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Bioengineering

Co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais engenharia: uma combinação de estratégia baseada em célula acelerado perfusão com entrega direta parácrina

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Para alguns pacientes, a única opção para preservação de fertilidade é a criopreservação de tecido ovariano. Infelizmente, revascularização atrasada prejudica a viabilidade folicular. Aqui, apresentamos um protocolo para co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais para utilização como uma estratégia baseada em célula combinando acelerada perfusão com uma entrega parácrina direto de moléculas bioativas.

Abstract

Infertilidade é um efeito colateral frequente da quimioterapia e/ou radioterapia e para alguns pacientes, criopreservação de oócitos ou embriões não é uma opção. Como alternativa, um número crescente destes pacientes está optando por cryopreserve tecido ovariano para autoenxerto após recuperação e remissão. Apesar das melhorias em termos de resultados entre os pacientes submetidos a autotransplante de tecido ovariano criopreservado, revascularização eficiente do tecido enxertado continua a ser um grande obstáculo. Para atenuar a isquemia e, assim, melhorar os resultados em pacientes submetidos a autotransplante, desenvolvemos uma estratégia baseada em célula vascular para acelerar a perfusão do tecido ovariano. Nós descrevemos um método para co transplante de células endoteliais exógenas (executivos) com tecido ovariano criopreservado em um modelo de enxerto heterólogo do rato. Estendemos essa abordagem para empregar os executivos que têm sido projetados para expressar constitutivamente hormônio Anti-Mulleriano (AMH), permitindo assim sustentada parácrina sinalizando a entrada para enxertos ovarianos. Transplante co com executivos aumentou volume folicular e desenvolvimento folicular antral melhorada e AMH-expressando executivos promovido retenção dos folículos primordiais quiescentes. Essa estratégia combinada pode ser uma ferramenta útil para atenuar a isquemia e modulando a ativação folicular no contexto da preservação da fertilidade e/ou infertilidade em geral.

Introduction

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Câncer permanece entre as principais causas de morte no mundo desenvolvido, no entanto, décadas de pesquisa produziram um progresso significativo para a maioria dos tipos de câncer e em alguns casos quase duplicou de sobrevivência taxas1. Infelizmente, agentes quimioterapêuticos são frequentemente gonadotoxic, esgotando a reserva de folículos primordiais nos ovários e redução da fertilidade2. Este crescimento da população pode se beneficiar de vários métodos de preservação da fertilidade, incluindo criopreservação de ovócitos e/ou embrião, no entanto, pacientes que necessitam de iniciação rápida da terapia do câncer e pacientes pré-púberes são inelegíveis para essas opções. Como alternativa, alguns pacientes têm escolhido para cryopreserve tecido ovariano, antes de empreender o seu regime terapêutico e sobre recuperação e remissão, autotransplante de tecido para restaurar a fertilidade3. Ainda, até à data, sobrevivência do enxerto e folicular saída seguindo autotransplante permanecem relativamente baixos4, principalmente devido ao tecido isquemia e hipóxia5,6,7. Apesar de inúmeros esforços para melhorar a viabilidade do enxerto cortical ovariana usando anti-oxidantes8,9, pro-angiogênico citocinas10,11,12,1 3, ou manipulações mecânicas14, isquemia de enxerto em pós-transplante uma janela de 5 a 7 dia põe em causa a viabilidade e sobrevivência do enxerto7. Para resolver isso, nós desenvolvemos uma estratégia baseada em célula para facilitar a anastomose dos vasos host e enxerto e, portanto, apressar a reperfusão do tecido ovariano.

Além o insulto isquêmico ao tecido ovariano transplantado na janela pós-transplante, o rompimento de sinalização inter folicular pode contribuir ao esgotamento do pool15,16. Porque as células endoteliais exógenas (executivos) contribuem para navios estáveis e funcionando na periferia do enxerto, eles apresentam uma oportunidade única para transmitir uma entrada molecular definida para tecido transplantado. Como prova de princípio, os executivos foram projetados para níveis expressam super fisiológicos do hormônio Anti-Mulleriano (AMH), um membro da superfamília transformadora para a beta (TGFβ) fator de crescimento que tem sido mostrado para restringir o crescimento folicular17. Comparação da distribuição folicular em enxertos co transplantado com células AMH-expressando e controle verifica a atividade biológica e a potência de executivos de engenharia.

Em resumo, melhorando o enxerto viabilidade e suprimindo a mobilização precoce do pool folicular, esta abordagem pode aumentar a produtividade de autotransplante de tecido ovariano em pacientes submetidos à preservação da fertilidade. Além disso, a plataforma baseada em ExEC permite interrogatório experimental de reguladores moleculares que têm sido implicados no desenvolvimento folicular.

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Protocol

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Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no Weill Cornell Medical College. Todos os experimentos xenotransplante usando tecido ovariano foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Tecido ovariano humano foi coletado de pacientes agendados para quimioterapia ou radioterapia para tratamento de câncer ou transplante de medula de óssea prévia. O Conselho de revisão institucional (IRB) Comitê de Weill Cornell Medical College aprovou a coleção de tecidos para potencial uso autólogo e mediante o consentimento informado do paciente, que realizou-se uma doação de até 10% de seu tecido ovariano para uso de pesquisa.

1. coleção de tecido ovariano humano

Nota: Quando um tecido ovariano é transportado de um trânsito de instalação remota, tempo não deve exceder 5 h18,19.

  1. Coletar o tecido e lave com uma solução salina estéril.
  2. Lugar do ovário em um recipiente estéril.
  3. Despeje meio de Leibovitz L-15 até o ovário está completamente imerso no meio.
  4. Fechar e selar o recipiente.
  5. Transporte do contêiner em gelo.

2. processamento do tecido ovariano suprido, adaptado de Schmidt et al . 18

  1. Preparações para processamento e congelamento de ovário
    1. Preparar 100 mL de meio para processamento: L-15 médio 99 mL + 1 mL-antibiótico antimicótico solução do Leibovitz. Filtro de mídia usando o filtro de 0,2 µm. Manter o meio refrigerado.
    2. Prepare 100 mL de solução de congelação utilizando DMSO como um cryo-protetor. Adicionar L-15 médio, mL 17,66 fetal soro bovino do 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de sacarose (para criar uma concentração final de 0,1 mol/L), mL 10,65 DMSO (para criar uma concentração final de 1,5 mol/L) e 1 mL de solução de antibiótico antimicótico. Filtrar o meio usando uma unidade de filtro de 150 mL, 0,2 µm. loja a médio a 4 ° C.
    3. Esterilize os instrumentos cirúrgicos usando uma autoclave programada para um ciclo de esterilização de sólidos envolvidos.
  2. Após a chegada do tecido
    1. Definir os instrumentos cirúrgicos estéreis na biossegurança do armário: bisturi com número 21, de lâmina afiada bem curvado tesoura e pinça em variados tamanhos: longo (cerca de 150 mm de comprimento) e 2 médias (cerca de 110 mm de comprimento).
    2. Usar luvas estéreis, abra o recipiente dentro do armário de biossegurança. Leve o ovário e colocá-lo em uma placa de Petri de 150mm e despeje meio frio, preparado na etapa 2.1.1 no topo do ovário para prevenir a desidratação do tecido ovariano.
    3. Isolar o ovário de qualquer tecido residual e enxágue-o com meio frio até que é desprovida de tecido e sangue.
    4. Coloque o ovário em um limpo e 150 mm placa de Petri, acrescente frio médio, preparado na etapa 2.1.1 até o ovário é metade submersa nele.
  3. Dissecação do tecido ovariano
    1. Bissetriz do ovário e remover a medula primeiro por dissecação afiada, usando tesouras bem curvadas. Em seguida raspe a medula, usando um bisturi estéril com um número de lâmina 21. Preceda o tecido cortical até 1-1,5 mm de espessura.
    2. Corte o tecido cortical em rodelas de 2-3 mm de largura, o comprimento da tira será de todo o comprimento da peça no ovário que foi processada.

3. ovário tecido lenta, congelamento, adaptado de Newton et al. e. Oktay et al 6 , 20

  1. Preparação para o congelamento
    1. Etiqueta cryovials (1,8 mL).
    2. Adicione 1,5 mL da solução de congelação, preparada na etapa 2.1.2 a cada frasco.
    3. Transferi uma tira cortical por criogênico frasco contendo a solução de congelação.
    4. Equilibrar a tira cortical por 20 min em um prato giratório, aplicar agitação suave a 4 ° C.
  2. Devagar, congelamento de tecido ovariano
    1. Carregar o cryovials em um congelador programável plaina começando em 0 ° C.
    2. Cool na 2 ° C/min-7 ° c.
    3. Manter os tecidos a esta temperatura constante por 10 min.
    4. Realize a semeadura manual para indução de nucleação do gelo cristal, tocando cada cryovial com uma ponta de algodão imergida em nitrogênio líquido (LN2).
    5. Continuar esfriar a 0,3 ° C/min até a temperatura da amostra atinge a-40 ° C.
    6. Legal a um ritmo de 10 ° C/min de-140 º C.
    7. Transferência de cryovials para o dewar para armazenamento em LN2 (196 ° C).

4. preparações para as cirurgias (ooforectomia Bilateral e transplante co)

  1. Preparação das placas
    1. Um dia antes de descongelar o tecido para transplante
      1. Coloque um pedaço de um filme de plástico de parafina no fundo de um prato de Petri de 50 mm, pulverizá-la com 70% etanol até será completamente coberto.
      2. Deixe os pratos de Petri durante a noite a biossegurança do armário. Prepare 2 pratos de Petri por rato.
    2. No dia da cirurgia
      1. Aspire o etanol a partir da placa de Petri contendo o filme de plástico de parafina dentro do armário de biossegurança.
      2. Deixe o prato de Petri chumbo metade aberta até etanol evapora-se completamente.
      3. Quando o filme plástico da parafina é completamente seco, feche a tampa da caixa de Petri. Mantê-lo dentro da Biossegurança do armário.
      4. Poços de rótulo de um 6 bem placa conformemente, 0,1 mol/L de sacarose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L de sacarose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacarose, básico Thawing solução (BTS), médio.
  2. Preparação das soluções
    1. Preparar 100 mL de BTS: L-15 do Leibovitz médio 79 mL + FBS 20 mL + antibiótico antimicótico solução 1 mL. Filtrar com um sistema de filtro de 0,22 µm.
    2. Prepare-se 10 mL de BTS com 0,1 mol/L de sacarose. Escala 0,342 g de sacarose e adicionar 10 mL de BTS preparado no passo 4.2.1, agitar suavemente até a sacarose é completamente dissolvida. Filtre a solução usando uma seringa filtro de 0,22 µm.
    3. Prepare as soluções de acordo com a tabela 1. Cobrir os tubos contendo DMSO com folha de alumínio. Manter refrigerado até o uso.

5. tecido descongelamento rápido

  1. Tirar o LN2 dewar um frasco contendo congelado o tecido ovariano e mantê-lo em temperatura ambiente por 30 s.
  2. Limpe o frasco usando um papel de tecido.
  3. Mergulhe o frasco em um banho de água de 30 ° C para 1-2 min até seu ' conteúdo é descongelado.
  4. Abra o frasco e coloque a fita cortical no primeiro poço que contém 3ml da solução de primeira (0,1 mol/L de sacarose + 1 mol/L DMSO, preparado na etapa 4.2.3).
    Nota: Todas as etapas que envolvem abrir a tampa da placa serão feitas sob fluxo laminar.
  5. Incube a placa bem 6 sobre um prato giratório a 4 ° C por 5 min. Mantenha a placa coberta com papel alumínio para esta etapa.
  6. Transferi a faixa cortical para o segundo bem contendo 3 mL da solução de segunda (0,1 mol/L de sacarose + 0,5 mol/L DMSO, preparado na etapa 4.2.3).
  7. Incube a placa bem 6 sobre um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min. Mantenha a placa coberta com papel alumínio para esta etapa.
  8. Transferi a tira cortical para o terceiro poço, contendo 4 mL de solução (BTS com 0.1 mol/L de sacarose, preparada na etapa 4.2.2).
  9. Incube em um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min.
  10. Transferi a faixa cortical para o quarto bem com 4 mL de solução (BTS, preparado na etapa 4.2.1).
  11. Incube em um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min.
  12. Transferi a faixa cortical para o último bem com 4 mL de meio frio (preparado na etapa 2.1.1). Mantenha o tecido ovariano descongelado no gelo até realizar o transplante.

6. encapsulamento do tecido ovariano

  1. Preparar as seguintes soluções
    1. Prepare-se 25 mL de tampão HEPES 20 mmol/L em soro fisiológico a 0,9%. Filtrar e armazenar a 4 ° C.
    2. Prepare-se 1 mL de CaCl2 na concentração de 1 mol/L. filtro e armazenar a 4 ° C.
  2. Prepare uma solução stock de 50 mg/mL de fibrinogênio
    1. Adicionar 1 g de fibrinogênio em 20 mL de tampão HEPES 20 mmol/L em solução salina 0,9%, lentamente, misturando fibrinogênio no HEPES tampão salino durante várias horas a 37 ° C.
    2. Rotule a 1,7 mL tubos de centrífuga de micro.
    3. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,45 µm e, em seguida, através de um filtro de seringa 0,2 µm.
    4. Alíquota da solução em 200 µ l no tubo de centrífuga de micro e loja a-20 ° C.
  3. Prepare uma solução stock de trombina 100 U/mL
    Nota: Soluções de trombina adsorver ao vidro, alíquota da solução em tubos/frascos plásticos.
    1. Adicione 2,5 mL de solução salina estéril 0,9% de 250 U de trombina.
    2. Agitar suave até a solução para dissolver completamente.
    3. Rotule a 1,7 mL tubos de centrífuga de micro.
    4. Filtrar com um filtro de seringa 0,2 µm, alíquota de 50 μL em tubos de centrífuga de micro e loja a-80 ° C.
  4. Fazer um coágulo de fibrina de 70 µ l, obtendo uma concentração final de 10mg/mL fibrinogênio e 5 U/mL trombina
    Nota: Certifique-se que trabalhar rápido, os solução de coágulos em poucos segundos. Além disso, evite a adição de bolhas para a mistura.
    1. Prepare uma solução de fibrinogênio em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      1. Adicionar 360 µ l de 20 mmol/L de HEPES Buffer em solução salina 0,9% para o aliquotadas 200 µ l do estoque de fibrinogênio, preparado na etapa 6.2.4.
      2. Misture pipetando suave.
      3. Mantê-lo no gelo.
    2. Prepare uma solução de trombina em um segundo tubo de centrífuga de micro.
      1. Adicionar 148.7 µ l de DMEM para o aliquotadas 50 µ l do estoque de trombina, preparado na etapa 6.3.4.
      2. Misture pipetando suave.
      3. Adicione 1,3 µ l de 1 mol/L de CaCl2.
      4. Misture pipetando suave.
      5. Mantê-lo no gelo.
    3. Prepare uma suspensão de célula única, em um tubo de centrífuga de micro terceiro.
      1. Separe as células endoteliais engenharia da placa usando um meio de desprendimento do celular de enzima.
      2. Spin para baixo o e contar as células usando um hemocytometer com um tampa de vidro.
      3. Use 20.000 células por cada 1 mm2 de tecido ovariano. Calcule 20.000 x área de tecido ovariano em mm2.
      4. Gire para baixo as células endoteliais engenharia e re-suspendê-lo em meio básico (DMEM) para alcançar um volume total de 16,8 µ l.
      5. Mantê-lo no gelo.
    4. Coloque um pedaço de tecido ovariano em uma compressa de gaze estéril para secá-la por alguns segundos.
    5. Coloque o pedaço de tecido ovariano em cima de filme plástico parafina dentro a 50 mm, placa de Petri.
    6. Adicione 39,2 µ l da solução de fibrinogênio, preparada na etapa 6.4.1.2, para a suspensão de células preparada na etapa 6.4.3.4, mistura pipetando suave. Mantê-lo no gelo.
    7. Adicione 14 µ l da solução de trombina, preparada na etapa 6.4.2.4. Misture suavemente pipetando uma vez. Trabalho rápido.
    8. Coloque a mistura em cima do tecido ovariano, pipeta sob a forma de uma gota alongada.
    9. Coloque a placa de Petri com o coágulo na incubadora a 37 ° C.

7. bilateral Oophorectomy e co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais projetados para ratos NSG

Nota: Dez a catorze semanas feminino NSG ratos21 foram usados (Jackson Labs).

  1. Preparar ferramentas tudo cirúrgicas, como elaborado na etapa 2.1.3, certifique-se de que você tem todas as suturas, almofadas e fitas cirúrgicas à mão.
  2. Anestesia o mouse usando um sistema de anestesia com isoflurano.
    1. Posicione o mouse na câmara de indução, feche a tampa e abra a torneira adequada.
    2. Medidor de fluxo aberto de 1.000 mL/min. Ligue o vaporizador e configurá-lo para entregar 2-3,5%.
    3. Observar os efeitos da anestesia; perda de consciência, lenta e respirações regulares.
    4. Transferir para o cone de nariz para manter a anestesia. Vire o vaporizador para entregar 1-3%, dependendo de sinais vitais.
    5. Verificar a ausência de reflexo de pedal ou cauda. Se o reflexo está presente, aumente o isoflurano até está ausente.
  3. Apare pelos de trás do rato, da cauda até a linha das clavículas, usando um aparador de pelos elétrico.
  4. Coloque o mouse em posição na plataforma cirúrgica.
  5. Fixe o cone de nariz à plataforma cirúrgica, usando um esparadrapo.
  6. Fita os membros do rato suavemente para a plataforma cirúrgica usando uma fita de papel cirúrgico de 1,25 cm de largura.
  7. Use uma geleia lubrificante estéril e inserir um termômetro PR. Fix o termômetro por filmá-lo para a plataforma cirúrgica usando uma fita cirúrgica plástica de 1,25 cm de largura perfurado.
  8. A cauda à plataforma cirúrgica por meio de uma fita de papel cirúrgico largura de 2,5 cm de fita.
  9. Calor, usando um infravermelho ou uma água quente, Aquecimento pad e monitorar a temperatura do corpo do rato ao longo do processo. Manter a temperatura corporal dentro da faixa de 35-37 ° C.
  10. Limpe a área aparada com um bastão de cotonete estéril solução de iodo-povidona e limpe usando prep álcool estéril.
  11. Repita a etapa 6,9 mais duas vezes.
  12. Coloque uma gota de pomada estéril vet lubrificante ocular sobre cada um dos olhos do rato, para proteger da desidratação e danificar a córnea.
  13. Cobrir o mouse usando um pano cirúrgico estéril.
  14. Injete buprenorfina (1 mg/Kg) sub-cutâneo (S/C).
  15. Realize uma incisão dorsal medial longitudinal utilizando um bisturi (lâmina #21).
  16. Executar uma ooforectomia bilateral, use uma abordagem dorsal.
    1. Livre do tecido conjuntivo subcutâneo por dissecção romba, usando a tesoura.
    2. Beliscar a fáscia lateralmente para fazer a linha mediana uma incisão e atingir a cavidade peritoneal, usando a tesoura afiada.
    3. Pegue do tecido ovariano e ovário delicadamente com uma pinça e retire-a na cavidade abdominal.
    4. Segure o ovário e a almofada de gordura com uma pinça vascular.
    5. Ligam o ovário e a almofada de gordura usando uma sutura de monofilamento de 4/0 na base do ovário, distal ao tubo de Falopio.
    6. Clip do ovário distal para o empate. Certifique-se que não há nenhum sangramento da base do coto.
    7. Coloque o tecido de volta na cavidade abdominal e sutura da fáscia usando uma sutura absorvível trançada de 6/0.
    8. Repita etapas 7.15.1-7.15.7 no lado contralateral.
  17. Co transplante de tecido ovariano.
    1. Realize uma incisão horizontal na fáscia acima nos glúteos, no comprimento que se encaixa as dimensões de coágulos. Crie um bolso dentro deste espaço virtual, abrindo a tesoura por baixo da fáscia.
    2. Pegue um pedaço de tecido cortical encapsulado, como preparado na etapa 6.4.8 e coloque-o no bolso.
    3. Sutura da fáscia usando um 6/0 trançado sutura absorvível.
  18. Repita etapas 7.16.1-7.16.3 no lado contralateral também.
  19. Feche a parede dorsal usando pontos interrompidos simples com uma sutura de monofilamento de 4/0.
  20. Injetar lidocaína 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C no local da incisão.
  21. Use um prep estéril de álcool para limpar a pele.
  22. Desligue o isoflurano enquanto monitora a temperatura do rato.
  23. Fornece 1-2 min do2, sem isoflurano. Manter por aquecimento o mouse até que ele começa a mover-se e retornar à consciência.
  24. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpo e mais tarde de casa o mouse em uma gaiola separada até a completa cicatrização da ferida cirúrgica.
  25. Injete buprenorfina (1 mg/Kg) S/C conforme necessário a cada 8-12 h, por 24 h no pós-operatório.
  26. Manter os ratos em gaiolas separadas, quando todos os alimentos, água, roupa de cama e gaiolas são autoclavadas, até o ponto final do experimento. Manter as gaiolas em recintos pressurizado. Use equipamentos de proteção individual sempre que lidar com os ratos.

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Representative Results

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Para determinar se o transplante co de executivos fornece um benefício ao tecido dos pacientes, descongeladas tiras corticais ovarianos foram divididas em pedaços de tamanhos iguais e incorporadas bilateralmente em imuno-comprometido, NOD scid gama (NSG), ratos. Com um lado incorporado em um coágulo de fibrina sozinho (sem ECs) e os outros executivos contendo (Figura 1a), cada rato serviu como seu próprio controle. Os executivos foram obtidos através do isolamento de endotélio primário de humanos cordões umbilicais e posterior tratamento com fragmento de adenovírus gene E4-ORF1, como descrito anteriormente22,23. Dentro passagens 2-5, veia umbilical humana ECs (hUVEC) foram tratados com particulas de Lentivirus que codificam a expressão constitutiva do cDNA do fragmento do gene adenovírus E4-ORF1 de codificação. Este tratamento melhora a sobrevivência e o potencial angiogênico do endotélio como descrito anteriormente22,23. Depois de duas semanas, funcionalmente perfundidos navios foram formados a partir GFP-etiquetado executivos na interface de tecido do hospedeiro e do enxerto (Figura 1b). Para rotular funcional dos vasos sanguíneos, os ratos foram injetados com lectina de 100 mL (0,5 mg/mL) sob anestesia isoflurano 10 minutos antes da colheita do tecido. Quantificação dos folículos com 2 semanas seguinte transplante demonstrou um benefício significativo para folículo relativo contar em enxertos assistido por executivos que era claramente evidente em duas semanas (Figura 1C). ECs exógenas formaram vasos funcionais quando co transplantado com tecido ovariano (Figura 1b) e peças corticais co transplantadas com o mouse ou humano executivos aumentaram o número de folículos sobreviventes em relação a enxertos de controle (Figura 1 c ). Este benefício estava relacionado com a diminuição da área fibrótica em enxertos de executivos-assistida (Figura 1D) — de cada enxerto transplantado, 3 seções foram coradas com Trichrome, meios estabelecidos de delinear o tecido fibrótico24, para avaliar fibrótica área: uma seção intermediária e uma seção de profundidade 600 µm dos lados superiores e inferiores da prótese. Seções manchadas foram escaneadas e analisaram usando o ImageJ para quantificar a área de superfície e área fibrótica manualmente foi descrita e quantificada como uma porcentagem da área inteira do enxerto (software ImageJ). Valores finais foram calculados para cada enxerto como a média das 3 seções analisados. Importante, enxertos que foram co transplantados com fibroblastos humanos prepúcio mostraram a viabilidade do tecido pobre e relativamente poucos folículos. (Figura 1e).

Em seguida, avaliamos a função a longo prazo dos enxertos de tecido ovariano com e sem os executivos (Figura 2ad, f, h). Após 14 semanas, os ratos foram estimulados diariamente com menotropins para comprimentos variáveis de tempo antes que os animais foram sacrificados, com a progressão do crescimento do folículo, sendo monitorado em dois ratos através de MRI (Figura 2b-c). Folículos em desenvolvimento foram anotados em enxertos de executivos-assistida (Figura 2 g, eu) e controle (Figura 2e). Folículos de tamanhos mais e maiores foram observados nos enxertos de executivos-assistida (Figura 2 g, eu). Em comparação com folículos antrais derivados de tecidos do mesmo paciente, estimulados com menotropins e co transplantado com executivos, a camada de células da granulosa no folículo mais avançado exibidos aumento da expressão dos marcadores ovulatória CD4425 e HABP126, bem como maior morte celular (Caspase) e reduzida proliferação (Ki67) (Figura 2j).

Vários estudos têm mostrado que o pool de folículos prematuramente é ativado após o enxerto de tecido ovariano27,28,29,30. Observamos uma tendência semelhante em vários enxertos de um único paciente com 2, 3 e 14 semanas (Figura 3a). Para capitalizar a suposta função de AMH na repressão de ativação e/ou crescimento de folículos17,31, temos engenharia executivos com lentivirus constitutivamente express e assim fornecer uma fonte direta parácrina de secretar AMH para tecido ovariano transplantado (Figura 3b). Transdução de Lentivirus aumentou 100 vezes acima GC em ExEC, que de outra forma expressa quantidades indetectáveis de AMH. Células de tumor de células da granulosa, secretada por outro lado, um nível basal de AMH no sobrenadante de cultura de pilha. (Figura 3C). Duas semanas após o transplante co, vasos derivados executivos foram observados na interface enxerto-hospedeiro e imunocoloração revelou abundante proteína AMH no lúmen dos vasos derivado AMH-executivos (Figura 3d) em relação ao formado a partir de navios controle de executivos. Para testar a função de AMH independentemente da pro-angiogênico influência dos executivos, usamos células-tronco mesenquimais (MSC) que foram isoladas a partir de fragmentos da medula ovariana. Estas células foram transfectadas com particulas de Lentivirus codificação AMH e expandidas em cultura para uso em transplante de co. Após transplante co com executivos da AMH, observou-se um aumento de 2 vezes na proporção de folículos primordiais. Isto, no entanto, leva a uma diminuição da percentagem dos folículos primários. AMH-MSCs levam à maior retenção de folículos primordiais, 10 vezes em relação ao controle MSCs (Figura 3f, h). O benefício mais significativo para a manutenção da piscina folicular quiescente foi conferido pelo AMH-ECs quando foi feita uma comparação entre MSCs, executivos, não celular enxertos (Ctl), ExEC AMH-MSCs e AMH-executivos (Figura 3i).

Figure 1
Figura 1: co transplante de ovário corticais tiras com Os executivos melhora a viabilidade e preserva o pool folicular. (a) esquema do projeto experimental. Tecido ovariano humano congelado-descongelar foi encapsulado em um coágulo de fibrina, com ou sem os executivos. Os coágulos foram transplantados em ratos oophorectomized de NSG e colhidos no ponto final do experimento. (b) humanos enxertos corticais co transplantados com executivos hUVEC-derivado (verdes); glóbulos vermelhos são rotulados por TER-119 e limites do enxerto são delineados em branco. (c), o percentual médio dos folículos totais de transplantação, com ou sem o mouse ou executivos humanos + MAD. * P < 0,05. (d) a porcentagem média da área fibrótica de transplantação, com ou sem o mouse ou humano ExECs + MAD. * * P < 0,001. (e) seções representativas dos enxertos ovarianos co transplantados com executivos, sem células e com fibroblastos humanos prepúcio. Esta figura foi modificada de homem et al Rep. Sci 2017 15 de agosto; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: função de enxertos de tecido ovariano e viabilidade a longo prazo são melhoradas por executivos. Em figuras b, c, d, f e h os enxertos à esquerda são o ECs não-controle, enquanto no lado direito os enxertos transplantaram co com executivos. (a) esquema Experimental para longo prazo enxerto de tecido cortical. (b) nas figuras b e c, o asterisco (lado direito) representa o tecido transplantado co com ECs, enquanto a ponta da seta (lado esquerdo) representa o tecido transplantado com nenhuma célula. Mouse #1 foi xenografted com o tecido de um doador de 6 anos de idade e monitorado por ressonância magnética no início da estimulação (14 semanas, esquerda) e novamente após dez dias de estimulação (15,5 semanas, certo). (c) Mouse #3 foi xenografted com o tecido de um doador de 19 anos de idade e monitorado por ressonância magnética em 6 (20 semanas pós-transplante), 7 (21 w) e 8 (22 w) semanas após o início da estimulação. (d) imagem macroscópica do tecido ovariano humano engrafted colhida em 15,5 semanas Mouse #1, o enxerto do lado direito é o enxerto ExEC-assistida e uma vista histológica do enxerto controle é mostrada em (e). (f) imagem macroscópica de enxertos, rato #2 foi sacrificada após 20 semanas e enxertos exEC-assistida e controle foram colhidos para análise histológica; o enxerto ExEC-assistida é mostrado em (g). (h) imagem macroscópica de enxertos em mouse #3, que foi sacrificado após 22 semanas, a análise histológica do enxerto ExEC-assistida é mostrada em (i). (j) seções de enxertos ExEC-assistida de Mouse #2 e #3 de Mouse foram coradas por marcadores moleculares e são ampliadas na caixa associada. Barras de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada de homem et al Rep. Sci 2017 15 de agosto; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: executivos de engenharia para expressar AMH preservar um pool folicular quiescente. (a) a proporção de folículos foi quantificada por múltiplos fragmentos de tecido ovariano do mesmo paciente que foram transplantados co com ECs para intervalos de longos e curto prazo; n = 3 em 2 semanas, n = 4 em 3 semanas e n = 2 a 14 semanas. (b) esquema do projeto experimental. Tecido ovariano humano congelado-descongelar foi encapsulado em um coágulo de fibrina, com executivos/MSCs transfectadas com uma partícula Lentivirus de RFP, servindo como um controle, ou executivos/MSCs transfectadas com uma partícula de Lentivirus AMH-mCherry gerando AMH-ECs/MSCs. Os coágulos foram transplantados em ratos oophorectomized de NSG e colhidos em 2 semanas. (c) os executivos foram transformados com lentivirus codificação secretada AMH humana; sobrenadante de cultura celular de executivos AMH-transfectadas foi comparado com a linha tumor COV-434 cultura granulosa celular e controle executivos. (d) duas semanas após o transplante, fragmentos de tecido ovariano que co foram transplantados com qualquer ECs (à esquerda) ou AMH-executivos (à direita) foram corados com um anticorpo específico para a proteína AMH. (e) a proporção relativa de folículos em xenografts co transplantados com controle e AMH-executivos foi quantificada após 2 semanas (n = 6). (f) a proporção relativa de folículos em xenografts co transplantados com controle e AMH-MSCs foi quantificada após 2 semanas (n = 6). (g) a mediana + MAD da proporção relativa de folículos foi comparado em xenografts transplantados com controle e executivos AMH-transfectadas (n = 6) após 2 semanas. (h) a mediana + MAD proporção relativa dos folículos foi comparada em xenografts transplantados com controle e AMH-transfectadas MSCs (n = 6) após 2 semanas. (i) a mediana porcentagem dos folículos primordiais observados por enxerto em xenografts transplantado com MSCs (n = 6), executivos (n = 6), AMH-MSCs (n = 6) e AMH-executivos (n = 6) foi comparado em agregado para controlar as condições (sem células, n = 15). Inserções em (d) são ampliadas nas caixas à direita para AMH-executivos e para a para que para executivos Ctl; linhas de traço vermelho e azul, em (d) delinear tecido tecido e anfitrião, respectivamente. Barras de erro em (c) representam o desvio-padrão entre 3 repetições. Barras de erro em (a, g-i) representam MAD entre o número de repetições listados ou representadas no gráfico. Barra de escala = 100 µm (d). * P < 0.05, * * P < 0.005. Esta figura foi modificada de homem et al Rep. Sci 2017 15 de agosto; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Sacarose-BTS (preparado na etapa 4.2.2) em μL DMSO em μL
Sacarose-BTS com 1 mol/L DMSO 2787 213
Sacarose-BTS com DMSO de 0,5 mol/L 2894 106

Tabela 1: Preparação de solução de sacarose.

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Discussion

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Aqui podemos demonstrar esse transplante co de executivos fornece um benefício significativo a viabilidade do tecido ovariano e função após enxerto heterólogo em camundongos. Normas para a aplicação clínica da autotransplante de tecido ovariano para preservação da fertilidade não foram conjunto e os parâmetros ideais (tamanho, local de transplante, duração do enxerto, etc.) 32 , 33 , 34 para recuperação melhorada da piscina folicular permanecem indefinidos. Quando autotransplante é realizado, avascular enxerto de tecido ovariano cortical descongelado é executada principalmente em sites pélvicas como o ovário restante, fossa ovariana ou do ligamento largo35,36. Desde que não-to-end anastomose ocorre, este método de transplante resulta em uma onda de perda de tecido isquêmico e ativação prematura dos folículos que residem dentro do enxerto. Portanto, enquanto co transplante com executivos implica a entrega de células endoteliais proliferativas que exigem muito mais controlo antes de ser considerar para a aplicação clínica, esta abordagem pode agilizar a revascularização do tecido e pode salvar uma robusta proporção dos folículos dentro dos ovários enxertos.

Estas conclusões apresentadas uma novela vascular estratégia baseada em célula para otimizar a viabilidade de tecido ovariano e função após o transplante. Dado o crescente grupo de pacientes, optando por cryopreserve chamadas recentes para transplante de tecido ovariano e tecido ovariano para mover de estatuto experimental para abrir a aplicação clínica37,38, esse método pode oferecer uma terapêutica estratégia que permite maior viabilidade dos enxertos, reduzindo assim o número de tiras corticais ovarianos que deve ser transplantado e aumentando a sua longevidade e/ou função.

Recrutamento prematuro, ou "neutralização", também tem sido associada com o esgotamento da piscina folicular durante a quimioterapia39, bem como seguir auto transplante de tecido ovariano34. Numerosos estudos têm identificado vias de sinalização essa função para ativar de suprimir a mobilização folicular, e o rompimento dessa função reguladora pode resultar em uma ativação em massa da piscina folicular durante uma janela de isquemia crítica quando o necessidades metabólicas de folículos nascentes são incapazes de ser atendidos. Aplicação de executivos neste contexto não apenas aceleraria reperfusão, mas devido ao seu potencial de enxertia, executivos também podem ser projetados para fornecer um fornecimento direto parácrina de fatores essa mobilização direta folicular. A noção de utilizando AMH como um modulador do crescimento folicular tem sido aplicada por outros grupos também. Kano et al AMH entregue através de qualquer osmóticos bombas contendo proteínas recombinantes ou IP injeção de partículas virais40. Essas abordagens resultaram em uma tendência similar na retenção dos folículos primordiais, mas a entrega foi sistêmica. Como alternativa, executivos secretando AMH fornecem uma fonte local e sustentada de AMH, no entanto, a incorporação de células vasculares projetadas em enxertos de tecido ovariano é limitada pelos inúmeros riscos associados a terapias baseadas em células. Resposta imune a antígenos estranhos em executivos é possível e o uso de células proliferativas levanta a possibilidade de células circulantes, implantar e promover crescimento neoplásico em outras partes do corpo. Enquanto estas limitações impedem tradução desta abordagem para atuais pacientes submetidos a autotransplante, estas experiências substanciar o potencial de pro-angiogênico influências e repressão de mobilização folicular precoce para aumentar a saída do tecido ovariano enxertos e estabelecer um modelo de xenoenxertos robusto para o estudo mecanicista da fisiologia ovariana humana.

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Disclosures

Michael Ginsberg é um empregado da Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Estados Unidos, que isoladas, transfected com E4-ORF-1 e rotulado as células endoteliais que usamos.

Acknowledgments

Omar Alexander Man para as ilustrações.
L.M. foi apoiado por um prêmio de piloto da clínica Cornell e concessão de pesquisa Translational Science Center e um ASRM.
Os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório James para uma leitura crítica do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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Co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais engenharia: uma combinação de estratégia baseada em célula acelerado perfusão com entrega direta parácrina
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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