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Bioengineering

設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

何人かの患者の妊孕性温存のための唯一のオプションは卵巣組織の凍結保存です。残念ながら、遅延の血行再建術は、濾胞性を損ないます。ここでは、共同生物活性分子の直接パラクリン配信と加速を組み合わせたセル ベースの戦略として利用循環内皮細胞とひと卵巣組織を移植するためのプロトコルを提案する.

Abstract

不妊症は化学療法および/または放射線療法の何人かの患者のための頻繁な副作用、卵子や胚の凍結保存は、オプションではありません。自家の卵巣組織の凍結保存する代わりに、これらの患者数の増加の選択次の回復と赦し。凍結保存した卵巣組織の自動移植を受ける患者の転帰の改善にもかかわらず移植組織の効率的な血行再建術の主要な障害のままです。虚血を軽減し自動移植を受ける患者の転帰を向上させる、卵巣組織の灌流を加速するための血管細胞ベースの戦略を開発しました。マウス異種移植モデルにおける卵巣組織の凍結保存と外因性血管内皮細胞 (幹部) の共同移植法について述べる。私たちは持続的なパラクリン シグナル移植卵巣への入力ができ恒常抗ミュラー管ホルモン (AMH) を表現するために設計されている幹部を採用するこのアプローチを拡張します。幹部と共同移植増加卵胞ボリュームと改良された幽門発育卵胞、AMH を表現する幹部昇格静止原始卵胞の保持。この複合戦略虚血を軽減し、妊孕性温存や大規模で不妊のコンテキストで卵胞活性化を調節することのための便利なツールがあります。

Introduction

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がんは、先進国の死の主要な原因の中ではまだ数十年の研究のほとんどの種類のがん、およびいくつかの場合 2 倍近く生存率1に向けて大きな進展が得られています。残念ながら、化学療法薬が gonadotoxic、多くの場合卵巣内の原始卵胞のリザーブを破壊し、出生率2を削減です。この人口の増加は卵子や胚の凍結保存を含む妊孕性温存のさまざまな方法の恩恵を受けることができます、ただし、がん治療、思春期前の患者の発生を必要とする患者はこれらのオプションの対象ではありません。代わりに、何人かの患者は彼らの治療を着手する前に、回復と赦し、不妊3を復元する自動移植組織に卵巣組織の凍結保存する選択しました。まだ、日には、着と卵胞出力自動移植まま組織虚血と低酸素5,67のために主に、比較的低い4。卵巣皮質移植の生存率を改善するために多くの努力にもかかわらず抗酸化物質8,9, プロ新生サイトカイン1011,12,1 を使用してください。移植後 5 に 7 日ウィンドウで3、または機械的操作14グラフトの虚血を損なう生存率および移植の7サバイバル。この問題を解決、ホストとグラフト血管の吻合を容易にし、このように卵巣組織の再灌流を早めるために細胞に基づく戦略を開発しました。

移植後ウィンドウ内移植卵巣組織に虚に加えて間卵胞シグナル伝達の混乱プール15,16の枯渇に貢献するかもしれない。外因性血管内皮細胞 (幹部) は、移植片の周囲血管の安定と機能に貢献するため、移植された組織に定義された分子入力を伝えるためにユニークな機会を提示します。原則の証拠として幹部は抗ミュラー管ホルモン (AMH) 卵胞17を制限する示されている変形の成長因子ベータ (TGFβ) スーパーファミリーのメンバーのエクスプレス超生理学的レベルに設計されました。共同管理と AMH 発現細胞移植移植で卵胞の分布の比較生物学的活性および設計された幹部の効力を検証します。

要約すると、卵胞のプールのグラフト生存し、抑制する早期動員の向上このアプローチ増やすことが患者の妊孕性温存の自動移植卵巣組織の生産性。また、ExEC ベースのプラットフォームは、卵胞の発育に関与している分子の調節物質の実験的尋問をできます。

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Protocol

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動物を対象とするすべての手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイル ・ コーネル医科大学によって承認されています。関連するガイドラインは法令に従い卵巣のティッシュを使用してすべての異種移植実験を行った。ひと卵巣組織は、化学療法や放射線治療がん治療や前骨髄移植予定の患者から採取しました。制度上の審査委員会 (IRB) 委員会のワイル ・ コーネル医科大学組織の潜在的な自己使用と彼らの卵巣組織研究用の 10% までの寄付を行った患者のインフォームド コンセントのコレクションを承認しました。

1. ひと卵巣組織のコレクション

注: リモート施設交通から卵巣組織が運ばれるとき時間を超えない 5 h18,19

  1. 卵巣の組織を収集し、溶液を滅菌生理食塩水ですすいでください。
  2. 滅菌コンテナーに卵巣を配置します。
  3. 媒体に完全に没頭して、卵巣までリーボビッツの L-15 媒体を注ぐ。
  4. 閉じ、容器を密封します。
  5. 氷の上のコンテナーを輸送します。

2. 適応シュミットから調達した卵巣組織の処理18

  1. 卵巣の処理および凍結のための準備
    1. 処理のための媒体の 100 mL の準備: リーボビッツの L-15 中 99 mL + 1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。0.2 μ m フィルターを使用してメディアをフィルターします。冷蔵中を保ちます。
    2. 低温保護剤として DMSO を使用して凍結溶液 100 mL を準備します。69.64 mL リーボビッツの L-15 中、17.66 mL ウシ胎児血清 (FBS)、ショ糖 (最終濃度 0.1 mol/L を作成)、3.42 g 10.65 mL (1.5 モル/L の最終濃度を作成する) には、DMSO を追加し、1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。150 mL フィルター ユニット、0.2 μ m ストア 4 ° C で媒体を使用してメディアをフィルターします。
    3. ラップされた固形物の滅菌サイクルのためにプログラム、オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。
  2. 組織の到着
    1. キャビネット、バイオ セーフティにおける滅菌の手術器具を設定: シャープ罰金湾曲ブレード数 21、メスのハサミ、鉗子で様々 なサイズ: ロング (約 150 mm) と中型 2 (約 110 mm)。
    2. 滅菌手袋を着用する、バイオ セーフティ キャビネット内のコンテナーを開きます。卵巣を取ると 150 mm ペトリ皿にそれを置くし、卵巣組織の脱水を防ぐために卵巣の上に 2.1.1 手順で調製した冷たい培地を注ぐ。
    3. 任意の残留組織から卵巣の分離、組織や血液を欠いてまで寒い中それをすすいでください。
    4. きれいな 150 mm のペトリ皿に卵巣を配置して、風邪を追加中、2.1.1 卵巣が半分で水没するまでのステップで準備されました。
  3. 卵巣組織の郭清
    1. 卵巣を二等分して曲線の良いはさみを使用して、シャープな郭清によって最初に髄質を削除します。滅菌メスを用いたブレード数 21 で延髄をこすり。大脳皮質組織は厚さが 1 〜 1.5 ミリメートルまでの前に。
    2. 幅 2-3 mm の千切りに大脳皮質組織をカット、ストリップの長さは処理された卵巣部分の全体の長さになります。

3. 卵巣組織遅い凍結、ニュートンから適用しました。オクタイ6,20

  1. 凍結のための準備
    1. クリオバイアル (1.8 mL) のラベルを付けます。
    2. 2.1.2 各バイアルの手順で準備凍結溶液 1.5 mL を追加します。
    3. 凍結溶液極低温バイアルあたり 1 つの皮質ストリップを転送します。
    4. 回転プレート上で 20 分間皮質のストリップを平衡させ、4 ° C で穏やかな攪拌を適用
  2. 遅い卵巣組織の凍結
    1. 0 ° C から始まるプログラム可能な平面の冷凍庫に、クリオバイアルを読み込む
    2. -7 ° C に 2 ° C/分でクールな
    3. 10 分のこの一定した温度で組織を維持します。
    4. 綿棒を液体窒素 (LN2) 中に浸漬と各クリオバイアルに触れることにより、氷結晶核形成誘導の手動シードを実行します。
    5. サンプル温度が-40 ° c. に達するまで 0.3 ° C/分で冷却し続ける
    6. -140 ° C まで 10 ° C/分の速度で冷却します。
    7. LN2 のストレージのデュワーにクリオバイアルを転送 (-196 ° C)。

4. 手術 (両側の卵巣と共同移植) のための準備

  1. プレートの準備
    1. 移植卵巣組織を融解前日
      1. 50 mm のペトリ皿の下部にプラスチック パラフィン膜の部分を置き、70% スプレー エタノールそれの完全に覆われているまで。
      2. 一晩を残す、ペトリ皿、バイオ セーフティにおけるキャビネット。マウスあたり 2 枚のペトリ皿を準備します。
    2. 手術の日
      1. シャーレ バイオ セーフティ キャビネット内プラスチック パラフィン フィルムを含むからエタノールを吸引します。
      2. エタノールが完全に蒸発するまで、ペトリ皿リードは半分開いたままにしておきます。
      3. プラスチック パラフィン フィルムが完全に乾燥するとき、シャーレの蓋を閉じます。キャビネット、バイオ セーフティ内でそれを保ちます。
      4. 6 ラベル井戸ウェル プレート、0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L DMSO、0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L 基本的な解凍ソリューション (BTS)、ショ糖培地。
  2. 溶液の調製
    1. BTS の 100 mL を準備: リーボビッツの L-15 中 79 mL + FBS 20 mL + 抗生物質抗真菌薬液 1 mL。0.22 μ m のフィルター システムをフィルター処理します。
    2. 0.1 mol/L ショ糖と BTS の 10 mL を準備します。ショ糖の 0.342 g をスケールし、BTS ステップ 4.2.1、サッカロースは完全になるまでそっと撹拌機で準備の 10 mL を追加します。シリンジ フィルター 0.22 μ m を使用して、ソリューションをフィルター処理します。
    3. 表 1に従ってソリューションを準備します。アルミ箔で DMSO を含むチューブをカバーします。使用するまで冷蔵しておきます。

5. 卵巣組織の急速な融解

  1. LN2の取るデュワー卵巣組織の凍結バイアル含む 30 の部屋の温度でそれを維持と s。
  2. バイアルをティッシュ ペーパーを使ってきれいに拭いてください。
  3. まで 1-2 分の 30 ° C の水浴のバイアルを浸しその ' コンテンツを解凍します。
  4. バイアルを開き、最初の溶液 (0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L 4.2.3 準備した DMSO) 3 ml を含む最初の井戸で皮質のストリップを配置します。
    注: 層流の下でプレートの蓋を開けるに関連するすべての手順を行います。
  5. このステップのアルミ箔で 5 分維持プレート カバー 4 ° C で回転皿の上 6 ウェル プレートを孵化させなさい。
  6. (0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、4.2.3 準備した) の 2 番目のソリューションの 2 番目も含む 3 mL に皮質のストリップを転送します。
  7. このステップのアルミ箔を 5 分保持プレート カバーの 4 ° C で穏やかな撹拌のため回転板 6 ウェル プレートを孵化させなさい。
  8. 4 mL の溶液 (0.1 mol/l ショ糖、4.2.2 準備した BTS) を含む 3 番目の井戸に皮質のストリップを転送します。
  9. 4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。
  10. ソリューション (BTS、4.2.1 の手順で準備) の 4 番目も含む 4 mL に皮質のストリップを転送します。
  11. 4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。
  12. 最後も含む (2.1.1 の手順で調製した) 冷たい培地 4 mL に皮質のストリップを転送します。氷の融解の卵巣組織を移植を実行するまでしてください。

6. 卵巣組織のカプセル化

  1. 次の解決策を準備します。
    1. 20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液 0.9% 生理食塩水中での 25 mL を準備します。フィルターし、4 ° C で保存
    2. CaCl2 1 mol/L フィルターの濃度での 1 mL を準備し、4 ° C で保存
  2. フィブリノゲン 50 mg/mL のストック溶液を調製します。
    1. 37 ° C で数時間にわたって 20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液、HEPES にフィブリノゲンをゆっくりと混合することによって 0.9% 生理食塩水 20 mL にフィブリノゲン 1 g 緩衝生理食塩水を追加します。
    2. 1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
    3. 0.45 μ m のシリンジ フィルターを通してし、0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。
    4. 200 μ L マイクロ遠心チューブに-20 ° C でストアにソリューションの約数
  3. トロンビン 100 U/mL の原液を準備します。
    注: ガラス、分注にトロンビン ソリューション吸着プラスチック チューブ/バイアルのソリューション。
    1. トロンビンの 250 U に 0.9% 生理食塩水 2.5 mL を追加します。
    2. 完全に解消するソリューションまで穏やかな揺れ。
    3. 1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
    4. 0.2 μ m のシリンジ フィルター、マイクロ遠心チューブ、-80 ° C の店に 50 μ L 分注をフィルター処理します。
  4. 70 μ L、10 mg/mL フィブリノゲンと 5 U/mL トロンビンの最終的な集中を取得のフィブリン血栓を作る
    注: 高速に動作することを確認、ソリューションが数秒で凝固します。また、泡の混合物に添加を避けます。
    1. 1.7 mL マイクロ遠心管中のフィブリノーゲン ソリューションを準備します。
      1. 360 を追加 20 ミリ モル/L の μ L HEPES バッファー フィブリノゲン株式の検体 200 μ L に 0.9% 食塩水内 6.2.4 の手順で準備します。
      2. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      3. 氷の上におきます。
    2. 番目のマイクロ遠心チューブにトロンビン溶液を準備します。
      1. トロンビン株式の検体の 50 μ L を DMEM の 148.7 μ L を追加 6.3.4 の手順で準備します。
      2. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      3. 1 mol/l CaCl21.3 μ L を追加します。
      4. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      5. 氷の上におきます。
    3. 3 番目のマイクロ遠心チューブに、単一細胞懸濁液を準備します。
      1. 酵素細胞剥離培地を用いた平板から設計された血管内皮細胞をデタッチします。
      2. スピン ・ ダウン、カバーガラスと診断を使用してセルをカウントします。
      3. 卵巣組織ごとに 1 mm2あたり 20,000 セルを使用します。Mm2の卵巣組織の 20,000 x 領域を計算します。
      4. スピン ・ ダウン設計の内皮細胞と再基本培地 (DMEM) 16.8 μ L の容量に到達するために中断します。
      5. 氷の上におきます。
    4. 数秒間乾燥滅菌ガーゼ スポンジの卵巣組織片を配置します。
    5. 50 mm のペトリ皿内プラスチック パラフィン フィルム上に卵巣の組織片を配置します。
    6. 6.4.3.4、穏やかなピペッティングによるミックスの手順で作製した細胞懸濁液に 6.4.1.2 の手順で用意して、フィブリノゲン ソリューションの 39.2 μ L を追加します。氷の上におきます。
    7. 6.4.2.4 の手順で、トロンビン溶液の 14 μ L を追加します。一度ピペットで穏やかに混合します。高速に動作します。
    8. 卵巣組織の上に混合物を配置ピペット細長い液滴の形で。
    9. 37 ° C でインキュベーターで血栓にペトリ皿を置く

7. 両側の卵巣と NSG マウスに設計された内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植

注: 10 14 週齢女性 NSG マウス21が使用された (ジャクソン研究所)。

  1. 2.1.3 の手順で詳しく述べられているのすべての手術器具を準備、縫合糸、パッド、サージカル テープ ハンディがあるかどうかを確認します。
  2. イソフルレンで麻酔システムを使用してマウスを麻酔します。
    1. 誘導チャンバーにマウスを置き、ふたを閉じ、適切なバルブを開きます。
    2. オープン流量計、気化器をオンに 1,000 mL/分にし 2-3.5% を提供するように設定します。
    3. 麻酔の効果を確認します。意識、遅いと通常呼吸の損失。
    4. 麻酔を維持するために鼻の円錐形に転送します。バイタル サインによっての 1-3% を提供する気化器をオンにします。
    5. ペダルまたはテールの反射の有無を確認します。反射が存在する場合は、それは存在しないまで、イソフルランを増やします。
  3. 電気髪トリマーを使用して鎖骨ラインまで尾からマウスの後ろの髪をトリミングします。
  4. 腹臥位手術のプラットフォーム上にマウスを配置します。
  5. サージカル テープを使用して手術のプラットフォームに鼻の円錐形を修正します。
  6. 1.25 cm wide 手術紙テープを用いた手術のプラットフォームに優しくマウスの手足をテープします。
  7. 無菌潤滑ゼリーを使用し、1.25 cm の穴あきプラスチック サージカル テープを使用して手術のプラットフォームにテーピングで広報修正温度計温度計を挿入します。
  8. テープ 2.5 cm の広範囲の外科的紙テープを用いた手術のプラットフォームに尻尾。
  9. 熱、赤外線または加熱パッド、お湯を使用し、プロシージャ全体でマウスの体温を監視します。35-37 ° c. の範囲の内で体温を保つ
  10. 滅菌ポビドン ヨード液綿棒スティックとトリム エリアをきれいにし無菌アルコール準備を使用して拭いてください。
  11. 6.9 倍の手順を繰り返します。
  12. 脱水から保護し、角膜にダメージを与えるマウスの目の各滅菌眼潤滑獣医軟膏のドロップを配置します。
  13. 滅菌手術用ドレープを使用してマウスをカバーします。
  14. ブプレノルフィン (1 mg/Kg 皮下 (S ・ C) を挿入します。
  15. メス (刃物 #21) を使用して縦内側背側切開を実行します。
  16. 両側卵巣摘出例を実行、背側アプローチを使用します。
    1. はさみを使って切開して皮下の結合組織を解放します。
    2. 正中を切開して横方向に筋膜をピンチし、鋭いはさみを使用して腹腔内に達する。
    3. 卵巣の脂肪パッドと卵巣をピンセットでそっとつかむ、腹腔内から引き出します。
    4. 血管クランプと卵巣と脂肪パッドを把握します。
    5. 卵巣と卵巣、卵管の遠位の基地で 4/0 のモノフィラメントの吸収性の縫合糸を使用して脂肪パッドを縛る。
    6. ネクタイの遠位の卵巣をクリップします。切り株の根元から出血がないかどうかを確認します。
    7. 組織を腹腔内に戻し、6/0 の編みこみ吸収性縫合糸を用いた筋膜を縫合します。
    8. ステージ側で 7.15.1-7.15.7 を繰り返します。
  17. 共同卵巣組織を移植します。
    1. 血栓の大きさに合った長さで大殿の上筋膜の横切開を実行します。筋膜の下にはさみを開くことによってこの仮想空間内でポケットを作成します。
    2. 6.4.8 の手順で準備としてカプセル化された皮質組織の 1 つの作品をピックアップし、このポケットにそれを置きます。
    3. 6/0 を使用した筋膜縫合糸は吸収性縫合糸を編組。
  18. 側同様に段階 7.16.1-7.16.3 を繰り返します。
  19. 背壁 4/0 のモノフィラメントの吸収性縫合糸で簡単な中断されたステッチを使用してを閉じます。
  20. リドカインを注入する 0.5% (1.2 mL/Kg) 切開部位で S ・ C。
  21. 滅菌アルコール準備を使用して、皮膚をきれいにします。
  22. マウスの温度を監視しながら、イソフルランをオフにします。
  23. O2、イソフルランなしの 1-2 分を提供します。それを開始する移動し、意識に戻るまでマウスを温暖化維持に。
  24. きれいに回復ケージの中にマウスを置くし、後で手術の傷の完全な治癒まで別々 のケージでマウスの家します。
  25. 術後 24 時間ごとの 8-12 h を必要に応じて、ブプレノルフィン (1 mg/Kg) S/C を挿入します。
  26. 実験の終了点まですべての食料、水、寝具、ケージ、オートクレーブときに、別ケージでマウスを飼うため。加圧換気の部屋にケージをしてください。個人用保護具を使用して、マウスを処理するたびに。

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Representative Results

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幹部の共同移植が患者の組織にメリットを提供するかどうかを決定するには、解凍卵巣皮質ストリップ サイズの等しい部分に分けられ、免疫妥協された NOD scid ガンマ (NSG) マウスに両側にしみ込んでいます。フィブリン血栓だけで (ない ECs) と含まれている幹部 (図 1 a) に埋め込まれている 1 つの側面で各マウスは独自のコントロールとして提供しています。幹部は、ひと臍帯前述の22,23としてアデノ ウイルス遺伝子のフラグメント、E4 ORF1 とその後の治療からの主な内皮細胞の分離によって得られました。2-5、ひと臍帯静脈 ECs (新生活) の通路内でエンコードの cDNA 発現アデノ ウイルス遺伝子フラグメント E4 ORF1 レンチ ウイルス粒子と扱われました。この治療は生存を強化し、血管内皮細胞の血管新生可能性が22,23を前述します。2 週間後、機能的灌流船は、ホスト組織の移植 (図 1 b) 界面における GFP 標識幹部から形作られました。機能血管をラベルするためを注入したマウス 100 mL レクチン (0.5 mg/mL) イソフルラン麻酔下で組織を採取する前に 10 分。2 週間 (図 1 c) に明らかに明白となった幹部による移植で次移植相対包へ重要な利点を示した 2 週間で卵胞の数量を数えます。外因性 ECs 機能血管の形成に共同移植卵巣組織 (図 1 b) と共同移植マウス大脳皮質の部分や人間とき幹部制御グラフト (図 1 c を基準にして残っている卵胞の数が増加).この利点は、幹部による移植 (図 1 d) で減少した線維化領域にリンクされていた-Trichrome、評価する24の線維組織の輪郭を描く確立された手段で染色した 3 つのセクションそれぞれの移植された臓器から線維化領域: 中間セクションとグラフトの上部および下の側面から 600 μ m 深さセクション。ステンド グラスのセクションをスキャンして表面積を定量化する ImageJ を用いて、線維化領域は手動で説明し、全体グラフト領域 (ImageJ ソフトウェア) の割合として算出します。最終的な値により分析の 3 つのセクションの平均として各移植求めた。重要なは、貧しい人々 の組織の生存率および比較的少数の包共同ひと包皮線維芽細胞を移植した移植片を示した。(図 1e)。

我々 は次に移植卵巣組織幹部 (図 2 a, d, f, h) との長期的な機能を評価しました。次の 14 週間マウスあった MRI (2 b を図-c) 経由で 2 つのマウスで監視されている卵胞成長の進行で、動物を犠牲にするまでの時間をさまざまな長さのためにメノトロピンで毎日刺激。卵胞が発育してコントロール (図 2 e) と幹部による移植 (図 2 gi) の両方で認められました。多くおよびより大きい大きさで分類された毛包は、幹部による移植 (図 2 g) で気づかれました。同じ患者さんの組織、メノトロピンで刺激から派生し、幹部と共同移植から胞状卵胞に比べるより高度な卵胞の顆粒膜細胞層表示25排卵マーカー CD44 の発現増加とHABP126日同様、細胞死 (カスパーゼ) を増加し、増殖 (キ67) が減少 (図 2 j)。

いくつかの研究は、卵胞のプールが途中でアクティブである卵巣組織27,28,29,30の汚職、次示されています。2、3、14 週間 (図 3 a) で 1 人の患者から複数移植で同様の傾向を観測しました。活性化および/または卵胞17,31の成長の抑制で AMH の推定機能を活用に構成を表現し、従っての直接パラクリン ソースを提供するレンチ ウイルスで幹部を設計する AMH を分泌します。移植卵巣組織 (図 3 b)。レンチ ウイルスの伝達は、AMH の検出不可能な量を表現するそれ以外の場合 ExEC で 100 上記 GC を増加しました。顆粒膜細胞腫瘍は、他の一方で、細胞培養上清中の AMH の基底レベルを分泌しました。(図 3)。共同移植後 2 週間の幹部から派生した血管ホスト接ぎ木接合部で観察し、, 免疫染色が豊富な AMH 蛋白質から形成された血管に対する AMH 幹部 (図 3 d) から派生した血管の内腔を明らかに幹部を制御します。AMH の pro 血管新生に及ぼす幹部から独立して機能をテストするために、卵巣の髄質のフラグメントから分離した間葉系幹細胞 (MSC) を使用しました。これらの細胞は、AMH をエンコーディング レンチ ウイルス粒子を導入され、共同移植用培養します。AMH 幹部と共同移植時に原始卵胞の割合 2 倍の増加が観察されました。これは、プライマリ卵胞の割合の減少が生じます。AMH MSCs はコントロール MSCs (図 3 fh) に 10 倍の相対した原始卵胞の高められた保持に します。静止卵胞プールの保持に最も重要なメリットは、MSCs では、幹部、非携帯電話移植 (Ctl) AMH MSCs ExEC と AMH 幹部 (図 3 i) 間を比較したとき、AMH ECs から授与されました。

Figure 1
図 1: 共同移植卵巣皮質ストリップの幹部生存率を改善し、卵胞のプールが保持されます。実験的なデザインの(a)の方式です。ひと卵巣組織の凍結・融解後は、フィブリン血栓、幹部の有無でカプセル化されました。血栓は NSG の間歇投与マウスに移植され、実験の終了時点で収穫します。(b)人間の皮質移植共同移植血管内皮由来幹部 (緑);テル 119 分類される赤い血球とグラフトの境界は、白で縁取られました。(c) 移植マウスまたは人間幹部 + マッドなしから合計包の中央値の割合* P < 0.05。(d)移植マウスやヒトの幹部 + マッドなしから線維化領域の中央値の割合* * P < 0.001。(e)共同移植細胞なしの幹部とひと包皮線維芽細胞移植卵巣の代表的なセクション。この図は、男から変更されています。Sci 議員 2017 8 月 15 日; 1:8203。doi: 10.1038/s41598-017-08491-z。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 幹部による長期的な生存率および移植卵巣組織の機能が改善されています。図 b、c、d、f、h の左側に移植、制御なし ECs 右側にグラフト共幹部の移植します。(a)実験的スキーム卵巣皮質組織の長期的な異種移植。(b)図 b、c でアスタリスク (右側) は、ECs、(左側) 矢印を表すセルいない移植卵巣組織間共同移植卵巣組織を表します。マウス #1 だった 6 歳のドナーからの組織と異種と刺激 (14 週間、左) と刺激 (15.5 週間、右) の 10 日後に再び発症時 MRI によって監視されています。(c)マウス #3 だった 19 歳のドナーからの組織と異種と 6 (20 週間後移植) で MRI によって監視 7 (21 w)、および 8 (22 w) 刺激の手始めの後の数週間。(d)巨視的 15.5 週間マウス #1、右側に移植で収穫される明らかな移植ひと卵巣組織像は ExEC アシスト移植とコントロールの移植片の組織学的ビューを (e) で表示。(f)移植、マウス #2 肉眼像は 20 週間後犠牲になった、制御および実行支援移植組織学的解析; ために収穫されました。ExEC による移植片は、「 (g) です。(h) 22 週間後に犠牲になったマウス #3 の移植の巨視的画像は、幹部による移植片の組織学的解析 (i) で表示されます。(j)マウス #2 およびマウス #3 から ExEC アシスト移植のセクション分子マーカーの染色し、関連するボックスで拡大しています。スケール バー = 100 μ m。この図は、男から変更されています。Sci 議員 2017 8 月 15 日; 1:8203。doi: 10.1038/s41598-017-08491-z。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: AMH を表現するために設計の幹部静止卵胞のプールを保持します(a)卵胞の割合が定量化された長期・短期間隔は ECs と共同移植、同じ患者から複数の卵巣組織断片n = 3 n 個の 2 週間、3 週間、n = 4 = 2 14 週間。(b)実験的なデザインの方式です。ひと卵巣組織の凍結・融解後は幹部/MSCs コントロールとして RFP レンチ ウイルス粒子を導入または幹部/MSCs AMH ECs/MSCs を生成する AMH mCherry レンチ ウイルス粒子を導入でフィブリン血栓でカプセル化されました。血栓は、NSG の間歇投与マウスに移植され、2 週間で収穫します。(c)幹部分泌人間 AMH; をエンコードするレンチ ウイルスを導入されました。AMH 導入幹部の細胞培養上清は、COV 434 培養顆粒膜細胞腫瘍行とコントロールの幹部に比較しました。(d)移植後 2 週間、卵巣組織の断片 (左) いずれかの ECs に移植された共同または AMH 幹部 (右) は、AMH タンパク質の特異抗体で染色しました。(e)共同管理と AMH 幹部移植異種移植片内の卵胞の相対的な割合が 2 週間後に定量化された (n = 6)。(f)共同管理と AMH MSCs 移植異種移植片内の卵胞の相対的な割合が 2 週間後に定量化された (n = 6)。(g)中央 + 包の相対的な割合の MAD をコントロールと AMH 導入幹部移植異種移植片で比較した (n = 6) 次の 2 週間。(h)卵胞の中央値 + 狂牛病の相対的な割合は、コントロールと AMH 導入 MSCs 移植異種移植片で比較した (n = 6) 次の 2 週間。(i) 、中央値、観測された原始卵胞の割合 MSCs 移植異種移植あたり (n = 6)、幹部 (n = 6)、AMH MSCs (n = 6)、および AMH 幹部 (n = 6) 集計条件を制御するを比較した (セルの n = 15)。AMH 幹部、右にあるボックスに (d) のくぼみが拡大され、傷の Ctl の幹部。(d) で赤と青のストローク ラインそれぞれ卵巣組織、ホスト組織の概要します。(C) の誤差範囲 3 複製間の標準偏差を表します。エラー バー (、g i) の複製またはグラフに示すように数の MAD を表します。スケールバー = 100 μ m (d)。* P < 0.05 * * P < 0.005。この図は、男から変更されています。Sci 議員 2017 8 月 15 日; 1:8203。doi: 10.1038/s41598-017-08491-z。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ソリューション Μ L でショ糖 BTS (4.2.2 の手順で準備) Μ L で DMSO
1 mol/L の DMSO とショ糖 BTS 2787 213
0.5 mol/L DMSO とショ糖 BTS 2894 106

表 1: ショ糖溶液製剤。

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Discussion

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ここに示す幹部の共同移植卵巣組織の生存率および機能のマウス異種移植に大きな利点があります。妊孕性温存の卵巣組織自動移植の臨床応用のための標準セットと最適なパラメーター (サイズ、移植サイト、移植等の期間) されていません。32,33,34卵胞のプールの強化された回復の未定義のまま。自動移植を実行すると、解凍の皮質卵巣組織の無血管である移植が残っている卵巣、卵巣窩または広間35,36など骨盤のサイトを中心に実行されます。端々 吻合が行われるしない、ために、この移植法は虚血性の組織の損失の波と人工血管内に存在する卵胞の早期活性化の結果します。したがって、幹部と共同の移植は、臨床応用には検討されてする前に多くのさらなる精査が必要な増殖性の内皮細胞の配信を伴います、このアプローチ復旧される組織血行を促進することができ、移植卵巣内の卵胞の堅牢な割合。

これらの調査結果は、卵巣組織の生存率および移植、次関数を最適化するため新たな血管細胞に基づく戦略を出します。患者は実験的な状態から臨床応用37,38を開くに移動する卵胞と卵巣の組織移植のための最近の呼出しを凍結保存する選ぶの成長するプールを指定すると、このメソッドを提供するかもしれない治療移植後、移植する必要が卵巣の皮質のストリップの数を減らすと、長寿や関数の増加の大きな可能性を可能にする戦略です。

早期募集または「燃え尽き症候群」は、次の自動移植卵巣組織34のと同様、化学療法39、中に卵胞のプールの枯渇にリンクされています。数多くの研究は、濾胞の動員の抑制を有効に機能するシグナル伝達経路を識別した、この調節機能の中断は重要な虚血性ウィンドウ中に卵胞のプールの質量活性化で起因できるとき、初期の卵胞の代謝の必要な満たされることができます。このコンテキストで幹部のアプリケーションはのみ再灌流を加速しないが、潜在的な生着はのための幹部はまた、直接卵胞動員要因の直接パラクリン供給を提供するために設計します。卵胞発育の変調器として AMH を活用の概念は、他のグループにも適用されています。狩野組換えタンパク質またはウイルス粒子40IP 注入を含むいずれかの浸透圧ポンプを介して配信 AMH は。これらのアプローチは、原始卵胞の保持で同様の傾向が、配信だった全身。代わりに、AMH を分泌の幹部は、AMH のローカルかつ持続的なソースを提供する、しかし、卵巣組織移植人工血管細胞の混入は、細胞ベースの治療に関連付けられている無数のリスクによって制限されます。幹部に外国の抗原への免疫反応、増殖細胞の使用セル循環、注入および身体の他の腫瘍の成長を育成の可能性を発生させます。これらの実験が強化するためにプロ血管新生の影響と未熟卵胞動員の抑制の可能性を立証する一方、これらの制限は、現在自動移植患者のこのアプローチの翻訳を排除、卵巣組織の出力は移植し、人間の卵巣の生理機能解明のための堅牢な異種移植モデルを確立します。

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Disclosures

マイケル ・ ギンズバーグは、サンディエゴ, CA, 92130、アメリカ合衆国、分離、E4 ORF 1 の標識を用いて内皮細胞サイエンス株式会社医学の従業員です。

Acknowledgments

イラストのオマール ・ アレクサンダーの男。
L.M. は、コーネル大学臨床からパイロット賞によって支えられた、臨床科学センターと、ASRM 研究助成。
著者は、論文の批判的な読みのジェームズ ・ ラボのメンバーに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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