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Bioengineering

Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta Paracrine

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Per alcuni pazienti, l'unica opzione per la preservazione della fertilità è crioconservazione del tessuto ovarico. Purtroppo, in ritardo il revascularization Mina vitalità follicolare. Qui, presentiamo un protocollo per Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali per aspersione di utilizzazione come una strategia basata sulle celle che combini accelerato con una consegna di paracrine diretto di molecole bioattive.

Abstract

L'infertilità è un frequente effetto collaterale della chemioterapia e/o radioterapia e per alcuni pazienti, la crioconservazione degli ovociti o embrioni non è un'opzione. In alternativa, un numero crescente di questi pazienti scelgono di crioconservare il tessuto ovarico per autoinnesto dopo il recupero e la remissione. Malgrado i miglioramenti nei risultati fra i pazienti che subiscono il auto-trapianto di tessuto ovarico crioconservati, efficiente rivascolarizzazione del tessuto innestato rimane un ostacolo importante. Per mitigare l'ischemia e quindi migliorare i risultati in pazienti sottoposti a trapianto di auto, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellule vascolare per accelerare l'aspersione del tessuto ovarico. Descriviamo un metodo per Co-trapianto di cellule endoteliali esogene (dirigenti) con tessuto ovarico crioconservati in un modello di xenotrapianto di topo. Estendiamo questo approccio per impiegare i dirigenti che sono stati progettati per esprimono costitutivamente ormone antimulleriano (AMH), consentendo in tal modo paracrino sostenuta segnalazione ingresso agli innesti ovarici. Co-trapianto con ExECs aumentato volume follicolare e lo sviluppo di follicoli antrali migliorata e AMH-esprimendo ExECs promosso ritenzione di quiescenza follicoli primordiali. Questa strategia combinata può essere uno strumento utile per ridurre l'ischemia e modulando l'attivazione follicolare nel contesto di preservazione della fertilità e/o sterilità nel suo complesso.

Introduction

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Il cancro rimane tra le principali cause di morte nel mondo sviluppato, ma decenni di ricerca hanno prodotto progressi significativi per la maggior parte dei tipi di cancro e in alcuni casi quasi raddoppiata sopravvivenza tariffe1. Purtroppo, gli agenti chemioterapeutici sono spesso gonadotossica, che riducono la riserva di follicoli primordiali nelle ovaie e la riduzione di fertilità2. Questa popolazione in crescita possa beneficiare di vari metodi di conservazione della fertilità compreso la crioconservazione degli ovociti e/o embrione, tuttavia, i pazienti che richiedono l'inizio rapido della terapia del cancro e pre-puberali pazienti sono idonei per queste opzioni. In alternativa, alcuni pazienti hanno scelto di crioconservare il tessuto ovarico prima di intraprendere il loro regime terapeutico e al momento di recupero e la remissione, auto-trapianto di tessuto per ripristinare la fertilità3. Eppure, ad oggi, sopravvivenza dell'innesto e follicolare uscita auto-trapianto seguente rimangono relativamente basso4, principalmente a causa del tessuto ischemia e l'ipossia5,6,7. Nonostante i numerosi sforzi per migliorare la vitalità degli innesti di corticale ovarici con anti-ossidanti8,9, pro-angiogenica citochine10,11,12,1 3, o manipolazioni meccaniche14, ischemia dell'innesto in un post-trapianto di 5 a 7 giorno finestra compromette la vitalità e la sopravvivenza del trapianto7. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellulare per facilitare l'anastomosi dei vasi host e dell'innesto e accelerare così la riperfusione del tessuto ovarico.

Oltre l'insulto ischemico di tessuto ovarico innestato nella finestra del post-trapianto, la rottura della segnalazione Inter-follicolare può contribuire allo svuotamento della piscina15,16. Poiché le cellule endoteliali esogene (dirigenti) contribuiscono ai vasi stabile e funzionante nella periferia dell'innesto, presentano un'opportunità unica per trasmettere un input molecolare definito al tessuto trapiantato. Come prova di principio, dirigenti sono stati progettati per esprimere Super-fisiologici livelli di ormone antimulleriano (AMH), un membro della superfamiglia beta (TGFβ) fattore di crescita trasformante che è stato indicato per limitare la crescita follicolare17. Confronto di distribuzione follicolare negli innesti co-trapiantati con cellule esprimenti AMH e controllo verifica l'attività biologica e la potenza dei dirigenti ingegnerizzati.

In sintesi, migliorando l'innesto attuabilità e sopprimendo la mobilizzazione precoce del pool follicolare, questo approccio può aumentare la produttività di auto-trapianto di tessuto ovarico in pazienti che subiscono la preservazione della fertilità. Inoltre, la piattaforma basata su ExEC consente sperimentale interrogatorio dei regolatori molecolari che sono stati implicati nello sviluppo follicolare.

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Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) al Weill Cornell Medical College. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto utilizzando tessuto ovarico sono stati effettuati conformemente alle norme e linee guida pertinenti. Tessuto ovarico umano è stato raccolto da pazienti previsti per la chemioterapia o la radioterapia per il trattamento del cancro o trapianto di midollo osseo preventiva. Consiglio di revisione dell'istituzione (IRB) Comitato di Weill Cornell Medical College approvato l'insieme del tessuto per uso autologo potenziale e previo consenso informato del paziente che è stata effettuata una donazione fino al 10% del loro tessuto ovarico per uso di ricerca.

1. raccolta di tessuto ovarico umano

Nota: Quando un tessuto ovarico è trasportato da un transito di struttura remota, ora non deve superare 5 h18,19.

  1. Raccogliere il tessuto ovarico e sciacquare con una soluzione salina sterile.
  2. Posto dell'ovaio in un contenitore sterile.
  3. Versare mezzo L-15 di Leibovitz fino a quando l'ovaio è completamente immerso nel mezzo.
  4. Chiudere e sigillare il contenitore.
  5. Trasporto del contenitore sul ghiaccio.

2. elaborazione del tessuto ovarico procurato, adattato da Schmidt et al. 18

  1. Preparati per il trattamento ovarico e congelamento
    1. Preparare 100 mL di terreno per l'elaborazione: soluzione di antibiotico antimicotico di Leibovitz L-15 media 99 mL + 1 mL. Corpo filtrante con filtro di 0,2 µm. Mantenere il mezzo refrigerato.
    2. Preparare 100 mL di soluzione di congelamento facendo uso di DMSO come un protectant di cryo. Aggiungere L-15 medi, 17,66 mL siero bovino fetale di mL 69,64 Leibovitz (FBS), 3,42 g di saccarosio (per creare una concentrazione finale di 0,1 mol/L), 10,65 mL di DMSO (per creare una concentrazione finale di 1,5 mol/L) e 1 mL di soluzione antibiotico antimicotico. Filtrare il mezzo utilizzando un'unità filtrante di 150 mL, 0,2 µm. conservare il mezzo a 4 ° C.
    3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave programmata per un ciclo di sterilizzazione solidi avvolto.
  2. All'arrivo del tessuto
    1. Impostare gli strumenti chirurgici sterili nella biosicurezza armadietto: bisturi con lama di serie 21, affilato bene curvata forbici e pinze alle varie dimensioni: lunga (circa 150 mm di lunghezza) e 2 medie (circa 110 mm di lunghezza).
    2. Indossare guanti sterili, aprire il contenitore all'interno della cappa di biosicurezza. Prendete l'ovaio e posizionarlo in un 150mm di Petri e versare fluido freddo preparata al punto 2.1.1 in cima l'ovaio per prevenire la disidratazione del tessuto ovarico.
    3. Isolare l'ovaia da qualsiasi tessuto residuo e sciacquarlo con fluido freddo, fino a quando esso è privo di tessuto e di sangue.
    4. Posizionare l'ovaio in un pulito 150 mm piastra di Petri, aggiungere freddo medio, preparato nel passaggio 2.1.1 fino a quando l'ovaio è metà sommerso in esso.
  3. Dissezione del tessuto ovarico
    1. Bisecare ovaia e rimuovere il midollo prima di dissezione tagliente, utilizzando forbici curve bene. Poi raschiare il midollo di distanza, usando un bisturi sterile con un numero di lama 21. Precedere fino a quando il tessuto corticale è 1-1,5 mm di spessore.
    2. Tagliato il tessuto corticale a scaglie di 2-3 mm di larghezza, la lunghezza della striscia sarà l'intera lunghezza del pezzo ovarico che è stato elaborato.

3. ovarico tessuto di congelamento lento, adattato da Newton et al. e Oktay et al. 6 , 20

  1. Preparazione per il congelamento
    1. Etichetta cryovials (1,8 mL).
    2. Aggiungere 1,5 mL della soluzione di congelamento preparata al punto 2.1.2 per ogni flaconcino.
    3. Trasferire una striscia corticale per criogenico flaconcino contenente la soluzione di congelamento.
    4. Equilibrare la striscia corticale per 20 minuti su un piatto rotante, applicare delicata agitazione a 4 ° C.
  2. Congelamento lento del tessuto ovarico
    1. Caricare il cryovials in un congelatore programmabile pialla a partire da 0 ° C.
    2. Cool a 2 ° C/min-7 ° c.
    3. Mantenere i tessuti a questa temperatura costante per 10 min.
    4. Eseguire il seeding manuale per induzione di nucleazione di ghiaccio cristallo, toccando ogni cryovial con una punta di cotone immersa in azoto liquido (LN2).
    5. Continuare a raffreddare a 0,3 ° C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge-40 ° C.
    6. Cool ad un tasso più veloce di 10 ° C/min fino a-140 ° C.
    7. Trasferire cryovials dewar per deposito in LN2 (-196 ° C).

4. preparazioni per gli interventi chirurgici (Oophorectomy bilaterale e Co-trapianto)

  1. Preparazione delle piastre
    1. Un giorno prima lo scongelamento di tessuto ovarico per trapianto
      1. Posizionare un pezzo di un film di paraffina in plastica nella parte inferiore di un 50mm di Petri, spruzzarlo con 70% etanolo fino a quando non sarà completamente coperto.
      2. Lasciare le capsule di Petri durante la notte alla biosicurezza armadietto. Preparare 2 capsule di Petri per topo.
    2. Al giorno di interventi chirurgici
      1. Aspirare l'etanolo dalla capsula di Petri contenente la pellicola di plastica paraffina all'interno della cappa di biosicurezza.
      2. Lasciare il cavo di Petri aperto a metà fino a etanolo evapora completamente.
      3. Chiudere il coperchio del piatto Petri quando la pellicola di plastica di paraffina è completamente asciutta. Mantenere mobile entro la biosicurezza.
      4. Pozzi di etichetta di un 6 piastra ben conseguenza, 0,1 mol/L di saccarosio + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccarosio + 0,5 mol/L di DMSO, 0,1 mol/L saccarosio, base scongelamento soluzione (BTS), Medium.
  2. Preparazione delle soluzioni
    1. Preparare 100 mL di BTS: L-15 di Leibovitz media 79 mL + FB 20 mL + antibiotico antimicotico soluzione 1 mL. Filtrare con un sistema di filtro da 0,22 µm.
    2. Preparare 10 mL di BTS con 0,1 mol/L di saccarosio. Scala 0,342 g di saccarosio e aggiungere 10 mL di BTS preparata al punto 4.2.1, agitare delicatamente fino a quando il saccarosio è completamente sciolto. Filtrare la soluzione utilizzando una siringa filtro da 0,22 µm.
    3. Preparare le soluzioni secondo la tabella 1. Coprire le provette contenenti DMSO con carta stagnola. Conservare in frigorifero fino all'uso.

5. scongelamento rapido tessuto ovarico

  1. Tolga la LN2 dewar una fiala contenente congelati tessuto ovarico e tenerlo a temperatura ambiente per 30 s.
  2. Pulire il flaconcino utilizzando una carta velina.
  3. Immergere il flacone in un bagno d'acqua di 30 ° C per 1-2 min fino al suo ' contenuto è scongelato.
  4. Aprire il flacone e posizionare la striscia corticale nel primo pozzetto contenente 3ml di soluzione prima (saccarosio + 1 mol/L di DMSO, preparata al punto 4.2.3 0,1 mol/L).
    Nota: Tutti i passaggi che coinvolgono aprendo il coperchio della piastra saranno fatto sotto flusso laminare.
  5. Incubare la piastra ben 6 su un piatto rotante a 4 ° C per 5 min, tenere il piatto coperto con carta stagnola per questo passaggio.
  6. Trasferire la striscia corticale nella seconda contenente 3 mL della seconda soluzione (saccarosio + 0,5 mol/L di DMSO, preparata al punto 4.2.3 0,1 mol/L).
  7. Incubare la piastra ben 6 su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min, tenere il piatto coperto con carta stagnola per questo passaggio.
  8. Trasferire la striscia corticale nel terzo pozzo, contenente 4 mL di soluzione (BTS con 0,1 mol/L saccarosio, preparata al punto 4.2.2).
  9. Incubare su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min.
  10. Trasferire la striscia corticale nel quarto contenente 4 mL di soluzione (BTS, preparata al punto 4.2.1).
  11. Incubare su un piatto rotante per movimentazione delicata a 4 ° C per 5 min.
  12. Trasferire la striscia corticale nell'ultima contenente 4 mL di fluido freddo (preparata al punto 2.1.1). Mantenere il tessuto ovarico scongelato il ghiaccio fino a eseguire il trapianto.

6. incapsulamento del tessuto ovarico

  1. Preparare le seguenti soluzioni
    1. Preparare 25 mL di tampone HEPES di 20 mmol/L in soluzione fisiologica allo 0,9%. Filtrare e conservare a 4 ° C.
    2. 1 mL di CaCl2 alla concentrazione di 1 mol/L. filtro di preparare e conservare a 4 ° C.
  2. Preparare una soluzione stock di 50 mg/mL di fibrinogeno
    1. Aggiungere 1 g di fibrinogeno in 20 mL di tampone HEPES di 20 mmol/L in soluzione fisiologica 0,9% mescolando lentamente fibrinogeno all'HEPES soluzione salina tamponata sopra parecchie ore a 37 ° C.
    2. Etichetta 1,7 mL provette da micro-centrifuga.
    3. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,45 µm e poi attraverso un filtro per siringa 0,2 µm.
    4. Aliquota della soluzione in 200 µ l nella provetta con micro-centrifuga e conservare a-20 ° C.
  3. Preparare una soluzione stock di trombina 100 U/mL
    Nota: Soluzioni di trombina adsorbono al vetro, aliquota la soluzione in tubi/fiale di plastica.
    1. Aggiungere 2,5 mL di soluzione sterile salina 0,9% a 250 U di trombina.
    2. Gentle agitare fino a quando la soluzione per sciogliere completamente.
    3. Etichetta 1,7 mL provette da micro-centrifuga.
    4. Filtrare attraverso un filtro per siringa 0,2 µm, aliquotare 50 µ l in micro-provette e conservare a-80 ° C.
  4. Rendere un coagulo di fibrina di 70 µ l, ottenendo una concentrazione finale di 10 mg/mL fibrinogeno e trombina U/mL 5
    Nota: Assicurarsi di lavorare velocemente, i coaguli di soluzione in pochi secondi. Inoltre, evitare l'aggiunta di bolle per la miscela.
    1. Preparare una soluzione di fibrinogeno in una provetta da micro-centrifuga 1,7 mL.
      1. Aggiungere 360 µ l di 20 mmol/L tampone HEPES in soluzione fisiologica 0,9% all'aliquotati 200 µ l di brodo di fibrinogeno, preparata al punto 6.2.4.
      2. Mescolare pipettando delicato.
      3. Tenerlo su ghiaccio.
    2. Preparare una soluzione di trombina in un secondo tubo di micro-centrifuga.
      1. µ L 148,7 di DMEM per l'aliquotati 50 µ l del brodo della trombina, preparata al punto 6.3.4.
      2. Mescolare pipettando delicato.
      3. Aggiungere 1,3 µ l di 1 mol/L CaCl2.
      4. Mescolare pipettando delicato.
      5. Tenerlo su ghiaccio.
    3. Preparare una sospensione di singola cellula, In un terzo tubo micro-centrifuga.
      1. Staccare le cellule endoteliali derivati dalla piastra usando un mezzo di separazione cellulare enzima.
      2. Rotazione verso il basso la e contare le celle utilizzando un emocitometro con una copertura in vetro.
      3. Utilizzare 20.000 celle per ogni 1 mm2 di tessuto ovarico. Calcolare 20.000 x area di tessuto ovarico in mm2.
      4. Rotazione verso il basso le cellule endoteliali ingegnerizzate e risospendere in terreno base (DMEM) per raggiungere un volume totale di 16,8 µ l.
      5. Tenerlo su ghiaccio.
    4. Posizionare un pezzo di tessuto ovarico su una spugna garza sterile per asciugarlo per pochi secondi.
    5. Posizionare il pezzo di tessuto ovarico in cima la pellicola di plastica paraffina entro il 50mm di Petri.
    6. Aggiungere 39,2 µ l della soluzione di fibrinogeno, preparata al punto 6.4.1.2, nella sospensione cellulare preparata al punto 6.4.3.4, mix pipettando delicato. Tenerlo su ghiaccio.
    7. 14 µ l di soluzione di trombina preparata nel passaggio 6.4.2.4. Mescolare delicatamente pipettando una volta. Lavorare velocemente.
    8. Mettere il composto sopra il tessuto ovarico, dispensare sotto forma di una goccia allungata.
    9. Posizionare la piastra di Petri con il coagulo nell'incubatore a 37 ° C.

7. bilaterale Oophorectomy e Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati ai topi NSG

Nota: Dieci a quattordici-settimana-vecchio donna NSG topi21 sono stati utilizzati (Jackson Labs).

  1. Preparare tutto chirurgici strumenti, come elaborati al punto 2.1.3, assicurarsi di che avere tutte le suture, pastiglie e nastri chirurgici a portata di mano.
  2. Anestetizzare il mouse usando un sistema di anestesia con isoflurano.
    1. Posizionare il mouse nella camera di induzione, chiudere il coperchio e aprire il rubinetto di arresto appropriato.
    2. Misuratore di portata aperta a 1.000 mL/min accendere il vaporizzatore e impostarlo per consegnare 2-3,5%.
    3. Osservare gli effetti dell'anestesia; perdita di coscienza, lento e respiri regolari.
    4. Trasferire il cono di naso per mantenere l'anestesia. Girare il vaporizzatore per fornire 1-3%, a seconda dei segni vitali.
    5. Verificare l'assenza di riflesso pedale o coda. Se il riflesso è presente, è necessario aumentare isoflurano fino a quando è assente.
  3. Tagliare i capelli indietro del mouse, dalla coda fino alla linea di clavicole, utilizzando un tagliacapelli elettrico.
  4. Posizionare il mouse in una posizione prona sulla piattaforma chirurgica.
  5. Difficoltà il cono di naso alla piattaforma chirurgica usando un nastro chirurgico.
  6. Membra del mouse delicatamente alla piattaforma chirurgica utilizzando un nastro di carta chirurgica di 1,25 cm-larghezza del nastro.
  7. Utilizzare un gel lubrificante sterile e inserire un termometro Pr. Fix il termometro con nastro adesivo alla piattaforma chirurgica usando un nastro chirurgico plastica perforato larghezza di 1,25 cm.
  8. Nastro la coda alla piattaforma chirurgica utilizzando un nastro di carta chirurgica larga 2,5 cm.
  9. Di calore, utilizzando una porta a infrarossi o un cuscinetto di riscaldamento, di acqua calda e controllare la temperatura corporea del mouse durante tutta la procedura. Mantenere la temperatura corporea all'interno della gamma di 35-37 ° C.
  10. Pulire l'area di taglio con un bastoncino di Povidone-iodio soluzione sterile e asciugare utilizzando prep alcool sterile.
  11. Ripetere il passaggio 6.9 altre due volte.
  12. Mettere una goccia di Unguento veterinario lubrificante oculare sterile su ciascuno degli occhi del mouse per proteggere dalla disidratazione e danni alla cornea.
  13. Coprire il mouse usando un telo chirurgico sterile.
  14. Iniettare buprenorfina (1 mg/Kg) sub-cutaneo (S/C).
  15. Eseguire un'incisione dorsale mediale longitudinale usando un bisturi (lama #21).
  16. Eseguire un oophorectomy bilaterale, utilizzare un metodo dorsale.
    1. Liberare il tessuto connettivo sottocutaneo dissezione smussa usando le forbici.
    2. Pizzicare la fascia lateralmente e la rendono un'incisione di midline e raggiungere la cavità peritoneale, utilizzando delle forbici affilate.
    3. Afferrare il cuscinetto di grasso ovarico e l'ovaia delicatamente con una pinzetta e tirare fuori della cavità addominale.
    4. Afferrare l'ovaio e il cuscinetto di grasso con un clamp vascolari.
    5. Legare l'ovaio e il cuscinetto di grasso tramite una sutura assorbibile monofilamento di 4/0 alla base dell'ovaia, distale per le tube di Falloppio.
    6. Clip dell'ovaio distale alla cravatta. Assicurarsi che non vi è Nessun sanguinamento dalla base del ceppo.
    7. Rimettere il tessuto nella cavità addominale e suturare la fascia usando una sutura assorbibile intrecciata 6/0.
    8. Ripetere le fasi 7.15.1-7.15.7 sul lato controlaterale.
  17. Co-trapianto di tessuto ovarico.
    1. Eseguire un'incisione orizzontale nella fascia di sopra del grande gluteo, alla lunghezza che misura le dimensioni di coaguli. Creare una tasca all'interno di questo spazio virtuale aprendo le forbici sotto la fascia.
    2. Prendere un pezzo di tessuto corticale incapsulato, preparata nel passaggio 6.4.8 e inserirlo in questa tasca.
    3. Suturare la fascia usando un 6/0 intrecciato suturare assorbibile.
  18. Ripetere le fasi 7.16.1-7.16.3 al lato controlaterale.
  19. Chiudere la parete dorsale usando semplici punti interrotti con una sutura assorbibile monofilamento di 4/0.
  20. Iniettare lidocaina 0.5% (1,2 mL/Kg) S/C al sito di incisione.
  21. Utilizzare una preparazione sterile alcol per pulire la pelle.
  22. Disattivare l'isoflurano durante il monitoraggio della temperatura del mouse.
  23. Fornire 1-2 min di O2, senza isoflurano. A mantenere il riscaldamento il mouse fino a quando comincia a muoversi e tornare alla coscienza.
  24. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulito e più tardi casa il mouse in una gabbia separata fino a completa guarigione della ferita chirurgica.
  25. Iniettare buprenorfina (1 mg/Kg) S/C come necessario ogni 8-12 h, per 24 h postoperatorio.
  26. Tenere i topi in gabbie separate quando tutti cibo, acqua, biancheria da letto e gabbie sono sterilizzati in autoclave, fino al punto finale dell'esperimento. Mantenere le gabbie in una stanza ventilata pressurizzata. Utilizzare dispositivi di protezione individuale ogni volta che gestisce i topi.

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Representative Results

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Per determinare se Co-trapianto di ExECs fornisce un beneficio al tessuto dei pazienti, scongelati strisce corticale ovariche sono stati divisi in pezzi di dimensioni uguali ed engrafted bilateralmente in immuno-compromessi, gamma NOD scid (NSG), topi. Con un lato incorporato in un coagulo di fibrina da solo (nessun ECs) e l'altro contenente ExECs (Figura 1a), ogni mouse servito come il suo controllo. Dirigenti sono stati ottenuti tramite isolamento dell'endotelio primario da cordone ombelicale umani ed il trattamento successivo con frammento genico Adenoviral E4-ORF1, come descritto in precedenza22,23. All'interno di passaggi 2-5, ECs di vena ombelicale umana (hUVEC) sono stati trattati con particelle lentivirali che codificano espressione costitutiva cDNA codificante il frammento del gene adenoviral E4-ORF1. Questo trattamento migliora la sopravvivenza e il potenziale angiogenico dell'endotelio come precedentemente descritto22,23. Dopo due settimane, funzionalmente irrorati vasi erano formati da GFP-etichettato exECs all'interfaccia del tessuto ospite e l'innesto (Figura 1b). Al fine di etichettare funzionale dei vasi sanguigni, i topi sono stati iniettati con lectina di 100 mL (0,5 mg/mL) nell'ambito dell'anestesia isoflurano 10 minuti prima della raccolta del tessuto. Quantificazione dei follicoli a 2 settimane seguente trapianto hanno dimostrato un beneficio significativo al relativo follicolo contare negli innesti ExECs-assistita che era chiaramente evidente alle due settimane (Figura 1C). ECs esogeno formano vasi funzionali quando co-trapiantati con tessuto ovarico (Figura 1b) e pezzi corticale co-trapiantati con il mouse o umano ExECs aumentato il numero di follicoli superstiti relativi innesti di controllo (Figura 1 c ). Questo beneficio è stato collegato alla zona fibrotica in diminuzione negli innesti ExECs-assistita (Figura 1D) — da ogni innesto trapiantato, 3 sezioni sono state macchiate con Trichrome, un mezzi previsti per delineare il tessuto fibrotico24, per valutare area fibrotica: una sezione centrale e una sezione di profondità 600 µm da entrambi i lati superiore e inferiore dell'innesto. Sezioni macchiate sono stati scansionati e analizzati usando ImageJ per quantificare la superficie e l'area fibrotica manualmente è stato delineato e quantificato come una percentuale dell'intero innesto area (software ImageJ). I valori finali sono stati calcolati per ogni innesto come la media delle 3 sezioni analizzate. D'importanza, gli innesti che erano co-trapiantati con fibroblasti umani del prepuzio ha mostrato tessuto scarsa redditività e relativamente pochi follicoli. (Figura 1e).

Successivamente abbiamo valutato la funzione a lungo termine degli innesti di tessuto ovarico con e senza ExECs (Figura 2ad, f, h). Dopo 14 settimane, i topi erano stimolati al giorno con menotropins per lunghezze variabili di tempo prima che gli animali sono stati sacrificati, con la progressione della crescita del follicolo monitorato in due topi tramite MRI (Figura 2b-c). Follicoli in via di sviluppo sono stati notati in controllo (Figura 2e) e innesti ExECs-assistita (Figura 2 g, i). Follicoli di dimensioni più grandi e più sono stati notati in innesti ExECs-assistita (Figura 2 g, i). Rispetto ai follicoli antrali derivato dal tessuto del paziente stesso, stimolato con menotropins e co-trapiantati con ExECs, lo strato di cellule della granulosa nel follicolo più avanzato visualizzata aumentata espressione dei marcatori ovulatorie CD4425 e HABP126, come pure aumentato la morte delle cellule (caspasi) e ha ridotto la proliferazione (Ki67) (Figura 2j).

Parecchi studi hanno indicato che il pool dei follicoli è attivato prematuramente dopo trapianto di tessuto ovarico27,28,29,30. Abbiamo osservato una tendenza simile negli innesti multipli da un singolo paziente a 2, 3 e 14 settimane (Figura 3a). Per capitalizzare la presunta funzione di AMH nel reprimere l'attivazione e/o crescita di follicoli17,31, abbiamo progettato ExECs con lentivirus per esprimono costitutivamente e quindi fornire una fonte diretta di paracrine di secernere AMH per tessuto ovarico trapiantato (Figura 3b). Trasduzione lentivirale aumentato sopra 100 volte GC in ExEC che altrimenti espresso inosservabile quantità di AMH. Cellule di tumore le cellule della granulosa, secreto d'altra parte, un livello basale di AMH nel surnatante della cultura cellulare. (Figura 3C). Due settimane dopo il Co-trapianto di, vasi derivati da dirigenti sono stati osservati a livello di interfaccia host-innesto e immunostaining ha rivelato la proteina abbondante di AMH nel lume dei vasi derivato da AMH-ExECs (figura 3d) rispetto al formato da vasi controllo ExECs. Al fine di verificare la funzione di AMH indipendentemente dall'influenza pro-angiogenica del ExECs, abbiamo utilizzato le cellule staminali mesenchimali (MSC) che sono state isolate dai frammenti del midollo ovarico. Queste cellule sono state trasdotte con particelle lentivirali codifica AMH ed espanse in coltura per l'utilizzo in Co-trapianto. Dopo Co-trapianto con AMH-ExECs, è stato osservato un aumento di 2 volte nella proporzione di follicoli primordiali. Questo, tuttavia, conduce ad una diminuzione della percentuale di follicoli primari. AMH-MSCs portare a ritenzione maggiore di follicoli primordiali di 10 volte rispetto al controllo MSCs (Figura 3f, h). Il beneficio più significativo per il mantenimento del pool follicolare quiescente è stato conferito dal AMH-ECs quando è stato fatto un confronto tra MSCs, ExECs, gli innesti non-cellulare (Ctl), AMH-MSCs ExEC e AMH-ExECs (Figura 3i).

Figure 1
Figura 1: Co-trapianto delle strisce di corticale ovariche con ExECs migliora la vitalità e conserva il pool follicolare. (a) schema di disegno sperimentale. Tessuto ovarico umano congelati è stato incapsulato in un coagulo di fibrina, con o senza ExECs. I grumi sono stati trapiantati in topi NSG oophorectomized e raccolte al punto finale dell'esperimento. (b) gli innesti corticali umani co-trapiantati con ExECs hUVEC-derivato (verde); globuli rossi sono etichettati da TER-119 ed i confini dell'innesto sono descritti in bianco. (c), la percentuale mediana di follicoli totale da trapianto con e senza il mouse o umano exECs + MAD * P < 0.05. (d) la percentuale mediana dell'area fibrotica da trapianto con e senza il mouse o umano ExECs + MAD * * P < 0,001. (e) sezioni rappresentative degli innesti ovarici co-trapiantati con dirigenti, senza cellule e con fibroblasti umani del prepuzio. Questa figura è stata modificata da uomo et al. Rappresentante di sci 2017 Aug 15; 1:8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: redditività a lungo termine e la funzione degli innesti di tessuto ovarico sono migliorate da exECs. In figure b, c, d, f e h gli innesti sulla sinistra sono il controllo-no ECs, mentre sul lato destro gli innesti co-trapiantati con dirigenti. (a) schema sperimentale per a lungo termine dello xenotrapianto di tessuto corticale ovarico. (b) nelle figure b e c, l'asterisco (lato destro) rappresenta il tessuto ovarico co-trapiantato con ECs, mentre la punta della freccia (a sinistra) rappresenta il tessuto ovarico trapiantato con nessuna cellula. Mouse #1 era xenotrapiantati con tessuto da un donatore di anni 6 e monitorati da MRI all'inizio della stimolazione (14 settimane, a sinistra) e dopo dieci giorni di stimolazione (15,5 settimane, destra). (c) Mouse #3 era xenotrapiantati con tessuto da un donatore di anni 19 e monitorati da MRI a 6 (20 settimane post-trapianto), 7 (21 w) e 8 (22 w) settimane dopo l'inizio della stimolazione. (d) immagine macroscopica del tessuto ovarico umano engrafted raccolto a 15,5 settimane Mouse n. 1, l'innesto sul lato destro è l'innesto di ExEC-assistita e un'immagine istologica dell'innesto del controllo è visibile in (e). (f) immagine macroscopica degli innesti, mouse #2 è stato sacrificato dopo 20 settimane e controllo e gli innesti di exEC-assistita sono stati raccolti per l'analisi istologica; l'innesto di ExEC-assistita è mostrato (g). (h) immagine macroscopica degli innesti in mouse #3 che è stato sacrificato dopo 22 settimane, analisi istologica dell'innesto ExEC-assistita sono mostrata in (i). (j) sezioni degli innesti ExEC-assistita da Mouse #2 e #3 del Mouse sono state macchiate per marcatori molecolari e sono allargate nella casella associata. Scala bar = 100 µm. Questa figura è stata modificata da uomo et al. Rappresentante di sci 2017 Aug 15; 1:8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: ExECs ingegnerizzate ad per esprimere AMH preservare un pool follicolare quiescente. (a) la proporzione dei follicoli è stata quantificata per frammenti di tessuto ovarico multipli dallo stesso paziente che erano co-trapiantati con ECs per intervalli di breve e lunghi termine; n = 3 a 2 settimane, n = 4 a 3 settimane e n = 2 a 14 settimane. (b) schema di disegno sperimentale. Tessuto ovarico umano congelati è stato incapsulato in un coagulo di fibrina, con ExECs/MSCs trasdotte con una particelle lentivirali RFP funge come un controllo, oppure ExECs/MSCs trasdotte con una particelle lentivirali AMH-mCherry generando AMH-ECs/MSCs. I grumi sono stati trapiantati in topi NSG oophorectomized e raccolte a 2 settimane. (c) ExECs erano trasdotte con lentivirus codifica secrete AMH umana; supernatante di coltura cellulare di AMH trasdotte exECs è stato confrontato alla linea di COV-434 cultura granulosa delle cellule del tumore e controllo ExECs. (d) due settimane dopo il trapianto, frammenti di tessuto ovarico che co-sono stati trapiantati con entrambi ECs (a sinistra) o AMH-ExECs (a destra) sono stati macchiati con un anticorpo specifico per la proteina AMH. (e) la proporzione relativa di follicoli negli xenotrapianti co-trapiantati con controllo e AMH-ExECs è stata quantificata dopo 2 settimane (n = 6). (f) la proporzione relativa di follicoli negli xenotrapianti co-trapiantati con controllo e AMH-MSCs è stata quantificata dopo 2 settimane (n = 6). (g) la mediana + MAD della proporzione relativa dei follicoli è stato confrontato in xenotrapianti trapiantati con controllo e AMH trasdotte ExECs (n = 6) segue 2 settimane. (h) la proporzione relativa mediana + MAD dei follicoli è stata confrontata negli xenotrapianti trapiantati con MSCs trasdotte AMH e di controllo (n = 6) segue 2 settimane. (i) la percentuale mediana dei follicoli primordiali osservati per l'innesto in xenotrapianti trapiantati con MSCs (n = 6), dirigenti (n = 6), AMH-MSCs (n = 6) e AMH-ExECs (n = 6) è stato confrontato in forma aggregata per controllare le condizioni (nessuna cellula, n = 15). Inserti in (d) sono allargati nelle caselle a destra per AMH-ExECs e alla per timore che per Ctl ExECs; linee rosse e blu in (d) contorno tessuto ovarico di tessuto e host, rispettivamente. Barre di errore in (c) rappresentano la deviazione standard tra 3 replicati. Barre di errore in (a, g-i) rappresentare MAD tra il numero delle ripetizioni riportate nel grafico. Barra della scala = 100 µm (d). * P < 0,05, * * P < 0,005. Questa figura è stata modificata da uomo et al. Rappresentante di sci 2017 Aug 15; 1:8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione Saccarosio-BTS (preparata al punto 4.2.2) nel μL DMSO in μL
Saccarosio-BTS con 1 mol/L di DMSO 2787 213
Saccarosio-BTS con 0,5 mol/L di DMSO 2894 106

Tabella 1: Preparazione da soluzione di saccarosio.

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Discussion

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Qui dimostriamo che co-trapianti di dirigenti fornisce un beneficio significativo alla vitalità del tessuto ovarico e funzione a seguito dello xenotrapianto nei topi. Norme per l'applicazione clinica di auto-trapianto di tessuto ovarico per la preservazione della fertilità non sono stati insieme e i parametri ottimali (dimensioni, sito di trapianto, durata di innesto, ecc.) 32 , 33 , 34 per maggiore recupero del pool follicolare rimangono non definite. Quando viene eseguito la auto-trapianto, innesto avascular del scongelati tessuto corticale ovarico viene eseguita principalmente in pelvici siti quali l'ovaia restante, fossa ovarica o vasto legamento35,36. Poiché nessun anastomosi to-end avviene, questo metodo di trapianto provoca un'ondata di perdita di tessuto ischemico e attivazione prematura dei follicoli che risiedono all'interno dell'innesto. Pertanto, mentre Co-trapianto con dirigenti comporta la consegna di cellule endoteliali proliferative che richiedono molta ulteriore controllo prima di essere considerare per l'applicazione clinica, questo approccio può accelerare la rivascolarizzazione dei tessuti e può salvare una robusto proporzione dei follicoli all'interno innesti ovarici.

Questi risultati messo avanti una strategia novella di basati su cellule vascolare per l'ottimizzazione di tessuto ovarico attuabilità e la funzione che segue il trapianto. Dato il crescente bacino di pazienti scelgono di crioconservare il tessuto ovarico e chiamate recenti per il trapianto di tessuto ovarico per spostarsi dalla condizione sperimentale aprire applicazione clinica37,38, questo metodo può offrire un terapeutico strategia che consente una maggiore redditività degli innesti, riducendo così il numero di strisce di corticale ovariche che deve essere trapiantato e aumentando la loro longevità e/o funzione.

Reclutamento prematuro, o "burnout", inoltre è stato collegato per l'esaurimento del pool follicolare durante chemioterapia39, come pure le seguenti auto trapianto di tessuto ovarico34. Numerosi studi hanno identificato le vie di segnalazione quella funzione per attivare di soppressione mobilitazione follicolare, e la rottura di questa funzione di regolamentazione può provocare una massa attivazione del pool follicolare durante una finestra critica ischemica quando il esigenze metaboliche dei follicoli nascente non riescono a essere soddisfatti. Applicazione di dirigenti in questo contesto non sarebbe solo accelerare la riperfusione, ma a causa del loro potenziale di attecchimento, dirigenti possono essere progettati anche per fornire un rifornimento di paracrine diretto dei fattori quello diretto mobilizzazione follicolare. La nozione di utilizzando AMH come modulatore della crescita follicolare è stata applicata da altri gruppi, come pure. Kano et al. AMH consegnati tramite due pompe osmotiche contenente la proteina ricombinante o iniezione del IP di particelle virali40. Questi approcci ha provocato una simile tendenza nella conservazione di follicoli primordiali, ma la consegna è stata sistematica. In alternativa, exECs secernenti AMH forniscono una fonte locale e sostenuta di AMH, tuttavia, l'incorporazione di cellule ingegnerizzate vascolare negli innesti di tessuto ovarico è limitata dalla miriade dei rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. Risposta immunitaria agli antigeni stranieri su dirigenti è possibile e l'uso di cellule proliferative solleva la possibilità delle cellule circolanti, impiantare e favorire la crescita neoplastica altrove nel corpo. Mentre queste limitazioni precludono la traduzione di questo approccio corrente nei pazienti sottoposti a trapianto di auto, questi esperimenti sostegno il potenziale per influenze pro-angiogenici e la repressione di follicolare precoce mobilizzazione per aumentare l'output del tessuto ovarico innesti e stabilire un modello di xenotrapianto robusto per lo studio meccanicistico della fisiologia ovarica umana.

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Disclosures

Michael Ginsberg è un dipendente di Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Stati Uniti, che isolato, transfected con E4-ORF-1 e identificato le cellule endoteliali che abbiamo usato.

Acknowledgments

Omar Alexander Man per le illustrazioni.
L.M. era sostenuto da un pilota Award dalla clinica di Cornell e traduzione Science Center e un ASRM Assegnista di ricerca.
Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio di James per lettura critica del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta Paracrine
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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