20.

Vi etablerte en samtidige RNA/DNA utvinning protokoll for egen utvinning av RNA og DNA fra eldre arkiverte prøver, som vi fant for å utkonkurrere moderne kommersielle kits21. Bruker denne utvinning protokollen, hente totalt RNA fra FFPE vev arkivert for lengre tid, optimalisert vi utarbeidelsen av cDNA biblioteker for NGS av miRNAs bevart i klinisk prøver for opp til 35 år. Videre, i en nylig publisert studie hvor vi forberedt cDNA biblioteker fra klinisk klassifisert ductal karsinom i situ (DCIS) eksemplarer, vi identifisert ulikt uttrykt miRNAs som ble godkjent av kvantitative PCR, som indikert at bestemte miRNA uttrykk endringer kan være i DCIS lesjoner fra pasienter som utvikler brystkreft i forhold til DCIS lesjoner fra pasienter som ikke utvikle brystkreft.

Vurderer kostnadene for kommersielle kits for utarbeidelse av små RNA cDNA biblioteker, potensialet for deres seponering, samt bruk av copyright/patent-beskyttet reagenser som ikke kan optimaliseres, bestemte vi oss å tilpasse en tidligere publisert laboratorie-baserte og kit-gratis 3' barcoded cDNA biblioteket forberedelse protokoll for NGS av små RNAs arkivert i FFPE eksemplarer, slik at samtidig analyse av 18 eksempler22. Denne protokollen gir en ideell og robust fremgangsmåte visuelle og tekniske evalueringen sjekkpunkter, som var kritiske for tilpasning til FFPE RNA prøver, og har en sterk potensial for søknad til andre kilder til kompromittert eller vanskelig bruke RNA materiale. Opprinnelige protokollen anvendbarhet ble forbedret ved å erstatte radioactively merket størrelse markører med fluorescerende (f.eksSYBR gull) synlig RNA størrelse markører brukes under utvalg av samskrevet bibliotekene på store polyakrylamid gels. Denne optimaliserte protokollen avhengig ligation av 3 barcoded adaptere for 18 individuelle FFPE RNA prøver, som er så samlet sammen for å gjennomgå 5 kort hemorroider, omvendt-transkripsjon og en pilot PCR analyse for skreddersydd forsterkning av den siste cDNA biblioteket før store PCR forsterkning rensing og NGS på en høy gjennomstrømning sequencer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av alle reagenser og primere

  1. Bestille alle primere og adaptere som beskrevet i figur 1.
  2. Forberede kalibrator cocktail lager, som vil være tilsatt i hver enkelt ligatur.
    1. Resuspend bærer oligonucleotide (figur 1) til 0,5 µM med RNase-fritt vann. Resuspend 10 kalibrator oligonucleotides (figur 1) til 100 µM med 0,5 µM bærer oligonucleotide løsningen.
    2. Kombiner 10 µL av hver av de 10 kalibratorer i en silikoniserte microcentrifuge å oppnå en 100 µM cocktail kalibrator lager, og utarbeide en 0.026 nM løsning lagre på 20 ° C.
  3. Fortynne 20 unike, lyofilisert, adenylated 3 kortene med RNase-fritt vann til en siste konsentrasjon av 50 µM (figur 1).
    Merk: Det anbefales å forberede 2,5 µL dele fra hvert kort i individuelle silikoniserte rør og lagre dem på-80 ° C til 2 år.
  4. Resuspend den avsalte 19 nt-3' adapter og 24 nt-3' kort størrelse markør oligonucleotides til 250 ng/mL (figur 1).
  5. Resuspend HPLC renset 5' kortet 100 µM med RNAse-fritt vann. Resuspend 5' og 3 PCR primere 100 µM ved hjelp av RNase-fritt vann (figur 1).
    Merk: Aliquot alle oligonucleotides i mengder nødvendig for 1-2 eksperimenter og butikk på-80 ° C.
  6. Forberede polyakrylamid denaturing (PAA) gel lasting fargestoff ved å kombinere 98,8% formamide, 1% (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 og 0,2% bromophenol blå og angi 1 mL dele på-80 ° C.
    1. Forberede 0,5 M Na2H2 EDTA løsningen ved å legge 18.6 g Na2H2 EDTA pulver til 50 mL av nuclease-fritt vann. Legge NaOH pellets for å nå pH 8.0. Juster volumet til 100 mL for å få en 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 lager løsning.
    2. Vei 15 mg bromophenol blå i en separat 15 mL tube. Legge til 600 µL nuclease uten vann. Legg 14.25 mL av de-ionisert formamide. Legge til 150 µL av 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 løsning.
    3. Aliquot PAA endelige løsning av 15 mL i 1 mL dele på-80 ° C.
  7. Forberede 5 x agarose gel lasting fargestoff ved å kombinere 0,2% bromophenol blå, 0,2% xylen cyanol FF, 50 mM Na2H2 EDTA, pH 8.0 og 20% Ficoll Type-400.
    1. Resuspend 1,86 g av Na2H2-EDTA i 50 mL av nuclease-fritt vann i en 400-mL kanne på en magnetisk rørestang ved romtemperatur (RT). Legge NaOH pellets for å nå en pH 8.0. Legge til nuclease-fritt vann for å nå 100 mL for å få en 50 mM Na2H2 EDTA løsning.
    2. Veier 20 mg bromophenol blå pulver, 20 mg xylen cyanol FF pulver og 2 g Ficoll Type-400 pulver, og resuspend i 5 mL til 50 mM Na2H2 EDTA.
    3. Vortex tube som inneholder de tre fargestoffer og legge 5 mL av 50 mM Na2H2 EDTA. Bland 5 x agarose gel lasting fargestoff, forberede 1 mL dele og lagre på-80 ° C.

2. Sett opp de 3 Barcoded Adapter Ligations med 18 individuelle RNA prøver

  1. Identifisere 18 individuelle RNA prøver (pre-aliquoted på 100 ng i 9,5 µL nuclease uten vann i 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge rør), og angi rør på is å avrime i 10 min.
  2. Forberede 10 x RNA Ligase Buffer (uten ATP) frisk.
    1. I en 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge tube, kombinere 343 µL RNase uten vann, 500 µL av Tris 1 M pH 7.5 100 µL av 1 M MgCl2, 50 µL av 20 mg/mL bovin serum albumin og 7 µL av 14 M 2-mercaptoethanol. Blandingen av flicking røret, sentrifuger 2 s på 2000 x g og RT, og sett på isen.
      Merk: Alle trinn i denne protokollen som angir "sentrifuge for 2 s" utføres i en Borstemmaskin microcentrifuge RT og en toppfart på 2000 x g samle løsninger på bunnen av rør.
  3. Forberede 50% vandig DMSO lager ved å legge til 1 mL av RNase-gratis vann til 1 mL av DMSO i en 2 mL silikoniserte microcentrifuge rør, bryte røret i aluminiumsfolie og lagre på RT.
  4. Tin 0.026 nM kalibrator cocktail på is 10 min. forberede Ligation Master Mix ved kombinere i rekkefølgen nedenfor i en 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge tube: 40 µL av 10 x RNA Ligase Buffer og 120 µL av 50% vandig DMSO bruker en 200 mL pipette , og legge 10 µL av 0.026 nM kalibratoren cocktail med en 10 µL pipette. Sveip 1,5 mL røret å mikse, sentrifuge for 2 s, og sett den på isen.
  5. Legge til 8,5 µL av Ligation Master Mix hver 18 individuelt aliquoted FFPE RNA prøvene, forsiktig sveip rør, sentrifuge for 2 s og butikk på is.
  6. Defrost 2,5 µL dele fra hver av de 18, 3 barcoded adapterne og plassere dem på is å avrime for 20 min.
    1. Bruk en 3-µL pipette overføre 1 µL av hvert kort til tilsvarende FFPE RNA prøvene som inneholder RNA og Ligation Master Mix (dvs., 9.5 µL + 8,5 µL).
    2. Ikke Pipetter opp og ned, bare dispensere i væsken og trekke spissen ut. Husk å endre tips mellom FFPE RNA prøvene. Lukke hver rør, flick for å blande, sentrifuge for 2 s, og sett på isen.
  7. Denature reaksjoner ved å plassere 18 rørene på varme blokk ved 90 ° C i 1 min og umiddelbart plasser på is.
  8. Klargjør ligation enzym løsningen ved utvannende 10 µL av avkortet K227Q T4 RNA Ligase 2 med 10 µL av RNase-gratis vann i en fersk 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge tube.
  9. Bruk en 3 µL pipette overføre 1 µL av utvannet ligation enzymet i hver av de 18 RNA prøvene (ikke Pipetter opp og ned, og endre tips mellom hver rør). Angi de 18 ligations på is og plasser i 4 ° C kaldt rommer en overnatting inkubasjonstiden for 18 h.

3. rensing av Ligated liten RNAs

  1. Deaktiver ligation reaksjonene ved å plassere de 18 rør for 1 min på varme blokk ved 90 ° C, og deretter gå tilbake til is i minst 2 minutter å kjøle seg ned.
  2. Klargjør nedbør Master blandingen ved å legge til 1 µL blått fargestoff covalently knyttet til glykogen til 26 µL av 5 M RNase-fri NaCl i en fersk silikoniserte microcentrifuge tube.
    1. Overføre 1,2 µL av nedbør Master Mix i hver av de 18 rørene. Legge til 63 µL av 100% etanol i hver av de 18 rørene. Lukke hver rør, sveiper du til mix, sentrifuge for 2 s og sted rørene på is. Kombinere innholdet i alle 18 rør i en enkelt 1,5 mL silikoniserte tube.
    2. Lukk røret, invertere tre ganger blanding, sentrifuge for 2 s og sted på is for 60 min å utløse.
  3. Forberede en stor (16 x 20 cm2) 15% polyakrylamid gel for siden.
    1. Silikoniserte kastet to glassplater (behandlet med et trygt alternativ til silane belegg) med 0,1 cm avstandsstykker.
    2. Kombinere 9 mL systemet fortynningsmiddel, 18 mL systemet konsentrat, 3 mL systemet buffer, 240 µL av APS (9%) og 12 µL av TEMED i en 50 mL tube.
    3. Overføre siden gel løsningen mellom glass og tallerkener med en 30-mL pipette, sette inn en 14-vel kam (0,1 cm tykk) og la gel stivne på RT i 30 min.
  4. Sentrifuge 1.5-mL røret med de grupperte ligations på 16.000 x g og 4 ° C for 60 min.
  5. Fjerne kam. Rengjøre brønnene rikelig med RNase-fritt vann med en sprøyting flasken med 200 µL tips på slutten nå inne brønnene og styrke un polymerized akrylamid (en bra om gangen) over en vask. Angi 15% siden på en gel apparater, fylle reservoarene med 0.5 x Tris-Borate EDTA (TBE) løsning, og kjøre pre gel i 30 min 450 V.
  6. Gjenopprette røret med grupperte ligations fra sentrifuge og nøye tørke RNA-pellets.
    1. Fjerne nedbryting med 1-mL pipette tips, men la noen væske nederst. Tilt røret og bruke en 20 mL pipette fjerne gjenværende nedbryting uten berørende pellet. Vakuum sugekraft tube med en Pasteur pipette med 10-µL tips på slutten, uten å berøre pellet.
    2. Resuspend RNA pellet i 20 µL av RNase-fritt vann ved å sveipe røret. Legg 20 µL av PAA gel lasting løsning på resuspend i RNA, flick for å blande, sentrifuge for 2 satt RT, og sett røret på 90 º c i 1 min og deretter umiddelbart sted på is.
  7. Erstatt 0,5 x TBE av gel apparater med fersk 0,5 markører for x TBE og Last stigen, størrelse og samskrevet miRNAs i midten av gel, forlater 2 tom brønner på begge sider (figur 2).
  8. Kjøre gel på 450 V (35 mA) for 60 min, stoppe løpe for 10 min å kjøle ned, og løpe igjen på 520 V (25 mA) for en annen 60 min. Uncast de 15% siden ved å fjerne en av glass platene.
  9. Lett spray gel sitter på glassplaten med fluorescerende fargestoff løsning (10 µL) i 25 mL 0.5 x TBE og la det sitte for 5 min i mørket.
  10. Lå glasset med gel på et blått lys transilluminator og justere både 19 nt og 24 nt størrelse markører med en linjal til direkte forbrukeravgift av de ligated liten RNAs (figur 2). Avgiftsdirektoratet gel.
  11. Sted forbrukeravgift gel i en 0,5 mL tube, designet for å fragmentere gel skiver, trygt plassert i en 1.5-mL silikoniserte microcentrifuge tube. Sentrifuge 16.000 x g i 3 minutter på RT. Resuspend fragmentert gel med 300 µL av 400 mM NaCl løsning, lukke røret og forsegle den med parafin filmen.
  12. Angi røret på agitasjon på en thermomixer på 1100 rpm i et 4 ° C kaldt rom for en overnatting inkubering (16-17 h).

4. ligation av 5' Adapter

  1. Overføre løsningen og fragmentert gel til filtere 5 µm rør sitter i en 1,5 mL silikoniserte rør, tetning med parafin film og sentrifuge for 5 min på 2300 x g og RT.
  2. Legge til 950 µL av 100% etanol filtrerte løsningen, nær tunnelbanen, invertere å mikse, sentrifuge for 2 s, forsegle røret med parafin film, og satt på is 1t.
  3. Forberede en 12% siden gel som beskrevet i trinn 3.3, men kombinerer 12.6 mL bitumenet 14.4 mL konsentrat, 3 mL buffer, 240 µL APS og 12 µL av TEMED til en 50 mL tube. Pre kjøre til 12% siden gel i 30 min på 450 V (~ 35 mA) i 0,5 x TBE.
  4. Sentrifuge renset liten RNA løsningen 16.000 x g for 60 min på 4 ° C.
  5. Pipetter forsiktig ut nedbryting ved hjelp av en 1 mL pipette fjerne mesteparten av løsningen og bruke en 200-mL pipette fjerne gjenværende løsningen, uten å berøre pellet.
  6. Bruker en Pasteur pipette med 10 mL tips på enden koblet til en vakuum kolbe, nøye tørke pellet uten å røre den.
  7. Resuspend pellet i 9 µL av RNase-fritt vann uten pipettering opp og ned, men ved å lett bla røret sentrifuge for 2 s, og sett røret på is.
  8. Forberede 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP) frisk ved å kombinere 500 µL av 1 M Tris pH 7.5, 100 µL av 1 M MgCl2, 50 µL av 20 mg/mL acetylated BSA, 200 µL av 10 mM ATP, 7 µL av 2-mercaptoethanol 14 M , og 143 µL RNase uten vann.
  9. Bland 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP) ved å sveipe røret og sentrifuge for 2 s å samle løsningen på bunnen av røret.
  10. Satt opp 5 kort ligation av tilføyer 2 µL av 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP), 1 µL av 100 µM 5 kort og 6 µL 50% vandig DMSO til 9 µL, 3 barcoded liten RNA løsning.
  11. Sveip røret til å blande, sentrifuge for 2 s å samle løsningen, sett røret på varme blokk ved 90 ° C i 1 min, og tilbake på isen i minst 2 minutter.
  12. Legge til 2 µL av T4 RNA Ligase 1 til løsningen (ikke Pipetter opp og ned), sveiper røret, sentrifuge for 2 s, og sitte røret i flytende rack i et vannbad 37 ° C for 60 min.
  13. Samtidig, sette opp to ligations mellom den 19 nt-3' kort og 5' kortet, og to ligations mellom den 24 nt-3' kortet og 5'-kortet.
    1. Kombinere 2 µL av 19nt-3' kort (250 ng/µL) eller 24 nt-3' adapter (250 ng/µL) med: 2 µL av 5' adapter (100 µM), 2 µL av 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP), 6 µL av 50% vandig DMSO 6 µL RNase uten vann , og 2 µL av T4 RNA Ligase 1 i en 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge tube.
    2. Sveip rør for å blande, sentrifuge for 2 s og sett rørene på 37 ° C for 60 min.
  14. Legge til 20 µL av PAA Denaturing Buffer alle ligations (renset små RNAs, 2 ligations med 19nt-3' kort og 2 ligations med 24nt-3' kort).
    1. Blandingen av flicking rør, sentrifuger 2 s, ruge rørene på varme blokk ved 90 ° C i 1 overføre alle rør til is og forberede en stige (3 mL av stigen med 20 µL av PAA).
  15. Tømme øvre reservoaret av gel apparater med pre Kjør 12% siden gel, og legge til frisk 0,5 x TBE løsning under nivået av (brønner er tømt med en lang, tynn tips pipette).
    1. Laste prøvene med tynne pipette tips, som beskrevet i Figur 3.
    2. Bruk ferske 0,5 x TBE fylle individuelle brønner til toppen av gel.
    3. Legge fersk 0,5 x TBE til reservoaret over brønner og start geleelektroforese på 12% siden for 60 min på 450 V (~ 35 mA).
    4. Hold kjøre ved bytte av generatoren i 10 min avkjølt gel. Start generator og kjøre gel for 60 min 520 V (~ 25 mA).
  16. Stoppe generator, tømme reservoarene ved å snu apparatet over en vask og uncast til 12% siden ved å fjerne en av glass platene.
  17. Sitte glasset med gel flat, spray gel med 10 µL av fluorescerende fargestoff i 25 mL 0,5 x TBE, ruge i mørket for 5 min. lå glasset med gel på et blått lys transilluminator og justere både 19 nt og de 24 nt størrelse merkene med en linjal for å direkte forbrukeravgift av de ligated liten RNAs (Figur 3).
    1. Avgiftsdirektoratet gel og overføre forbrukeravgift gel stykket i en 0,5 mL gel breaker rør. Lukk lokket av gel breaker rør, sett inn en 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge røret, og sikkert med parafin film. Fjern gel breaker røret, legge til 300 µL av 300 mM NaCl og 1 µL av 100 µM 3 PCR primer knust gel bitene i en 1,5 mL tube.
    2. Forsegle røret med parafin film på agitasjon på en thermomixer på 1100 rpm på 4 ° C over natten (17-18 h) i et kaldt rom.

5. omvendt transkripsjon av de 5' samskrevet og 3 Barcoded renset små RNAs

  1. Hente røret fra thermomixer og filteret rense løsningen med en 5 µM filter rør.
    1. Bruk en 1 mL pipette overføre løsningen på en 5 µM filter rør inn i en 1,5 mL silikoniserte RNase-fri samling rør. Sentrifuge rør for 3 min på 2300 x g og RT.
    2. Forkaste filter røret og legge 950 µL av 100% etanol til 1,5 mL microcentrifuge samling rør som inneholder filtrerte løsningen. Invertere røret blanding, sentrifuge for 2 s og sted på is 60 min. utløse RNA pellets av sentrifugering røret på 16.000 x g og 4 ° C i 1 time.
  2. Tørr RNA-pellets.
    1. Åpne lokket og fjern forsiktig nedbryting med en 1-mL pipette, forlater enkelte flytende nederst.
    2. Bruk en 20 µL pipette for å fjerne alle resterende nedbryting uten berørende pellet. Vipp røret å tillate noen løsning å sitte på motsatt side av pellet.
    3. Bruk en Pasteur pipette med 10 mL ufiltrert pipette tips Sug opp nedbryting og tørr pellet bruker et vakuum.
  3. Resuspend RNA pellet i 5,6 µL RNase uten vann.
    1. Tin omvendt transkripsjon reagensene på isen i 15 min. Sett opp en omvendt transkripsjon reaksjon ved å legge 3 µL av 5 x Buffer, 4,2 µL av 10 x deoxynucleotide trifosfat (dNTPs) (hver 2 mM) og 1,5 µL av dithiothreitol (DTT) til 5,6 µL av RNase-fri urinprøven.
    2. Forsiktig sveip røret for å blande reaksjonen og sentrifuge for 2 s å samle løsningen. Angi reaksjonen på en varme blokk ved 90 ° C i nøyaktig 30 s og deretter overføre direkte på en thermomixer på 50 ° C.
    3. La røret på thermomixer i 2 minutter slik at temperaturen equalizes. Legge til 0,75 µL av omvendt transkripsjon enzym direkte i løsningen, flick forsiktig å blande og sett røret tilbake på thermomixer ved 50 ° C i 30 min umiddelbart.
  4. Etter 30 min, overføre røret til en varme blokk ved 95 ° C i 1 min å stoppe omvendt transkripsjon. Legge til 95 µL av RNase-fritt vann direkte motsatt transkripsjon, sveiper røret å blande og sette den på is i 2 minutter.
  5. Etiketten røret med cDNA lager biblioteket og biblioteket-ID.

6. pilot PCR og store PCR forsterkning

  1. Forberede fersk 10 x PCR bufferen ved å legge 304 µL RNase uten vann, 125 µL av 2 M KCl, 50 µL av 1 M Tris pH 8.0, 10 µL av 1 M MgCl2, 5 µL av 1% Triton X-100 og 6 µL av 1 M 2-mercaptoethanol i et silikoniserte microcentrifuge rør , og holde på RT.
  2. Montere Pilot PCR reaksjonen ved å kombinere 67 µL RNase uten vann, 10 µL av 10 x PCR Buffer, 10 µL av 10 x dNTPs, 0,5 µL av 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µL av 100 µM 3 PCR primer, 10 µL av cDNA lager bibliotek og 2 µL av 50 x Taq utvalg.
    1. Sette opp to PCR sykluser på en thermocycler som følger: fil 1: 94 ° C for 45 s, 50 ° C til 85 s og 72 ° C for 60 s 10 sykluser, holde på 4 ° C; Filen 2: 94 ° C for 45 s, 50 ° C til 85 s og 72 ° C for 60 s 2 sykluser, holde på 4 ° C. Definer Pilot PCR reaksjonen i thermocycler og starte filen 1.
    2. På slutten av filen 1, åpne PCR røret, og bruker en 20 µL pipette, overføring 12 µL Pilot PCR reaksjonen til en 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 3 µL av 5 x gel lasting fargestoff, blande av pipettering opp og ned, lukke røret , og Merk den "10 sykluser".
    3. Lukk Pilot PCR røret og starte filen 2 på en thermocycler. På slutten av filen 2, åpne PCR rør og bruke en 20 mL pipette overføre 12 µL av løsning til 1.5-mL microcentrifuge rør med 3 µL av 5 x gel lasting fargestoff, og Merk den "12 sykluser".
    4. Gjenta trinnene som beskrives i trinn 6.2.2 og 6.2.3 samle 12 µL PCR produkter fra Pilot PCR reaksjonen på PCR sykluser 14, 16, 18 og 20. Legg 3 µL av 5 x gel lasting fargestoff til hver av de 12 µL PCR dele, og til 20 nt stigen inneholder 3 µL av stigen og 9 µL RNase uten vann.
  3. Forberede en 2,5% agarose gel med 0,5 x TBE.
    1. Veie 2.5 g av agarose i et rent beaker og legge til 100 mL 0,5 x TBE. Varme opp løsningen i mikrobølgeovn til det koker. Fjerne løsningen fra mikrobølgeovn, swirl flasken for å blande agarose legge 4 μL ethidium bromide (10 mg/mL) og overføre løsningen til en 7 x 10 cm2 geleelektroforese skuff, stengt på begge ender med tape.
    2. Angi en 8-vel kam og la agarose gel stivne ved RT. overføring befestet agarose gel i et geleelektroforese apparat fylt med 0,5 x TBE.
  4. Laste stigen og PCR smakebiter på agarose gel, og kjøre det i 30 minutter til 120 V.
  5. Evaluere gel på en UV-boksen for å identifisere optimal PCR syklus (figur 4A).
    Merk: Størrelsen på forventet PCR bandene vises i figur 4B.
    1. Observere de to PCR bandene i hver av de forskjellige brønnene (øvre band: DNET bibliotek, nedre band: primer dimers).
    2. Identifisere tilstrekkelig PCR syklus for cDNA forsterkning ved å velge syklusen der cDNA biblioteket er synlig, men primer dimers er knapt observerbare.
      Merk: Vanligvis tilstrekkelig PCR syklus er valgt mellom 12-16 sykluser. Figur 4Aer tilstrekkelig PCR syklus for dette biblioteket 14.
  6. Definere store PCR reaksjonene (6 x 100 µL) for agarose gel biblioteket rensing.
    1. Forberede en fersk tube med 10 x PCR bufferen etter trinn 6.1.
    2. Klargjør store PCR Master blandingen i en 1,5 mL tube ved å kombinere 435.5 µL RNase uten vann, 65 µL av 10 x PCR buffer, 65 µL av 10 x dNTPs, 3,25 µL av 5' PCR primer, 3,25 µL av 3 PCR primer og pipettering opp og ned å blande.
    3. Overføre 88 µL av PCR Master Mix inn seks 0,5 mL PCR rørene. Overføre 10 µL av cDNA lager bibliotek (lagret på isen), legge til 2 µL av 50 x Taq utvalg i hver av 6 PCR rør og Pipetter for å blande.
    4. Forberede en negativ PCR reaksjon rør ved å kombinere 77 µL RNase uten vann, 10 µL av 10 x PCR buffer, 10 µL av 10 x dNTPs, 0,5 µL av 5' PCR primer, 0,5 µL av 3 PCR primer og 2 µL av 50 x Taq utvalg og pipette å blande.
    5. PCR rør i thermocycler bruker PCR syklus beskrevet i trinn 6.2.1 og angir optimal forsterkning sykluser. Forberede en 2,5% agarose gel med 0,5 x TBE, som beskrevet i trinn 6.3.
  7. Etter PCR forsterkning, overføre 9 µL fra hver PCR rør inn i seks 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 3 µL av 5 x gel lasting fargestoff.
    1. Forberede 20 nt stigen ved å kombinere 3 mL stigen i 9 µL av RNase-fritt vann og legge 3 µL gel laste fargestoff i en 1,5 mL tube.
    2. Laste stigen, negativ PCR kontroll og 6 PCR produkter på agarose gel, og Kjør gel i 30 min på 120 V.
    3. Kontroller sıtt PCR-amplifications mellom baner på en UV-boks (ta et bilde).
    4. Kombiner 3 PCR reaksjoner i to 1,5 mL silikoniserte microcentrifuge tube (3 x 91 µL), legge til 27 µL av 5 M NaCl og 950 µL av 100% etanol. Invertere rør for å blande og sette dem på 20 ° C over natten til å fremkalle PCR produktene.

7. cDNA biblioteket rensing og evaluering

  1. Sentrifuge både rør med PCR reaksjonene 16.000 x g for 60 min på 4 ° C.
  2. Fjerne nedbryting med en 1 mL pipette, deretter vippe tuben med pellets på oversiden og væske på undersiden, og bruke en Pasteur pipette koblet til en vakuum kolbe med badekar og Sug opp væske med 10 mL tips på slutten av Pasteur pipette.
  3. Definere PmeI sammendraget.
    1. Resuspend en av PCR pellets med 17,5 µL nuclease uten vann, og Overfør urinprøven til det andre PCR-pellet. Legg 2 µL av 10 x Buffer og 0,5 µL av PmeI enzym, og angi sammendraget i et vannbad 2 h på 37 ° C.
    2. Forberede en 2,5% agarose gel med 0,5 x TBE (trinn 6.3). Legg til 6 µL av 5 x gel lasting fargestoff i sammendraget. Overføre 13 µL av hver digest i to tilstøtende brønner i agarose gel, laste 20 nt størrelse stigen på slutten brønnene og kjøre gel for 90 min på 150 V (Figur 4 d).
    3. Avgiftsdirektoratet øvre PCR bandene fra gel på boksen UV overføre gel bitene i en fersk vektet 1,5 mL microcentrifuge rør og veie gel stykker på en skala.
  4. Rense forbrukeravgift PCR forsterket cDNA biblioteket bruker en gel utvinning utstyr følger produsentens instruksjoner. Kvantifisere cDNA biblioteket bruker DNA kvantifisering analysen og instrument, etter instruksjonene fra produsenten.
  5. Vurdere størrelse og renhet av cDNA biblioteket med høy følsomhet DNA chip på en Bioanalyzer (figur 5). Rekkefølgen cDNA biblioteket ved å bruke en høy gjennomstrømming. Overføre FASTQ datafilen til rørledningen RNAworld til kortet trimming og justeringen til det menneskelige genomet å identifisere miRNA sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrevet i metoden her, totalt 18 individuelle FFPE RNA prøver (100 ng hver) defineres i separate rør å gjennomgå 3 adenylated barcoded oligonucleotide T4 ligation over natten. Neste dag, er de enzymatiske reaksjonene varme-deaktivert, kombinert og igangsatte i et enkelt rør. RNA pellets er resuspended og ligated RNA molekyler skilles på en 15% denaturing polyakrylamid gel (siden), hvor RNA oligonucleotide størrelse markører som overført i tilstøtende brønner i siden gel, brukes til å velge riktig størrelse 3' barcoded små RNAs (figur 2). Forbrukeravgift gel stykket er ruges i en NaCl løsning over natten for å elute ligated RNA molekyler. Neste dag, bidrar til den eluted RNA og en 5' kort ligation utføres. Deretter er 5 kort samskrevet liten RNA molekyler overført og atskilt på en 12% akrylamid gel, der igjen overførte RNA størrelse markør oligonucleotides tillate størrelse excision av små RNAs som inneholder både 3 barcoded oligonucleotides og 5'-kortet ( Figur 3). Forbrukeravgift gel er ruges over natten i en NaCl løsning å tillate elueringsrør av den. Neste dag, ligated liten RNA molekyler er utløst, og pellet er resuspended i RNase-fritt vann, etterfulgt av reverse-transkripsjon; en aliquot av cDNA molekyler gjennomgår en pilot PCR reaksjon (figur 4A). Store PCR reaksjoner bruker samme input av cDNA biblioteker er definert og vurdert på en 2,5% agarose gel å bekrefte at alle reaksjoner var tilstrekkelig PCR forsterket (figur 4B), før pooling og overnatting etanol nedbør. Neste dag, forsterket cDNA biblioteket som inneholder alle 18 personlige biblioteker for 18 unike FFPE RNA prøver, overføres på en 2,5% agarose gel, og det øverste PCR bandet, kjører på 100 nt er forbrukeravgift og renset (figur 4C). CDNA bibliotek rensing evalueres deretter på en høy følsomhet DNA chip (figur 5) til å fastslå at renset PCR produktet ikke inneholder et overskudd av primer dimers eller andre biprodukter av PCR reaksjonen. PCR produktet er deretter analysert på en høy gjennomstrømming sekvensering system. Kortet trimming og generering av 18 individuelle filer for hver av de 18 prøvene utføres ved hjelp av rørledningen RNAworld (tilgang ble gitt til oss av Dr. Thomas Tuschl). Biostatistical analyser utføres da for å vurdere miRNA innholdet av de FFPE RNA.

Validere dette optimalisert prosedyre, matchet frisk frossen og FFPE brystet tumor eksemplarer ble brukt for analyser (figur 6). To lignende invasiv ductal carcinoma (IDC) brystsvulster ble valgt til å vurdere følsomheten til prosedyren og bestemme om miRNA uttrykk forskjeller identifisert mellom to friske frosne vev kan også bli oppdaget i de samsvarende arkivert FFPE RNA prøver. For dette eksperimentet vurdert kvaliteten av RNA 2 fersk frosset og matchet to FFPE RNA prøvene var (figur 6A). Som forventet, var alvorlig RNA størrelsen og kvaliteten på de FFPE prøvene, redusert sammenlignet med de samsvarende frisk frosne RNAs (sammenligne baner 1 og 3, og baner 2 og 4). En av de FFPE hadde vært arkivert på RT 4 år (invasiv bryst kreft 1, (IBC1)) og den andre hadde vært arkivert på RT for 8 år (IBC2), mens de ferske frosne kolleger hadde vært lagret på-80 ° C. De fire individuelle RNA prøvene ble analysert i ett bibliotek, 4 individuelle strekkoder og miRNA lese distribusjon tomter vises i figur 6B. De to øverste panelene viser miRNA uttrykk sammenheng mellom to ferske frosne svulsten RNAs og deres spesifikke FFPE RNA prøven kolleger. Tomter mellom matchet frisk frossen og FFPE miRNAs angir at cDNA bibliotek forberedelse gir en god reproduserbarhet som observert en høy korrelasjon mellom miRNAs i prøver behandlet annerledes (Frozen g. FFPE). De to lavere panelene viser sammenhengen mellom miRNA uttrykk data fra to forskjellige frosne tumorer og mellom de to forskjellige FFPE svulstene. Som vist i figur 6C, var miRNA uttrykk forskjellene identifisert mellom to friske frosne tumorer korrelert med forskjellene oppdaget mellom de to samsvarende FFPE svulst prøvene. Betydning miRNA uttrykk forskjellene var synlig i fersk frosne og FFPE svulster.

For å ytterligere evaluere sensitiviteten av denne tilnærmingen, miRNA uttrykk data fra 12 arkiverte FFPE eksemplarer og 4 frisk frosne RNA eksemplarer ble brukt (figur 6D). De 16 forskjellige RNA prøvene var individuelt 3 barcoded og alle brukes for utarbeidelse av et enkelt cDNA bibliotek. RNA prøvene i dette biblioteket inkludert to bryst cellelinjer, MCF10A (normal-lignende cellen linje) og MCF7 (bryst kreft cellen linje) med RNA fra friske celler og deres arkiverte FFPE kolleger23, matchet frisk frosset og FFPE RNA prøver fra to brystkreft eksempler analysert uavhengig (IBC1 og IBC2 i figur 6A og 6B) og matchet frisk frosset og FFPE RNA eksempler fra normal cervical prøver (Cx). I tillegg ble arkiverte FFPE prøver fra normal (normal Br1, vanlig Br2 og normal Br3) og kreft bryst vev (IBC 5, IBC 6 og IBC 7), uten sine friske frosne kolleger analysert. Observert på heatmap, uansett frisk frosset eller FFPE RNA opprinnelse, miRNA uttrykket profiler av de samme cellene (MCF10 eller MCF7) eller samme vev (IBC1, IBC2 eller Cx) samlet sammen. I tillegg, som nevnt i unsupervised klyngen, fra venstre til høyre, normal brystkreft celler og vev klynger mens brystsvulster og kreftceller klynge til høyre. I cervical vev, som vises en annen miRNA uttrykk profil, klynge til høyre på heatmap.

Tatt i betraktning at de fleste av de klinisk arkiverte FFPE ikke har frisk frosne kolleger, men at de kan hentes etter annerledes lagringen varighet, var det forsøkte å fastslå om optimalisert cDNA biblioteket forberedelse protokollen gjelder og reproduserbar med stadig eldre FFPE prøver. Som vist i figur 7miRNA uttrykket profiler fra FFPE vev arkivert for 18, 20, 22, 27, ble 30 og 35 år innhentet. RNA ble hentet ved hjelp av optimalisert samtidig RNA/DNA prosedyre21, og quadruplet RNA dele fra hver enkelt FFPE prøve var forberedt på samme dag og lagret på-80 ° C før biblioteket forberedelser. Totalt 9 forskjellige FFPE eksemplarer ble analysert i duplikat, der hver enkelt RNA-aliquot var samskrevet med forskjellige barcoded oligonucleotides (18 strekkoder totalt), i samme bibliotek. Dette forsøket ble gjentatt i to påfølgende uker (uke 1 og uke 2). Dette tillot evaluering av cDNA biblioteket forberedelse reproduserbarhet med de samme RNA prøvene med to forskjellige strekkoder i ett bibliotek, og mellom to forskjellige biblioteker med en ukes intervall. Som observert på figur 7, korrelasjonskoeffisienten holdt seg over 0.96 uansett alder av prøven eller biblioteket forberedelse uken; optimalisert cDNA biblioteket forberedelse protokollen gir derfor et kraftig verktøy for reproduserbar analyse av FFPE uavhengig av deres arkivering tid, for eksempel den 35-årige arkiverte FFPE RNA (se bryst #9) vises høy reproduserbar tiltak tilsvarer de merket med 20-årige FFPE RNA prøvene (se bryst #3).

Figure 1
Figur 1: Oligonucleotides. Alle oligonucleotide sekvenser, tilsvarende kjemiske modifikasjoner og konsentrasjoner i denne protokollen er beskrevet. Hvilke typer kjemiske modifikasjoner er beskrevet i boksen endring og forkortet endringene vises i oligonucleotide sekvenser. Kalibrator cocktail viser listen over de 10 personlige RNA oligonucleotide kalibratorer, som var resuspended i en løsning som inneholder bærer oligonucleotide (0,5 µM). Atten 3 barcoded oligonucleotide kortene er detaljert med grå skyggelegging over strekkodens sekvens. RNA sekvensen av 5' kortet og DNA-sekvenser av de 3 PCR og 5' PCR primerne er detaljerte. RNA sekvenser av to størrelse markør oligonucleotides, nemlig det refereres til i protokollen 19 nt-3 ' adapter og 24 nt-3' kort størrelse markører, tilbys. Alle DNA og RNA oligonucleotides ble kommersielt kjøpt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: siden rensing av 3 barcoded RNA prøvene. Etter pooling og fremskynde 18 barcoded RNA prøvene, RNA urinprøven er overført og atskilt med geleelektroforese på en 15% akrylamid gel (se godt 8). Den røde firkanten fremhever området som inneholder 3 barcoded microRNAs, som ble excised med skalpell blad og overført til en nuclease uten silikoniserte microcentrifuge tube. Totalt fire brønner med to inneholder den 19 nt-3' kort og to inneholder den 24 nt-3' kortet ble satt en godt unna, på hver side av biblioteket (se brønner 5, 6, 10 og 11, henholdsvis). Som en test for T4 RNA ligase 1 og for rensing av ligated indikatorer for å være fullført neste dag, hemorroider reaksjoner som inneholder den 19 nt-3' kort størrelse markør med 5' kortet og 24 nt-3' kort størrelse markør med 5' kortet ble kjørt i brønner 2 en d 3, henholdsvis. Gul rutene vise forbrukeravgift bandene som representerer samskrevet størrelse markør RNA oligonucleotides med 5' kortet. Disse bandene renset, igangsatte og kjøre under på 12% siden rensing (se Figur 3 nedenfor). Wells 1 og 13 inneholder 20 nt størrelse stigen, som bidro til å bekrefte forventede størrelsen på ligated produkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: siden rensing av renset biblioteket etter ligatur kortets 5. Renset RNA biblioteket var samskrevet med 5' kortet og forventet produktet størrelsen ble excised fra til 12% siden bruker samskrevet størrelse markørene (se rød firkant). Produkter av T4 RNA-ligations mellom den 19 nt-3' kortet og 5'-kortet (wells 4 og 9) og mellom den 24 nt-3' kortet og 5'-kortet (wells 5 og 10) ble kjørt i parallell, på hver side av den også inneholder RNA biblioteket. Høyeste (se hvite stjerner) er produkter av 5 kort ligatur og brukes som guide for gel bandet excision inneholder 5' kort samskrevet RNA bibliotek. Hemorroider størrelse merket ligatur produktene renset på forrige side kjøres i vel 3. Som observert i brønner 1 og 12, var 20 nt størrelse stigen også kjøre for å validere forventede størrelsen av RNA biblioteket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Pilot PCR og store forsterkning av cDNA biblioteket. Størrelsen og forholdet mellom PCR produktene ble vurdert på en 2,5% agarose gel i nærvær av ethidium bromide. (A) etter omvendt transkripsjon av barcoded RNA biblioteket, en aliquot av cDNA biblioteket ble forsterket bruker 5' og 3 PCR primere i en enkelt pilot PCR reaksjon. Dele pilot PCR reaksjonene ble oppnådd ved 10, 12, 14, 16, 18 og 20 sykluser og overføres på en 2,5% agarose gel. Som observert mellom brønner 1 og 7, tilstedeværelse av cDNA bibliotek og adapter dimers var eksponentielt observerbare (se grønne rektangler). For biblioteket var PCR syklus valgt for forsterkning av cDNA biblioteket 15. (B) dette skjematisk viser posisjon og de ulike oligonucleotides og de resulterende RNA og DNA produktene, som identifiseres på siden og agarose geléer. (C) dele 6 store PCR reaksjonene (identifisert i) ble analysert separat på en 2,5% agarose gel (se brønner 3-8). De to typene PCR produkter, nemlig biblioteket (øvre band) og primere dimers (nedre band) er synlige på denne gel (se grønne rektangler). Tom PCR reaksjonen uten cDNA viser ingen PCR forsterkning (se godt 2). 20 nt størrelse stigen kan verifisering av produktet størrelsene (se godt 1). (D) Gel bilde på et blått lys transilluminator av 2,5% agarose gel inneholder gruppert PCR reaksjonene løp i to tilstøtende brønner. Som observert, høyeste bandet i begge brønner er forventet biblioteket størrelse og kortet dimer bandet ligger under. Øvre PCR bandene forbrukeravgift og renset med en gel utvinning kit. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: evaluering av det renset PCR forsterket DNET bibliotek. En liten aliquot (1 µL) av PCR forsterket cDNA biblioteket er analysert ved hjelp av en høy følsomhet DNA chip på en microfluidics-basert plattform. (A) dette panelet viser migrering av størrelse markører for kalibrering av instrumentet. (B) dette panelet viser migrering av renset PCR forsterket cDNA biblioteket. Høyeste måles i størrelse på 100 bp (se stjerne) og representerer cDNA biblioteket. Liten toppen vurdert på 72 bp av instrumentet representerer primer kortet dimers. 100 bp toppen oppdaget av microfluidics basert plattform avslører den beregnede størrelsen for forsterket cDNA biblioteket, som inneholder 18 individuelle barcoded RNA prøver for påfølgende NGS på en høy gjennomstrømming sekvensering system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: cDNA bibliotek forberedelse og neste generasjons sekvensering bruker matchet frisk frosne og formalin-fast parafin innebygd prøver. (A) Total RNA utdraget fra matchet frisk frosset og FFPE invasiv ductal karsinom (IDC) svulster ble analysert på en total RNA chip på en microfluidics basert plattform. (B) Total RNA fra matchet Lunds frossen og FFPE eksemplarer (IBC 1 og IBC2) ble cDNA biblioteket forberedelse protokollen og miRNA sekvensering dataene ble tegnet. (C) DifferentialmiRNA uttrykk mellom IBC1/IBC2 eksemplarer og sammenheng mellom frosne og FFPE sammen prøver. miRNA uttrykk vises i loggen teller per million (CPM), fra høy til lav leser (rød til blå farge). Betydningen av uttrykket forskjellen mellom de to vev parene, per miRNA, vises som grå sirkler, med høy og lav miRNAs identifisert i friske og FFPE prøver. (D) Total RNA Hentet fra matchet frisk og FFPE RNA eksemplarer av cellen linjer (MCF10A og MCF7), menneskelig invasiv bryst kreft (IBC 1 og IBC2), cervical brystvevet (Cx), arkivert normal bryst vev (normal Br1, vanlig Br2 og vanlig Br 3), og arkiverte invasiv brystkreft (IBC 5, IBC 6 og IBC7) gjennomgikk cDNA biblioteket forberedelse i samme løp. NGS data miRNAs oppdaget i biblioteker vises i en varmekartet konfigurasjon. Dette tallet har blitt endret fra Loudig et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: cDNA bibliotek forberedelse og miRNA uttrykk sammenheng mellom gjentak bruker eldre arkiverte FFPE eksemplarer. Totalt RNA fra 18, 20, 22, 27, 30 og 35-årige arkiverte FFPE bryst vevsprøver gjennomgikk våre optimalisert cDNA biblioteket forberedelse protokollen. Repliker RNA prøver fra 9 forskjellige FFPE eksemplarer ble samskrevet med ulike 3' barcoded oligonucleotides og analysert i samme bibliotek på uke 1 (w1). Samme eksperiment ble gjentatt i en ukes intervall (uke 2 eller w2). Reproduserbarhet tiltak av dupliserte miRNA uttrykk data mellom de samme arkiverte RNA prøvene vises i heatmaps og korrelasjonskoeffisienter evalueres mellom 0.93 og 0,99. Dette tallet har blitt endret fra Loudig et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En svært reproduserbare og robust cDNA biblioteket forberedelse protokoll for NGS av små RNAs arkivert i FFPE RNA prøver er presentert i denne protokollen, som er en modifisert og optimalisert versjon prosedyren beskrevet av Hafner et al. 22

Alle trinnene i denne protokollen er optimalisert for bruk med eldre arkiverte og kompromittert totale RNA utvinnes fra FFPE eksemplarer. Det viktigste trinnet i denne protokollen, for behandling av små mengder av FFPE ligger i av alle RNA prøver (dvs., 18 individuelle 100 ng FFPE RNA prøver) etter individuelle ligations med 18 unik 3' barcoded kort. Denne viktige skritt tillater 18 FFPE RNA prøvene å jevnt gjennomgå alle etterfølgende biokjemiske og enzymatiske trinnene nødvendig for utarbeidelse av det lille RNA cDNA biblioteket. I tillegg dette trinnet maksimerer mengden RNA gjennomgår precipitations og gel rene styrke carrier effekten av små RNA molekyler og tilrettelegge pellets observasjon og gel valg. En annen viktig funksjon av denne protokollen, som videre fremhever sin allsidighet når du arbeider med små mengder av FFPE, er at en pilot PCR reaksjon brukes til å identifisere optimal forsterkning syklusen av cDNA biblioteket. Dette trinnet gir også innsikt i dynamikken i biblioteket forsterkning versus primer dimer forsterkning, som er kritisk når forbereder store PCR reaksjonen og rensende liten RNA biblioteket på agarose gel. Data lagt til denne protokollen viser reproduserbarhet av denne tilnærmingen mellom matchet frossen og FFPE eksemplarer, og også markere brukbarheten til eldre FFPE RNA prøver prøver arkivert for opp til 35 år.

Denne protokollen ble endret fra den opprinnelige versjonen, så det er optimalisert for utarbeidelse av små RNA biblioteker laget av lavere kvalitet og kvantitet av kjemisk endret og utsatte FFPE. Ett aspekt av denne prosedyren som ble endret for å kunne ligate og forsterke små RNAs fra FFPE eksemplarer er relatert til mengden av kalibrator cocktail piggete under den første 3' barcoded kortet ligation, som inndata ble redusert til 0.026 nM å hindre konkurranse med ligation av lav abundancy liten RNAs presenterer i FFPE RNA prøver. En annen viktig endring i opprinnelige prosedyren var fjerning av alle radioactively merket størrelse-markører brukes under utvalg av de ligated lille RNAs på siden geléer. Bruken av disse radiolabeled størrelse-markører ikke bare begrenset til anvendelsen av denne tilnærmingen til laboratorier sertifisert for bruk av radio-isotoper men også forhindret observasjon av RNA produktene geléer. I stedet i denne optimalisert protokollen, er størrelse markører kjøre i brønner tilstøtende til biblioteket, på siden gel, og visualisert direkte med et fluorescerende fargestoff til direkte forbrukeravgift av de ligated liten RNAs. Viktigere, er fluorescerende fargestoff lett sprayet på gel å hindre spredning av RNA produktene og deretter visualisert på et blått lys boksen. Senere, som en forholdsregel og forbedre spredningen av de ligated små RNAs i forbrukeravgift siden gel fragmenter, brukes gel-breaker rør å knuse jevnt gel før inkubasjon i en NaCl løsning overnatting på 4 ° C under omrøring. Alle disse trinnene ble nøye vurdert for å arbeide med mindre mengder materiale.

Denne protokollen ble brukt FFPE RNA prøver fra ulike kilder (organer og institusjoner) som hadde vært lagret i forskjellige mengder tid. Analysene viste den høye reproduserbarhet av sekvensering små RNAs fra fersk og frossen prøver, når benytter denne optimalisert prosedyren. Flere analyser bruker eldre arkiverte FFPE prøver, lagret for opp til 35 år, ytterligere demonstrert protokollen store anvendelse for klinisk prøver. FFPE RNA input minimumskravet for FFPE prøver viste seg å være 100 ng. Dette lav kravet tillater anvendelse av denne protokollen til en rekke lesjoner i ulike størrelser og tilgjengelighet, men det ville ikke tillate analyse av enkeltcelle FFPE RNA. Det er viktig å merke seg, men at dette optimalisert protokollen har også blitt brukt med totalt RNA utvunnet fra sirkulerende exosomes med innganger på mindre enn 1 ng og for å gi svært reproduserbar liten RNA uttrykket profiler (data ikke vist). Denne lav input antyder at små RNAs i FFPE prøver, selv om det er representative for den opprinnelige ferskt vev, er tilstede i mye lavere proporsjoner enn i totale RNA sirkulere exosomes.

I nytt arbeid, hvor denne optimalisert protokollen ble brukt for klinisk klassifisert DCIS FFPE prøver, ble det funnet at miRNA uttrykk forskjeller identifisert av NGS cDNA biblioteket kan valideres av kvantitative PCR. Dette arbeidet viste muligheten for å bruke DCIS lesjoner fra arkiverte vev fra ulike institusjoner for store retrospektiv studier [20]. Denne studien også fremhevet robustheten av denne cDNA biblioteket forberedelse når utført på forskjellige tider (i intervaller på flere uker), uten at reproduserbarhet og følsomhet til analysen.

Tatt i betraktning den enorme mengden av klinisk klassifisert arkiverte FFPE gir denne optimalisert protokollen et kraftig verktøy for utarbeidelse av cDNA biblioteker i store retrospektiv analyser og potensielle identifikasjon av miRNA biomarkers assosiert med kreft utvikling21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ønsker å formidle at en publikasjon som inneholder noen av dataene som vises i dette manuskriptet ble publisert i International Journal of Molecular Sciences av Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Thomas Tuschl, leder av laboratorium for RNA molekylærbiologi og medlemmer av hans laboratorium for deres støtte og for å dele teknologien utviklet i laboratoriet og gir tilgang til rørledningen RNAworld. Vi takker også Dr. Markus Hafner for sin protokoll og gir detaljerte beskrivelser på alle biokjemiske og enzymatiske trinnene i hans første prosedyren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Tags

Genetikk problemet 135 Formalin-fast parafin-innebygd FFPE RNA degradert RNA microRNA neste generasjons sekvensering cDNA biblioteket kvantifisering PCR forsterkning T4 RNA hemorroider siden degradert RNA
Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T.,… More

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter