Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen: een combinatie van cel-gebaseerde strategie versneld perfusie met directe Paracrine levering

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Voor sommige patiënten is de enige optie voor behoud van de vruchtbaarheid cryopreservatie van eierstokweefsel. Helaas ondermijnt vertraagde revascularisatie folliculaire levensvatbaarheid. Hier presenteren we een protocol om mede de transplantatie van menselijke eierstokweefsel met endotheliale cellen voor gebruik als een cel-gebaseerde strategie combineren versnelde perfusie met een directe paracrine levering van biologische actieve moleculen.

Abstract

Onvruchtbaarheid is een frequente bijwerking van chemotherapie en/of radiotherapie en voor sommige patiënten, cryopreservatie van eicellen of embryo's is geen optie. Als alternatief, een groeiend aantal van deze patiënten kiezen om te cryopreserve van eierstokweefsel voor autograft na invordering en kwijtschelding. Ondanks verbeteringen in de resultaten onder patiënten die een auto-transplantatie cryopreserved eierstokweefsel, blijft efficiënte revascularisatie geënte weefsel een obstakel. Om te verzachten ischemie en dus resultaten in patiënten die een auto-transplantatie te verbeteren, ontwikkelden we een vasculaire cel-gebaseerde strategie om perfusie van eierstokweefsel te versnellen. Met cryopreserved ovariaal weefsel in een muismodel van xenograft beschrijven we een methode voor co transplantatie van exogene endotheliale cellen (ExECs). We breiden deze aanpak om ExECs die zijn ontworpen om te constitutively express Anti-Mullerian hormone (AMH), waardoor de aanhoudende paracrine signalering input voor ovariële transplantaten tewerk te stellen. Co transplantatie met ExECs verhoogd folliculaire volume en verbeterde follikelgroei follikel ontwikkeling en AMH-uiten ExECs bevorderd eigendomsvoorbehoud rustige primordiale follikels. Deze gecombineerde strategie kan een nuttig instrument voor beperkende ischemie en modulerende folliculaire activering in het kader van het behoud van de vruchtbaarheid en/of onvruchtbaarheid bij groot worden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanker blijft een van de belangrijkste doodsoorzaken in de ontwikkelde wereld, maar tientallen jaren onderzoek hebben aanzienlijke vooruitgang voor de meeste soorten van kanker, en in sommige gevallen bijna verdubbelde survival tarieven1opgeleverd. Helaas, chemotherapeutische agenten zijn vaak gonadotoxic, uitputting van de reserve van primordiale follikels in de eierstokken en een vermindering van de vruchtbaarheid2. Deze groeiende bevolking kan profiteren van de verschillende methoden voor het behoud van de vruchtbaarheid met inbegrip van de oöcyt en/of embryo cryopreservatie, patiënten vereisen snelle opening van kankertherapie en vooraf pubertijd patiënten zijn echter niet in aanmerking voor deze opties. Als alternatief, hebben sommige patiënten gekozen voor het cryopreserve van eierstokweefsel alvorens hun therapeutische regime, en bij herstel en vergeving, auto-verplanten weefsel herstellen vruchtbaarheid3. Echter tot op heden, blijven graft overleving en folliculaire uitvoer na auto-transplantatie relatief lage4, voornamelijk als gevolg van weefsel ischemie en hypoxie5,6,7. Ondanks de vele inspanningen ter verbetering van de levensvatbaarheid van ovariële corticale transplantaties met behulp van anti-oxidanten8,9, pro-angiogenic cytokines10,11,12,1 3, of mechanische manipulaties14, graft ischemie in een dag van 5 tot en met 7 venster na transplantatie ondermijnt de levensvatbaarheid en de overleving van de graft-7. Om aan te pakken dit, ontwikkelden we een cel-gebaseerde strategie om te vergemakkelijken wapendrager van host- en graft vaartuigen en dus haast reperfusie van eierstokweefsel.

Naast de ischemische belediging voor geënte ovariaal weefsel in het venster na transplantatie, kan de verstoring van Inter folliculaire signalering bijdragen aan de uitputting van de zwembad15,16. Omdat exogene endotheliale cellen (ExECs) tot een stabiele en goed functionerende vaartuigen in de periferie van de prothese bijdragen, presenteren ze een unieke kans om het overbrengen van een gedefinieerde moleculaire input aan getransplanteerde weefsel. Als een bewijs van beginsel, werden ExECs ontworpen om uitdrukkelijke Super fysiologische niveaus van Anti-Mullerian hormoon (AMH), een lid van de transformerende groeifactor bèta (TGFβ) superfamilie dat is aangetoond dat het beperken van de folliculaire groei17. Vergelijking van de folliculaire distributie in transplantaten samen met controle en AMH-uiten cellen getransplanteerd controleert de biologische activiteit en de potentie van gemanipuleerde exECs.

Kortom, door verbetering van de graft levensvatbaarheid en onderdrukken van vroegtijdige mobilisatie van de folliculaire pool, deze aanpak kan de productiviteit te verhogen van auto-getransplanteerde eierstokweefsel in patiënten die een behoud van de vruchtbaarheid. Bovendien kan de ExEC-gebaseerd platform experimentele ondervraging van moleculaire regelgevende instanties die zijn betrokken bij de ontwikkeling van de folliculaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan Weill Cornell Medical College. Alle xenotransplantatie experimenten met behulp van eierstokweefsel werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Menselijke eierstokweefsel werd bijeengezocht uit patiënten gepland voor chemotherapie of radiotherapie voor behandeling van kanker of voorafgaande beenmergtransplantatie. De institutionele review board (IRB) Comité van Weill Cornell Medical College keurt de collectie van weefsel voor potentiële autoloog gebruik, en bij de patiënt geïnformeerde toestemming die een donatie van maximaal 10% van hun eierstokweefsel voor gebruik in onderzoek werd uitgevoerd.

1. verzameling van menselijke eierstokweefsel

Opmerking: Wanneer een ovariaal weefsel wordt getransporteerd van de doorvoer van een externe faciliteit, tijd mag niet meer dan 5 h18,19.

  1. Verzamel de ovariaal weefsel en spoel met een steriele zoutoplossing.
  2. De eierstok plaats in een steriele container.
  3. Giet de Leibovitz L-15 medium tot het vruchtbeginsel is volledig ondergedompeld in het medium.
  4. Sluit en verzegel de container.
  5. Transport van de container in de ijskast.

2. het verwerken van de verkregen eierstokweefsel, aangepast van Schmidt et al. 18

  1. Voorbereidingen voor ovariële verwerking en bevriezing
    1. 100 mL medium voorbereiden verwerking: Leibovitz van L-15 middellange 99 mL + 1 mL antibioticum-antimycotic oplossing. Filtermedia met 0,2 µm filter. Houd het medium gekoeld.
    2. 100 mL bevriezing oplossing met behulp van DMSO als een cryo-protectant voor te bereiden. Voeg 69.64 mL Leibovitz de L-15 gemiddeld, 17.66 mL foetale runderserum (FBS), 3,42 g van sacharose (voor het maken van een uiteindelijke concentratie van 0,1 mol/L), 10.65 mL DMSO (voor het maken van een eindconcentratie van 1,5 mol/L), en 1 mL antibioticum-antimycotic oplossing. Filteren van het medium met behulp van een 150 mL filter eenheid, 0,2 µm. winkel het medium bij 4 ° C.
    3. Het steriliseren van de chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf geprogrammeerd voor een verpakte vaste stoffen sterilisatie cyclus.
  2. Bij aankomst van het weefsel
    1. Instellen van de steriele chirurgische instrumenten in het biosafety kabinet: scalpel met mes nummer 21, scherp prima gebogen schaar en pincet bij uiteenlopende maten: lange (ongeveer 150 mm lengte) en 2 middelgrote (ongeveer 110 mm lengte).
    2. Steriele handschoenen dragen, open de container binnen het biosafety kabinet. Nemen van het ovarium en plaatst u deze in een 150 mm petrischaal en giet koud medium bereid in stap 2.1.1 bovenop de eierstok om uitdroging van de ovariaal weefsel te voorkomen.
    3. Isoleren van het ovarium van eventuele resterende weefsel en spoel het met koud medium totdat het is verstoken van weefsel en bloed.
    4. Breng de eierstok in een schone 150 mm petrischaal en voeg koud medium, bereid in stap 2.1.1 totdat het vruchtbeginsel ondergedompeld in het de helft is.
  3. Dissectie van de eierstokweefsel
    1. Bisect het ovarium en de medulla eerst verwijderen door scherpe dissectie, met behulp van gebogen fijne schaar. Dan Schraap de medulla weg, gebruik een steriel scalpel met een mes het nummer 21. Voorafgaan aan totdat de corticale weefsel 1-1,5 mm in dikte is.
    2. Snijd de corticale weefsel in reepjes van 2-3 mm in de breedte, zal de lengte van de strip de gehele lengte van de ovariële stuk dat is verwerkt.

3. ovarieel weefsel traag bevriezing, aangepast van Newton et al. en Oktay et al. 6 , 20

  1. Voorbereiding voor bevriezing
    1. Label cryovials (1.8 mL).
    2. Voeg 1,5 mL van de ijskoude oplossing bereid in stap 2.1.2 aan elke flacon.
    3. Breng één corticale strip per cryogene flacon met de ijskoude oplossing.
    4. De corticale strip voor 20 min op een roterende plaat equilibreer, toepassing van zachte agitatie bij 4 ° C.
  2. Langzaam bevriezing van eierstokweefsel
    1. Laden van de cryovials in een programmeerbare planer vriezer begint bij 0 ° C.
    2. Cool op 2 ° C/min. tot-7 ° C.
    3. Houd de weefsels op deze constante temperatuur gedurende 10 minuten.
    4. Uitvoeren van handmatige zaaien voor ice crystal nucleatie inductie, door elke cryovial aan te raken met een katoen-tip ondergedompeld in vloeibare stikstof (LN2).
    5. Blijven om te koelen op 0,3 ° C/min. tot monster temperatuur-40 ° C. bereikt
    6. Cool in een sneller tempo van 10 ° C/min. tot-140 ° C.
    7. Cryovials overbrengen naar de dewar voor opslag in LN2 (196 ° c.).

4. voorbereidende werkzaamheden voor de operaties (bilaterale oöforectomie en co transplantatie)

  1. Voorbereiding van platen
    1. Een dag voorafgaand aan de eierstokweefsel voor transplantatie ontdooien
      1. Plaats een stukje van een film van kunststof paraffine aan de onderkant van een 50 mm petrischaal, spuiten met 70% Ethanol totdat het volledig zullen worden gedekt.
      2. Laat de petrischaaltjes 's nachts in het biosafety kabinet. 2 petrischalen per muis voor te bereiden.
    2. Op de dag van chirurgische ingrepen
      1. De ethanol uit de petrischaal met de plastic paraffine film binnen het kabinet biosafety gecombineerd.
      2. Laat de petrischaal leiding half open tot ethanol volledig verdampt is.
      3. Sluit het deksel van de petrischaal wanneer de kunststof paraffine-film helemaal droog is. Houd het binnen het biosafety kabinet.
      4. Label putjes van een 6 plaat goed dienovereenkomstig, 0,1 mol/L sacharose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacharose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacharose, Basic ontdooien oplossing (BTS), Medium.
  2. Bereiding van de oplossingen
    1. 100 mL BTS bereiden: Leibovitz van L-15 middellange 79 mL + FBS 20 mL + antibioticum-Antimycotic oplossing 1 mL. Filteren met een 0,22 µm filtersysteem.
    2. 10 mL van BTS met 0,1 mol/L sacharose te bereiden. Schaal 0.342 g van sacharose en voeg 10 mL van BTS bereid in stap 4.2.1, schudden zachtjes totdat de Sucrose volledig is opgelost. De oplossing met behulp van een injectiespuit filter 0,22 µm.
    3. Het bereiden van de oplossingen volgens tabel 1. Dekking van buizen met DMSO met aluminiumfolie. Gekoelde houden tot gebruik.

5. eierstokweefsel snel ontdooien

  1. Neem uit de LN2 dewar een flacon met bevroren eierstokweefsel en houd het bij kamertemperatuur voor 30 s.
  2. Veeg de flacon schoon met behulp van een papieren zakdoekje.
  3. Dompel de ampul in een waterbad van 30 ° C gedurende 1-2 min. tot de ' inhoud is ontdooid.
  4. Open de flacon en plaats van de corticale strip in de eerste put waarin 3ml van de eerste oplossing (0,1 mol/L sacharose + 1 mol/L DMSO, bereid in stap 4.2.3).
    Opmerking: Alle stappen, waarbij het deksel van de plaat te openen zal gebeuren onder laminaire flow.
  5. Incubeer de 6 goed plaat op een roterende plaat bij 4 ° C gedurende 5 min. Houd de plaat bedekt met aluminiumfolie voor deze stap.
  6. Breng de corticale strip in de tweede goed met 3 mL van de tweede oplossing (0,1 mol/L sacharose + 0,5 mol/L DMSO, bereid in stap 4.2.3).
  7. Incubeer de 6 goed plaat op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C voor 5 min. Houd de plaat bedekt met aluminiumfolie voor deze stap.
  8. Breng de corticale strip in het derde goed, met 4 mL van oplossing (BTS met 0,1 mol/L sacharose, bereid in stap 4.2.2).
  9. Incubeer op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  10. Breng de corticale strip in de vierde goed met 4 mL van oplossing (BTS, bereid in stap 4.2.1).
  11. Incubeer op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  12. Breng de corticale strip in de laatste goed met 4 mL koud medium (bereid in stap 2.1.1). Houd ontdooide eierstokweefsel op ijs tot het uitvoeren van de transplantatie.

6. de inkapseling van de eierstokweefsel

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen
    1. 25 mL 20 mmol/L HEPES-buffer in een zoutoplossing 0,9% voor te bereiden. Filter en winkel bij 4 ° C.
    2. 1 mL van CaCl2 op de concentratie van 1 mol/L. Filter voor te bereiden en bewaren bij 4 ° C.
  2. Bereiden van een stamoplossing van fibrinogeen 50 mg/mL
    1. Voeg 1 g fibrinogeen in 20 mL 20 mmol/L HEPES-buffer in de zoutoplossing 0,9% door het langzaam mengen van fibrinogeen in de HEPES gebufferde zoutoplossing over enkele uren bij 37 ° C.
    2. Label 1,7 mL micro-centrifuge buizen.
    3. Filtreer de oplossing door een 0,45 µm spuit filter en vervolgens door een 0,2 µm spuit filter.
    4. Aliquot de oplossing in 200 µL in micro-centrifuge buis en winkel bij-20 ° C.
  3. Bereiden van een stamoplossing van trombine 100 U/mL
    Opmerking: Trombine oplossingen adsorberen aan glas, aliquoot de oplossing in kunststof buizen/flesjes.
    1. Toevoegen van 2.5 mL steriele zoutoplossing 0,9% tot 250 U van trombine.
    2. Zacht schudden tot de oplossing voor het volledig los.
    3. Label 1,7 mL micro-centrifuge buizen.
    4. Filtreer door een 0,2 µm spuit filter, aliquoot 50 µL in micro-centrifuge buizen en winkel bij-80 ° C.
  4. Maak een fibrine clot van 70 µL, verkrijgen een eindconcentratie van 10 mg/mL fibrinogeen en 5 U/mL trombine
    Opmerking: Zorg ervoor dat het werk snel, de oplossing stolsels in een paar seconden. Vermijd ook de toevoeging van bubbels aan het mengsel.
    1. Bereid een fibrinogeen oplossing in een tube van 1,7 mL micro-centrifuge.
      1. Toevoegen van 360 µL van 20 mmol/L HEPES-Buffer in de zoutoplossing 0,9% tot de aliquoted 200 µL van de voorraad van fibrinogeen, bereid in stap 6.2.4.
      2. Meng door zachte pipetteren.
      3. Houd het op ijs.
    2. Bereid een trombine oplossing in een tweede micro-centrifuge buis.
      1. Toevoegen van 148.7 µL van DMEM aan de aliquoted 50 µL van de voorraad van trombine, bereid in stap 6.3.4.
      2. Meng door zachte pipetteren.
      3. Voeg 1.3 µL van 1 mol/L CaCl2.
      4. Meng door zachte pipetteren.
      5. Houd het op ijs.
    3. Maak een suspensie van eencellige, In een derde micro-centrifuge buis.
      1. Loskoppelen van de gemanipuleerde endotheliale cellen van de plaat met behulp van een enzym cel detachement medium.
      2. Spin down de en tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer met een glazen cover.
      3. 20.000 cellen per elke 1 mm2 van eierstokweefsel gebruiken. Berekenen van 20.000 x oppervlakte van eierstokweefsel in mm2.
      4. Spin down de gemanipuleerde endotheliale cellen en resuspendeer het in voedingsbodem (DMEM) tot een totaal volume van 16,8 µL.
      5. Houd het op ijs.
    4. Plaats een stukje weefsel van de eierstokken op een steriel gaas spons het drogen voor een paar seconden.
    5. Plaats het stuk van eierstokweefsel bovenop de kunststof paraffine film binnen de 50 mm petrischaal.
    6. Voeg 39.2 µL van de oplossing van fibrinogeen, bereid in stap 6.4.1.2, in de celsuspensie bereid in stap 6.4.3.4, Meng door zachte pipetteren. Houd het op ijs.
    7. Voeg 14 µL van de trombine oplossing bereid in stap 6.4.2.4. Meng zachtjes door pipetteren eens. Werk snel.
    8. Plaats het mengsel op de top van de eierstokweefsel, Pipetteer in de vorm van een langwerpige druppel.
    9. Plaats de petrischaal met de stollen in de incubator bij 37 ° C.

7. bilaterale oöforectomie en co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen NSG muizen

Opmerking: Tien tot veertien weken oude vrouwelijke NSG muizen21 werden gebruikt (Jackson Labs).

  1. Alle chirurgische tools, zoals uitgewerkt in stap 2.1.3 voorbereiden, zorg ervoor dat u alle hechtingen, pads en chirurgische banden handig.
  2. Anesthetize de muis een verdoving systeem met Isofluraan.
    1. Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van inductie, sluit deksel en open de juiste afsluiter.
    2. Open debietmeter aan 1000 mL/min. Zet de vaporizer en selecteer het te leveren 2-3,5%.
    3. Observeren van de effecten van de verdoving; verlies van bewustzijn, traag en regelmatige adem.
    4. Overbrengen naar de neus te handhaven van de verdoving. Zet de vaporizer om te verlossen 1-3%, afhankelijk van de vitale functies.
    5. Controleer of de afwezigheid van pedaal of staart reflex. Als de reflex aanwezig is, verhoog Isofluraan totdat het is afwezig.
  3. Knippen van de muis terug haar, van de staart tot de sleutelbeenderen lijn, met behulp van een elektrische tondeuse.
  4. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggend op de chirurgische platform.
  5. De neus aan het chirurgische platform met behulp van een chirurgische tape vast te stellen.
  6. De ledematen van de muis voorzichtig aan het chirurgische platform met behulp van een 1,25 cm-breed chirurgische papier tape tape.
  7. Gebruik van een steriele smeermiddel gelei en voeg een thermometer PR. Fix de thermometer door het aan het chirurgische platform met behulp van een 1,25 cm breed geperforeerde kunststof chirurgische tape vast te binden.
  8. Tape de staart naar de chirurgische platform met behulp van een 2,5 cm breed chirurgische papieren rompslomp.
  9. Warmte, met behulp van een infrarood- of een verwarming pad, warmwater en controleren van de muis lichaamstemperatuur tijdens de gehele procedure. Houden van lichaamstemperatuur binnen het bereik van 35-37 ° C.
  10. Reinig het bijgesneden gebied met een steriele Povidon-jodium oplossing wattenstokje stok en veeg met behulp van steriele alcohol prep.
  11. Herhaal stap 6,9 tweemaal meer.
  12. Breng een druppel van steriele oogbeschadigingen en/of glijmiddel dierenarts zalf over elk van de muis de ogen te beschermen tegen uitdroging en beschadiging van het hoornvlies.
  13. Dekking van de muis met behulp van een steriele chirurgische draperen.
  14. Injecteren van buprenorfine (1 mg/Kg) sub cutane (S/C).
  15. Het uitvoeren van een longitudinaal mediale dorsale incisie met behulp van een scalpel (mes #21).
  16. Een bilaterale oöforectomie uitvoeren, gebruikt u een dorsale aanpak.
    1. Gratis het onderhuids bindweefsel door botte dissectie met behulp van de schaar.
    2. Knijp de fascia lateraal aan de middellijn make een incisie en bereiken de peritoneale holte met behulp van de scherpe schaar.
    3. Pak de ovariële vet pad en het vruchtbeginsel voorzichtig met een pincet en trek hem uit de buikholte.
    4. Pak het ovarium en het vet pad met een vasculaire klem.
    5. Het afbinden van de eierstok en de vet pad met behulp van een 4/0 monofilamenten absorbeerbare Sutuur (geologie) aan de voet van de eierstok, distale naar de eileider.
    6. Clip van de eierstok distale tot het gelijkspel. Zorg ervoor dat er geen bloeden uit de basis van de stomp.
    7. Plaats het weefsel terug in de buikholte en de fascia met behulp van een gevlochten absorbeerbare hechtdraad 6/0 suture.
    8. Herhaal de fasen 7.15.1-7.15.7 aan de contralaterale zijde.
  17. Co transplantatie de eierstokweefsel.
    1. Uitvoeren van een horizontale snede in de fascia boven de Gluteus Maximus, op de lengte die de stolsels afmetingen past. Maak een zak binnen deze virtuele ruimte door het openen van de schaar onder de fascia.
    2. Pick-up een stukje ingekapselde corticale weefsel, zoals voorbereid in stap 6.4.8 en plaats het in deze zak.
    3. Sutuur (geologie) de fascia met behulp van een 6/0 gevlochten absorbeerbare hechtdraad.
  18. Herhaal de fasen 7.16.1-7.16.3 aan de contralaterale zijde ook.
  19. Sluit de dorsale muur met behulp van eenvoudige onderbroken steken met een 4/0 monofilamenten absorbeerbare hechtdraad.
  20. Lidocaïne injecteren 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C op de site van de snede.
  21. Gebruik een steriele alcohol prep te reinigen van de huid.
  22. De Isofluraan uitschakelen terwijl de muis de temperatuur te bewaken.
  23. 1-2 min van O2, zonder Isofluraan bieden. Houden aan opwarming van de aarde de muis totdat het begint te bewegen en terug te keren naar bewustzijn.
  24. Plaatst u de muisaanwijzer in een schone herstel kooi en later het huis van de muis in een aparte kooi tot de volledige genezing van de chirurgische wond.
  25. Injecteren buprenorfine (1 mg/Kg) S/C desgewenst elke 8-12 h, gedurende 24 uur postoperatief.
  26. Houd de muizen in aparte kooien wanneer alle voedsel, water, beddengoed en kooien gesteriliseerde met autoclaaf, tot het eindpunt van het experiment zijn. Houd de kooien in een hydrofoor geventileerde kamer. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen wanneer de behandeling van de muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Om te bepalen of mede transplantatie van ExECs voorziet in een uitkering aan patiënten weefsel, werden ontdooide ovariële corticale strips verdeeld in gelijke grootte stukken en bilateraal geaccepteerd in immuno-gecompromitteerd, knik scid gamma (NSG), muizen. Met één kant ingebed in een fibrine clot alleen (geen ECs) en de andere met ExECs (Figuur 1a), diende elke muis als haar eigen controle. ExECs werden verkregen via isolatie van primaire endotheel van menselijke umbilical snoeren en latere behandeling met adenovirale gene fragment E4-ORF1, als eerder beschreven22,23. Binnen passages 2-5, menselijke navelstreng ader ECs (hUVEC) werden behandeld met lentivirale deeltjes die constitutieve expressie cDNA codering het adenovirale gene fragment E4-ORF1 coderen. Deze behandeling verhoogt het voortbestaan en het angiogenic potentieel van het endotheel22,23zoals hiervoor is beschreven. Na twee weken, werden functioneel geperfundeerd schepen gevormd uit GFP-geëtiketteerden exECs op het raakvlak van gastheer weefsel en de prothese (Figuur 1b). Om het label functionele bloedvaten, werden muizen ingespoten met 100 mL lectine (0,5 mg/mL) onder Isofluraan verdoving 10 minuten vóór de oogst van het weefsel. Kwantificering van follikels op 2 weken volgende transplantatie aangetoond een significante voordelen voor relatieve follikel tellen in ExECs-bijgewoonde transplantaten, dat was duidelijk twee weken (Figuur 1 c). Exogene ECs gevormd functionele schepen wanneer mede getransplanteerde met eierstokweefsel (Figuur 1b) en corticale stukken mede getransplanteerde met de muis of menselijke ExECs steeg het aantal overlevende follikels ten opzichte van de controle transplantaties (Figuur 1 c ). Deze uitkering was verbonden aan het verminderde fibrotische gebied in ExECs-bijgewoonde transplantaties (Figuur 1 d) — van elke getransplanteerde graft, 3 delen werden gekleurd met Trichrome, een gevestigde middelen van de fibrotische weefsel24, uitgezet om te evalueren fibrotische gebied: een midden gedeelte en een gedeelte van de 600 µm-diepte van de bovenste en onderste kanten van de prothese. Gekleurde secties zijn gescand en geanalyseerd met behulp van ImageJ te kwantificeren van de oppervlakte en de fibrotische gebied was handmatig geschetst en gekwantificeerd als een percentage van de volledige prothese (ImageJ software). Resultaatwaarden werden berekend voor elk transplantaat als het gemiddelde van de 3 secties geanalyseerd. Bovenal bleek protheses die mede getransplanteerde met menselijke voorhuid fibroblasten waren arme weefsel levensvatbaarheid en relatief weinig follikels. (Figuur 1e).

Wij vervolgens beoordeeld de lange termijn functie van eierstokweefsel transplantaties met en zonder ExECs (Figuur 2ad, f, h). Na 14 weken waren de muizen gestimuleerd dagelijks met menotropins voor variabele lengtes van tijd voordat de dieren werden geofferd, met de progressie van de groei van de follikel wordt gecontroleerd in twee muizen via MRI (Figuur 2b-c). Ontwikkeling van de follikels werden vastgesteld in zowel controle (figuur 2e) en ExECs-bijgewoonde transplantaties (Figuur 2 g, ik). Meer en grotere formaat follikels werden opgemerkt in de ExECs-bijgewoonde transplantaties (Figuur 2 g, ik). Vergeleken met follikelgroei follikels afgeleid van de dezelfde weefsel, gestimuleerd met menotropins en mede getransplanteerd met ExECs, de granulosa cellaag in de meer geavanceerde follikel weergegeven verhoogde expressie van de ovulatoire markeringen CD4425 en HABP126, evenals zoals toegenomen celdood (Caspase), en verminderde proliferatie (Ki67) (figuur 2j).

Verschillende studies hebben aangetoond dat de pool van follikels voortijdig wordt geactiveerd na graft van eierstokweefsel27,28,29,30. We waargenomen een soortgelijke trend in meerdere protheses uit een enkele patiënt bij 2, 3 en 14 weken (Figuur 3a). Om te kapitaliseren op de vermoedelijke functie van AMH in het onderdrukken van activering en/of groei van de follikels17,31, we ontworpen ExECs met lentivirus constitutively express en bieden daardoor een bron van de directe paracrine van afscheiden AMH aan getransplanteerde eierstokweefsel (Figuur 3b). Lentivirale transductie verhoogd 100-fold bovenstaande GC in ExEC die anders niet detecteerbaar hoeveelheid AMH uitgedrukt. Aan de andere kant, uitgescheiden granulosa cellen tumorcellen, een basale niveau van AMH in het supernatant celkweek. (Figuur 3 c). Twee weken na de transplantatie van het Co, vaartuigen die afgeleid van ExECs werden waargenomen bij de interface van de host-graft en immunokleuring geopenbaard overvloedige AMH eiwit in het lumen van de vaartuigen die zijn afgeleid van AMH-ExECs (figuur 3d) ten opzichte van schepen gevormd uit controle ExECs. We gebruikten om te testen de functie van AMH onafhankelijk van de invloed van de pro-angiogenic van ExECs, mesenchymale stamcellen (MSC), die geïsoleerd uit fragmenten van de ovariële medulla werden. Deze cellen waren getransduceerde met lentivirale deeltjes codering AMH en uitgebreid in cultuur voor gebruik in co transplantatie. Op co transplantatie met AMH-ExECs, werd een verhoging van de 2-fold waargenomen in de verhouding van de primordiale follikels. Dit leidt echter tot een daling in het aantal primaire follikels. AMH-MSCs leiden tot verhoogde eigendomsvoorbehoud primordiale follikels door 10-fold ten opzichte van controle MSCs (figuur 3f, h). Het belangrijkste voordeel voor de bewaring van het sluimerende folliculaire zwembad werd verleend door AMH-ECs toen een vergelijking werd gemaakt tussen MSCs, ExECs, niet-cellulair transplantaties (Ctl), AMH-MSCs ExEC en AMH-ExECs (figuur 3i).

Figure 1
Figuur 1: Co transplantatie van ovariële corticale strips met ExECs verbetert de levensvatbaarheid en behoudt de folliculaire pool. (a) schema van de proefopzet. Menselijke eierstokweefsel bevroren-ontdooid was ingekapseld in een fibrine clot, met of zonder ExECs. De stolsels waren getransplanteerde in oophorectomized NSG muizen en geoogst op het eindpunt van het experiment. (b) menselijke corticale transplantaten mede getransplanteerde met hUVEC afkomstige ExECs (groen); rode bloedcellen worden aangeduid door TER-119 en de grenzen van de prothese worden uiteengezet in wit. (c) het gemiddelde percentage van de totale follikels van transplantatie met en zonder de muis of menselijke exECs + MAD. * P < 0.05. (d) het gemiddelde percentage van het fibrotische gebied van transplantatie met en zonder de muis of menselijke ExECs + MAD. ** P < 0,001. (e) vertegenwoordiger secties van ovariële transplantaten getransplanteerde samen met ExECs, zonder cellen, en menselijke voorhuid fibroblasten. Dit cijfer is gewijzigd van Man et al. Sci Rep. 2017 15 Aug; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: levensvatbaarheid op lange termijn en de functie van eierstokweefsel transplantaties zijn verbeterd door exECs. In cijfers b, c, d, f en h zijn de transplantaties aan de linkerkant de controle-no ECs, terwijl aan de rechterkant de transplantaten mede met ExECs getransplanteerde. (a) experimentele regeling voor de lange termijn xenograft van corticale eierstokweefsel. (b) In cijfers b en c, het sterretje (rechterkant) vertegenwoordigt de eierstokweefsel mede getransplanteerde met ECs, terwijl de pijlpunt (linkerkant) de eierstokweefsel met geen cellen getransplanteerd vertegenwoordigt. Muis #1 was xenografted met weefsel van een 6-jarige donor en gecontroleerd door MRI bij het begin van de stimulatie (14 weken, links) en opnieuw na tien dagen van stimulatie (15,5 weken, rechts). (c) muis #3 was xenografted met weefsel van een 19-jarige donor en gecontroleerd door MRI op 6 (20 weken na transplantatie), 7 (21 w) en 8 (22 w) weken na het begin van de stimulatie. (d) macroscopische beeld van het werk menselijke eierstokweefsel geoogst op 15,5 weken muis #1, de prothese aan de rechterkant is de ExEC-bijgewoonde prothese en een histologisch beeld van de controle-prothese in (e) wordt weergegeven. (f) macroscopische beeld van de transplantaten, muis #2 werd geofferd na 20 weken en controle en exEC-bijgewoonde transplantaties zijn geoogst voor histologisch analyse; de ExEC-bijgewoonde prothese wordt weergegeven in (g). (h) macroscopische beeld van de protheses in muis #3 die werd geofferd na 22 weken, histologisch analyse van de ExEC-bijgewoonde prothese wordt getoond in (i). (j) gedeelten van de ExEC-bijgewoonde transplantaties van muis #2 en #3 van de muis werden gekleurd voor moleculaire merkers en worden vergroot in het bijbehorende vak. Schaal bars = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Man et al. Sci Rep. 2017 15 Aug; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: ExECs ontworpen om uit te drukken AMH behouden een sluimerende folliculaire pool. (a) het aandeel van de follikels werd gekwantificeerd voor meerdere eierstokweefsel fragmenten uit de dezelfde patiënt die mede getransplanteerde met ECs voor lange en korte intervallen waren; n = 3 op 2 weken, n = 4 op 3 weken en n = 2 op 14 weken. (b) schema van de proefopzet. Menselijke eierstokweefsel bevroren-ontdooid was ingekapseld in een fibrine clot, met ExECs/MSCs getransduceerde met een RFP lentivirale deeltje bijeenkomen van een besturingselement of ExECs/MSCs getransduceerde met een AMH-mCherry-lentivirale-deeltje AMH-ECs/MSCs genereren. De stolsels waren getransplanteerde in oophorectomized NSG muizen en geoogst op 2 weken. (c) ExECs werden getransduceerde met lentivirus codering secreted menselijke AMH; cel cultuur supernatant van AMH-getransduceerde exECs was vergeleken met COV-434 cultuur granulosa-cellijn tumor en controle ExECs. (d) twee weken na de transplantatie, eierstokweefsel fragmenten die werden mede getransplanteerd met beide ECs (links) of AMH-ExECs (rechts) werden gekleurd met een antilichaam specifiek voor AMH eiwit. (e) het relatieve aandeel van de follikels in xenografts mede getransplanteerde met controle en AMH-ExECs was gekwantificeerd na 2 weken (n = 6). (f) het relatieve aandeel van de follikels in xenografts mede getransplanteerde met controle en AMH-MSCs werd gekwantificeerd na 2 weken (n = 6). (g) de mediaan + MAD van het relatieve aandeel van de follikels bedroeg vergeleken in xenografts getransplanteerde met controle en AMH-getransduceerde ExECs (n = 6) na de 2 weken. (h) het mediane + MAD relatieve aandeel van de follikels bedroeg vergeleken in xenografts getransplanteerde met controle en AMH-getransduceerde MSCs (n = 6) na de 2 weken. (i) het gemiddelde percentage van de waargenomen primordiale follikels per graft in xenografts getransplanteerde met MSCs (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), en AMH-ExECs (n = 6) werd vergeleken in totaal aan controlevoorwaarden (geen cellen, n = 15). Inzetstukken in (d) worden vergroot in de vakken aan de rechterkant voor AMH-ExECs en de opdat voor Ctl ExECs; rode en blauwe lijn lijnen in (d) een overzicht van weefsel en gastheer eierstokweefsel, respectievelijk. Foutbalken in (c) vertegenwoordigen standaardafwijking tussen 3 wordt gerepliceerd. Foutbalken in (a, g-i) vertegenwoordigen MAD tussen het aantal replicatieonderzoeken vermeld of weergegeven in de grafiek. Schaal bar = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0.005. Dit cijfer is gewijzigd van Man et al. Sci Rep. 2017 15 Aug; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Oplossing Sucrose-BTS (bereid in stap 4.2.2) in μL DMSO in μL
Sucrose-BTS met 1 mol/L DMSO 2787 213
Sucrose-BTS met 0,5 mol/L DMSO 2894 106

Tabel 1: Sacharose oplossing voorbereiding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier tonen we dat mede transplantatie van exECs biedt een aanzienlijk voordeel eierstokweefsel levensvatbaarheid en functie na xenograft in muizen. Normen voor klinische toepassing van eierstokweefsel auto-transplantatie voor behoud van de vruchtbaarheid geweest niet set en de optimale parameters (grootte, transplantatie site, duur van de graft, enz.) 32 , 33 , 34 voor verbeterde herstel van het folliculaire zwembad blijven ongedefinieerd. Vooral in de pelvische sites zoals de overgebleven eierstok, ovariële fossa of brede ligament35,36wordt avasculaire enten ontdooide corticale eierstokweefsel als auto-transplantatie wordt uitgevoerd, uitgevoerd. Aangezien geen end-to-end wapendrager plaatsvindt, wordt deze transplantatie methode resulteert in een golf van ischemische weefsel verlies en voortijdige activering van follikels woonachtig binnen de prothese. Daarom, terwijl co transplantatie met exECs leidt levering van proliferatieve endotheliale cellen waarvoor veel verdere controle tot alvorens voor klinische toepassing, deze aanpak kan versnellen weefsel revascularisatie en kan redden een robuuste aantal follikels binnen ovariële transplantaties.

Deze bevindingen naar voren gebracht een roman vasculaire cel-gebaseerde strategie voor het optimaliseren van eierstokweefsel levensvatbaarheid en functie na transplantatie. Gezien de groeiende pool van patiënten kiezen om eierstokweefsel en recente verlangt dat eierstokweefsel transplantatie cryopreserve om van experimentele status naar open klinische toepassing37,38, kan deze methode bieden een therapeutische strategie waarmee grotere levensvatbaarheid van transplantaten, waardoor het aantal ovariële corticale stroken die moet worden getransplanteerd en het vergroten van hun levensduur en/of functie.

Voortijdige werving, of "burnout", is ook gekoppeld aan de uitputting van de folliculaire zwembad tijdens chemotherapie39, evenals de volgende auto transplantatie van eierstokweefsel34. Talrijke studies hebben geconstateerd signaalroutes die functie te activeren van het onderdrukken van de folliculaire mobilisatie, en de verstoring van deze regelgevende functie kan leiden tot een massale activering van het folliculaire zwembad tijdens een kritische ischemische venster wanneer de metabolische behoeften van ontluikende follikels zijn niet in staat te worden voldaan. Toepassing van exECs in dit verband zou niet alleen versnellen reperfusie maar vanwege hun potentiële engraftment, exECs kunnen ook worden ontworpen om te zorgen voor een directe paracrine levering van factoren die directe folliculaire mobilisatie. Het idee van het gebruik van AMH als een modulator folliculaire groei door andere groepen ook is toegepast. Kano et al. geleverde AMH via beide osmotische pompen met recombinant eiwit of IP-injectie van virale deeltjes40. Deze aanpak resulteerde in een soortgelijke trend in de bewaring van de primordiale follikels, maar de levering was systemische. Als alternatief, exECs afscheidende AMH bieden een lokale en duurzame bron van AMH, de opneming van gemanipuleerde vasculaire cellen in eierstokweefsel transplantaties wordt echter beperkt door talloze risico's die samenhangen met cel-gebaseerde therapieën. Immuunrespons op vreemde antigenen op exECs is mogelijk en gebruik van proliferatieve cellen verhoogt de mogelijkheid van cellen circuleren en implanteren neoplastische groei elders in het lichaam te bevorderen. Terwijl deze beperkingen beletsel voor vertaling van deze benadering voor huidige patiënten die een auto-transplantatie, staven deze experimenten het potentieel voor invloeden van de pro-angiogenic en onderdrukking van voortijdige folliculaire mobilisatie om te vergroten de uitvoer van eierstokweefsel explantaten en stellen een robuuste xenograft model voor de mechanistische studie van de menselijke fysiologie van de eierstokken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michael Ginsberg is een vaste medewerker van Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Verenigde Staten, die geïsoleerd, transfected met E4-ORF-1 en het label van de endotheliale cellen die we gebruikten.

Acknowledgments

Omar Alexander Man voor de illustraties.
L.M. werd gesteund door een Pilot-Award van de Cornell klinische en Translational Science Center en een ASRM onderzoek subsidie.
De auteurs bedank James lab leden voor de kritische lezing van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23, (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104, (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384, (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14, (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11, (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92, (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114, (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82, (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95, (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27, (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17, (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6, (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52, (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23, (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140, (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18, (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30, (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69, (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174, (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93, (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22, (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79, (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75, (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134, (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28, (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30, (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153, (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99, (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45, (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30, (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377, (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34, (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32, (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5, (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (9), E1688-E1697 (2017).
Co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen: een combinatie van cel-gebaseerde strategie versneld perfusie met directe Paracrine levering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter