Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Bazı hastalar için dondurma Yumurtalık dokusunun doğurganlık korunması için tek seçenektir. Ne yazık ki, gecikmiş revaskülarizasyon foliküler canlılığı zayıflatmaktadır. Burada, co için doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış kullanımı olarak birleştiren bir hücre tabanlı strateji perfüzyon biyoaktif moleküllerinin endotel hücreleri ile insan yumurtalık dokusu nakli için bir protokol mevcut.

Abstract

İnfertilite, kemoterapi ve/veya radyoterapi ve bazı hastalar sık yan etkisi, yumurta veya embriyo dondurma bir seçenek değil. Alternatif olarak, bu hastalar giderek artan sayıda otogrefti için yumurtalık dokusu cryopreserve için tercih ediyor kurtarma ve remisyon aşağıdaki. Auto-nakli cryopreserved Yumurtalık dokusunun geçiren hastalar arasında istenmeyen sonuçlara gelişmelere rağmen büyük bir engel etkili revaskülarizasyon aşılı doku kalır. İskemi azaltmak ve böylece auto-nakli uygulanan hastalarda sonuçlar geliştirmek için perfüzyon Yumurtalık dokusunun hızlanan bir vasküler hücre tabanlı strateji geliştirdi. Eksojen endotel hücreleri (ExECs) Co nakli için bir yöntem bir fare xenograft model cryopreserved yumurtalık dokusu ile açıklamak. Biz Anti-Mullerian hormon (AMH), yapısal ifade etmek için tasarlanmış böylece sürekli parakrin yumurtalık Greftler için giriş sinyal etkinleştirme ExECs istihdam için bu yaklaşım uzatmak. Foliküler hacmi ve geliştirilmiş antral folikül gelişim ExECs ile ortak ekimi artmış ve saklama deneniyor ilkel köklerinin AMH ifade ExECs terfi. Bu kombine strateji bağlamında foliküler aktivasyonu doğurganlık koruma ve/veya infertilite büyük oransal ve iskemi Azaltıcı için yararlı bir araç olabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanser gelişmiş dünyada önde gelen ölüm nedenleri arasında kalır, henüz onlarca yıllık araştırma kanser ve bazı durumlarda neredeyse iki katına hayatta kalma oranları1, birçok türü için önemli bir ilerleme vermiştir. Ne yazık ki, kemoterapötik ajanlar gonadotoxic, yumurtalıklarda ilkel köklerinin rezerv tüketen ve doğurganlık2azaltılması çoğu kez. Bu büyüyen nüfusun doğurganlık koruma oosit ve/veya embriyo dondurma da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler yararlanabilir, ancak, kanser tedavisi ve önceden pubertal hastaların istem başlatma gerektiren hastalar için bu seçenekleri geçersiz. Alternatif olarak, bazı hastalarda yumurtalık dokusu onların tedavi rejimi girişmeden önce ve kurtarma ve remisyon, doğurganlık3geri yüklemek için otomatik dikim doku üzerine cryopreserve seçtiniz. Henüz, bugüne kadar greft hayatta kalma ve foliküler çıkış auto-nakli takip nispeten düşük4, ana toprak dolay iden doku iskemi ve hipoksi5,6,7kalır. Yumurtalık kortikal Greftler canlılık geliştirmek için çok sayıda çabalarına rağmen anti-oksidanlar8,9, pro-anjiogenik sitokinler10,11,12,1 kullanarak 5-7 gün pencere sonrası organ nakli 3veya mekanik işlemler14, greft iskemi canlılığı ve greft7yaşama zayıflatmaktadır. Bu sorunu çözmek için ev sahibi ve greft damarlarının anastomoz kolaylaştırmak ve böylece reperfüzyon Yumurtalık dokusunun hızlandırmak için bir hücre tabanlı strateji geliştirdi.

Sonrası organ nakli penceresinde aşılı yumurtalık dokusu için iskemik hakaret yanı sıra arası foliküler sinyal kesintileri havuzu15,16tükenmesi için katkıda bulunabilir. Eksojen endotel hücreleri (ExECs) istikrarlı ve düzgün damarları greft çevre için katkıda çünkü, onlar nakledilen doku tanımlanmış bir moleküler girişine iletmek için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. İlke kanıtı olarak Anti-Mullerian hormon (AMH), foliküler büyüme17kısıtlamak için gösterilen dönüştürme büyüme faktörü beta (TGFβ) üst aile üyesi hızlı süper fizyolojik düzeylere ExECs mühendislik. Karşılaştırma kontrol ve AMH ifade hücreleri ile birlikte nakledilen Greftler foliküler dağıtım biyolojik aktivite ve mühendislik exECs potens doğrular.

Özetle, greft canlılığı ve baskılayarak foliküler Havuzu, erken seferberlik geliştirerek bu yaklaşım doğurganlık koruma uygulanan hastalarda yumurtalık dokusu otomatik nakledilen verimliliğini artırabilirsiniz. Ayrıca, foliküler gelişim karıştığı moleküler düzenleyiciler, deneysel sorgulama ExEC tabanlı platformu sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm yordamları hayvan konular içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Weill Cornell Medical College tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık dokusu kullanarak tüm xenotransplantation deneyleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapıldı. İnsan yumurtalık dokusu kemoterapi veya radyoterapi kanser tedavisi veya önceden kemik iliği nakli için planlanan hastaların toplanmıştır. Kurumsal inceleme Kurulu (IRB) Komitesi, Weill Cornell Tıp Koleji doku potansiyel Otolog kullanılmak ve hasta Onam yumurtalık doku araştırma kullanım için % 10'a bağış gerçekleştirildi üzerine topluluğu onayladı.

1. insan yumurtalık dokusu topluluğu

Not: bir yumurtalık dokusu bir uzak tesis üretim emrindeki taşınır zaman zaman 5 h18,19geçmemelidir.

  1. Yumurtalık dokusu toplamak ve steril serum fizyolojik Çözümle durulayın.
  2. Yumurtalık Steril bir kapsayıcısına getirin.
  3. Yumurtalık tamamen ortamda batırılır kadar iyi'nın L-15 Orta dökün.
  4. Kapatın ve konteyner mühür.
  5. Buz üzerinde Konteyner Taşıma.

2. Schmidt ve ark. adapte Procured yumurtalık dokusu, işleme 18

  1. Yumurtalık işleme ve dondurma için hazırlıklar
    1. 100 mL orta işleme için hazırlamak: iyi'nın L-15 Orta 99 mL + 1 mL antibiyotik antimycotic çözüm. Medya 0.2 µm filtre kullanarak filtre. Buzdolabında orta tutmak.
    2. 100 mL cryo-koruyucu DMSO kullanarak donma çözeltisi hazırlamak. 10.65 mL (1, 5 mol/L son bir konsantrasyon oluşturmak için) DMSO, 69.64 mL iyi'nın L-15 Orta, 17.66 mL fetal sığır serum (FBS), sukroz (0,1 mol/L son bir konsantrasyon oluşturmak için), 3,42 g ekleyin ve 1 mL antibiyotik antimycotic çözüm. 150 mL filtre ünitesi, 0.2 µm. Store 4 ° C'de orta kullanarak orta filtre
    3. Kaydırılan katı sterilizasyon döngüsü için programlanmış bir otoklav kullanarak cerrahi .aletleri sterilize.
  2. Doku varışta
    1. Steril cerrahi araçlar içinde Biyogüvenlik kabini ayarla: keskin ince kavisli neşter ile bıçak sayı 21, makas ve forseps, çeşitli boyutları: 2 orta boy (yaklaşık 110 mm Uzunluk) ve uzun (yaklaşık 150 mm Uzunluk).
    2. Steril eldiven, Biyogüvenlik kabini kapsayıcıda aç. Yumurtalık alın ve bir 150 mm Petri kabına yerleştirin ve soğuk orta adım 2.1.1 yumurtalık üstüne dehidratasyon Yumurtalık dokusunun önlemek için hazırlanan dökün.
    3. Kalan herhangi bir doku yumurtalıktan yalıtmak ve doku ve kan yoksun kadar soğuk orta ile durulayın.
    4. Yumurtalık bir temiz 150 mm Petri kabına yerleştirin, soğuk ekleyin orta, adım yumurtalık yarısı içinde batık olana 2.1.1 hazırlanmış.
  3. Diseksiyon Yumurtalık dokusunun
    1. Yumurtalık bisect ve medulla ilk eğri iyi makas kullanarak keskin diseksiyon tarafından kaldırın. O zaman medulla, steril neşter bir bıçak ile 21 kullandığı kazı. Kortikal doku 1-1,5 mm kalınlıkta olana koyun.
    2. 2-3 mm genişliğinde slivers içine kortikal doku kesmek, şerit uzunluğu işlendi yumurtalık parça tüm uzunluğu olacaktır.

3. yumurtalık dokusu yavaş dondurma, uyarlama dan Newton ve ark. ve Oktay vd. 6 , 20

  1. Dondurma için hazırlık
    1. Etiket cryovials (1,8 mL).
    2. Her şişe 2.1.2. adımda hazırlanan donma çözüm 1.5 mL ekleyin.
    3. Dondurucu solüsyon içeren kriyojenik şişe başına bir kortikal şerit aktarın.
    4. Dönen bir plaka üzerinde 20 dk için kortikal şerit equilibrate, nazik ajitasyon 4 ° C'de geçerlidir
  2. Yumurtalık dokusunun yavaş dondurma
    1. 0 ° C'de başlayan bir programlanabilir planer dondurucu cryovials yüklemek
    2. 2 ° C/dk-7 ° c serin
    3. Dokular bu sabit sıcaklık 10 dakika tutun.
    4. El ile buz kristal çekirdekleşme indüksiyon için sıvı azot (LN2) dalmış bir pamuk ipucu ile her cryovial dokunarak tohum gerçekleştirin.
    5. Numune sıcaklığı-40 ° c ulaşıncaya kadar 0.3 ° C/dak soğumaya devam
    6. 10 ° C/dk-140 ° C'ye daha hızlı bir oranda serin
    7. Cryovials dewar LN2 depolama için transfer (-196 ° C).

4. (Bilateral ooforektomi ve co nakli) ameliyatları hazırlıkları

  1. Tabak hazırlanması
    1. Yumurtalık dokusu nakli için çözdürme önce bir gün
      1. 50 mm Petri kabına altındaki plastik parafin film bir parça yer, % 70 ile sprey tamamen kaplı kadar etanol.
      2. Petri yemekler gece Biyogüvenlik kabini bırakın. Fare başına 2 Petri yemekler hazırlamak.
    2. Ameliyat gününde
      1. Etanol Biyogüvenlik kabini içinde plastik parafin film içeren Petri kabına dan Aspire edin.
      2. Etanol tamamen buharlaşır kadar Petri kabına kurşun yarı açık bırakın.
      3. Plastik parafin film tamamen kuru olduğunda Petri kabına kapağını kapatın. Biyogüvenlik içinde kabine tutun.
      4. Etiket wells bir 6 de buna göre plaka 0,1 mol/L Sükroz + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L Sükroz + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sukroz, temel çözdürme çözüm (BTS), orta.
  2. Çözümler hazırlanması
    1. BTS 100 mL hazırlamak: iyi'nın L-15 Orta 79 mL + FBS 20 mL + antibiyotik Antimycotic çözüm 1 mL. 0,22 µm filtre sistemi ile filtre.
    2. BTS 10 mL 0,1 mol/L Sükroz ile hazırlayın. 0.342 g Sükroz ölçekli ve 10 mL. adımda 4.2.1, yavaşça Sükroz tamamen eriyene kadar propaganda hazırlanan BTS ekleyin. Filtre kullanarak solüsyonu 0,22 µm.
    3. Tablo 1göre çözümler hazırlamak. Alüminyum folyo ile DMSO içeren tüpler kapsar. Kullanım kadar buzdolabında tutun.

5. yumurtalık dokusu hızlı çözdürme

  1. Take dışarı LN2 dondurulmuş yumurtalık dokusu içeren bir flakon dewar ve 30 oda sıcaklığında tutmak s.
  2. Şişeyi temiz kağıt mendil kullanarak silin.
  3. 1-2 dakika kadar 30 ° C su banyosunda şişe sokmak onun ' içerik çözdürülen.
  4. Şişe açın ve belgili tanımlık ilk eriyik (0,1 mol/L Sükroz + 1 mol/L DMSO, 4.2.3 adımda hazırlanan) 3 ml içeren ilk kuyunun kortikal şerit yerleştirin.
    Not: tüm adımları plaka kapağını açarak içeren laminar akış altında yapılacaktır.
  5. 6 iyi plaka 4 ° C'de 5 min. levha kaplı tutmak için bu adım için alüminyum folyo ile dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  6. Kortikal şerit içine belgili tanımlık ikinci eriyik (0,1 mol/L Sükroz + 0,5 mol/L DMSO, 4.2.3 adımda hazırlanan) ikinci de içeren 3 mL transfer.
  7. Bu adım için alüminyum folyo ile 5 dk. levha kaplı tutmak için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir tabakta 6 iyi plaka kuluçkaya.
  8. Kortikal Şerit 4 mL çözeltisi (0,1 mol/4.2.2 adımda hazırlanan M Sükroz, ile BTS) içeren üçüncü kuyunun içine aktarın.
  9. 5 min için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  10. Kortikal şerit de içeren 4 mL çözeltisi (BTS, 4.2.1 adımda hazırlanan) dördüncü içine aktarın.
  11. 5 min için 4 ° C'de nazik ajitasyon için dönen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
  12. Kortikal şerit son de içeren 4 mL soğuk orta (2.1.1. adımda hazırlanan) içine aktarın. Buzda çözülmüş yumurtalık dokusu nakli yapmak kadar tutun.

6. Yumurtalık dokusunun kapsülleme

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak
    1. 25 mL % 0,9 serum 20 mmol/L HEPES tampon hazırlayın. Filtre ve mağaza 4 ° C'de
    2. 1 mL CaCl2 1 mol/l filtre konsantrasyonu, hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın
  2. Fibrinojen 50 mg/mL stok solüsyon hazırlamak
    1. 37 ° C'de birkaç saat içinde serum fibrinojen 1 g 20 mL % 0,9 serum fibrinojen HEPES yavaş yavaş karıştırma tarafından 20 mmol/L HEPES tampon içine arabelleğe Ekle
    2. 1.7 mL mikro-santrifüj tüpleri etiketleyin.
    3. Çözüm 0,45 µm şırınga filtre ve daha sonra 0.2 µm şırınga filtre filtre.
    4. Aliquot 200 µL mikro-santrifüj tüpü ve mağaza-20 ° C'de çözümde
  3. Trombin 100 U/mL stok solüsyon hazırlamak
    Not: Trombin çözümleri için cam, aliquot plastik tüpler/şişeleri çözümde absorbe.
    1. 2,5 mL % 0,9 steril serum Trombin 250 U ekleyin.
    2. Tamamen erimesi için çözüm kadar nazik sallamak.
    3. 1.7 mL mikro-santrifüj tüpleri etiketleyin.
    4. 0.2 µm şırınga filtre, mikro-santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine aliquot 50 µL aracılığıyla filtre
  4. 70 µL, 10 mg/mL fibrinojen ve 5 U/mL Trombin son bir konsantrasyon elde etme, Fibrin pıhtısı olun
    Not: hızlı, çözüm pıhtıları birkaç saniye içinde çalışmaya emin olun. Ayrıca, kabarcıklar karışıma ilavesi kaçının.
    1. Fibrinojen çözeltilerine 1.7 mL mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. 360 eklemek µL 20 mmol/L, HEPES tampon bölünmemeli 200 µL fibrinojen stokunun % 0,9 serum fizyolojik çözüm içinde adım 6.2.4 hazır.
      2. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      3. Buz üstünde tutun.
    2. Trombin çözeltilerine ikinci bir mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. DMEM 148,7 µL Trombin hisse senedi, bölünmemeli 50 µL için eklemek 6.3.4 adımda hazırlanan.
      2. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      3. 1 mol/L CaCl21.3 µL ekleyin.
      4. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
      5. Buz üstünde tutun.
    3. Bir tek hücre süspansiyon, üçüncü bir mikro-santrifüj tüpü hazırlayın.
      1. Bir enzim hücre dekolmanı orta kullanarak plaka mühendislik endotel hücrelerinden bağlantısını kesin.
      2. Spin aşağı ve bir hemasitometre bir cam ile kullanarak hücreleri saymak.
      3. Yumurtalık dokusunun her 1 mm2 başına 20.000 hücre kullanın. Mm2Yumurtalık dokusunun 20.000 x alanı hesaplayın.
      4. Mühendislik endotel hücreleri aşağı spin ve temel orta 16.8 µL toplam hacmi ulaşmak için (DMEM) yeniden askıya alma.
      5. Buz üstünde tutun.
    4. Bir kaç saniye için kuru bir steril gazlı bez sünger Yumurtalık dokusunun bir parça yerleştirin.
    5. Yumurtalık dokusu içinde 50 mm Petri kabına plastik parafin film üstünde parça yerleştirin.
    6. 6.4.1.2, adım adım 6.4.3.4, mix nazik pipetting tarafından hazırlanan hücre süspansiyon içine hazırlanan fibrinojen çözümün 39,2 µL ekleyin. Buz üstünde tutun.
    7. 14 µL 6.4.2.4 adımda hazırlanan Trombin çözüm ekleyin. Bir kez pipetting tarafından karışımı yavaşça. Hızlı çalış.
    8. Yumurtalık dokusu, üstüne karışımı yerleştirin damlalıklı bu uzun bir damlacık şeklinde.
    9. 37 ° C'de kuluçka pıhtı ile Petri kabına yerleştirin

7. iki taraflı ooforektomi ve NSG farelere mühendislik endotel hücreleri ile insan Yumurtalık dokusunun co nakli

Not: On 14-hafta-yaşlı kadın NSG fareler21 kullanılmıştır (Jackson Labs).

  1. 2.1.3. adımda özenli olarak tüm cerrahi araçları hazırlamak, tüm dikişler, yastıkları ve cerrahi kasetleri kullanışlı olduğundan emin olun.
  2. Fare ile Isoflurane bir anestezi sistemi kullanılarak anestezi.
    1. İndüksiyon odasında fareyi getirin, kapağını kapatın ve uygun stopcock açın.
    2. Açık akış ölçer 1000 mL/dak için Buharlaştırıcı üzerinde açın ve % 2-3,5 teslim etmek için ayarlayın.
    3. Anestezi etkileri gözlemlemek; bilinç, yavaş ve düzenli nefes kaybı.
    4. Anestezi korumak için burun konisi için transfer. Hayati belirtileri bağlı olarak 1-%3 sunmak için Buharlaştırıcı açın.
    5. Pedal veya kuyruk refleks yokluğu doğrulayın. Refleks varsa, yok olana isoflurane artırın.
  3. Bir elektrikli saç makası kullanarak kalçakemiği satır kadar kuyruk üzerinden fare arka saç kesme.
  4. Fare yüzükoyun cerrahi platformda yerleştirin.
  5. Cerrahi bir bant kullanarak cerrahi platformu için burun konisi düzeltmek.
  6. Fare bacaklarda yavaşça bir 1,25 cm çapındaki cerrahi kâğıt şerit kullanarak cerrahi platformu için teyp.
  7. Steril bir yağlayıcı jöle kullanmak ve bir 1,25 cm geniş delikli plastik cerrahi bant kullanarak cerrahi platforma taping tarafından bir termometre PR Düzeltme termometre yerleştirin.
  8. Cerrahi platformu kuyruğuna 2.5 cm geniş cerrahi kâğıt şerit kullanarak bant.
  9. Isı, kýzýlötesi veya pad, Isıtma sıcak su kullanarak ve fare vücut ısısı prosedürü boyunca izlemek. Vücut sıcaklığı 35-37 ° c aralığında tutmak
  10. Steril Povidone-iyot çözüm çubukla sopayla bölünen alanı temiz ve steril alkol hazırlık kullanarak silin.
  11. 6,9 iki kez daha tekrarlayın.
  12. Steril oküler yağlayıcı veteriner merhem bir damla her fare gözlerini dehidratasyon korumak ve kornea için zarar için üzerine getirin.
  13. Steril cerrahi örtüsü kullanarak fare kapsar.
  14. Buprenorfin (1 mg/Kg) alt Kutanöz (S/C) enjekte.
  15. Boyuna bir medial dorsal kesi neşter (bıçak #21) kullanarak gerçekleştirin.
  16. İki taraflı ooforektomi gerçekleştirmek, dorsal bir yaklaşım kullanın.
    1. Deri altı bağ dokusu tarafından künt diseksiyon makası kullanarak ücretsiz.
    2. Yanal orta hat yapmak bir kesi fasya çimdik ve keskin makas kullanarak Periton boşluğuna ulaşır.
    3. Yumurtalık yağ yastığı ve yumurtalık yavaşça cımbızla al ve karın boşluğu dışarı çekin.
    4. Yumurtalık ve yağ yastığı bir damar kıskacı ile kavramak.
    5. Yumurtalık ve yumurtalık, fallopian tüp distal temelini 4/0 monofilament absorbe dikiş kullanarak yağ yastığı ligate.
    6. Yumurtalık için kravat distal küçük. Güdük tabanından kanama yok emin olun.
    7. Doku karın boşluğuna yerleştirin ve 6/0 örgülü absorbe dikiş kullanarak fasya dikiş.
    8. Aşamaları 7.15.1-7.15.7 kontralateral tarafında yineleyin.
  17. Yumurtalık dokusu co nakli.
    1. Yatay bir kesi fasya Gluteus maksimus pıhtıları Boyutlar uzunluk itibariyle yukarıda gerçekleştirmek. Bu sanal adres alanı içinde bir cep fasya altında makas açarak oluşturun.
    2. Adım 6.4.8 hazırlanırken kapsüllenmiş kortikal doku, bir parçasına almak ve cebinde yerleştirin.
    3. Dikiş 6/0 kullanarak fasya absorbe dikiş örgülü.
  18. Aşamaları 7.16.1-7.16.3 de kontralateral tarafında yineleyin.
  19. 4/0 monofilament absorbe dikiş ile basit kesintiye uğramış dikiş kullanarak dorsal duvar kapatın.
  20. Lidokain enjekte % 0,5 (1.2 mL/Kg) S/C kesi yerinde.
  21. Steril alkol hazırlık cilt temizlemek için kullanın.
  22. İsoflurane süre fare sıcaklık izleme açın.
  23. 1-2 dk O2, Isoflurane olmadan sağlar. Hareket ve bilinç dönmek başlayana kadar üzerinde fareyi ısınma tutmak.
  24. Temiz kurtarma kafese fareyi getirin ve daha sonra tam cerrahi yara iyileşmesi kadar fareyi ayrı bir kafes içinde ev.
  25. Her 8-12 h 24 h için postoperatively gerektiği gibi buprenorfin (1 mg/Kg) S/C enjekte et.
  26. Deney sonunda noktaya kadar tüm gıda, su, yatak ve kafesleri autoclaved, zaman fareler ayrı kafeslerde tutmak. Kafesleri basınçlı havalandırılmış odada tut. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı ne zaman fare işleme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ExECs co nakli hastaların doku bir yarar sağlayıp sağlamadığını belirlemek için çözülmüş yumurtalık kortikal şeritler eşit büyüklükte parçalara bölünmüş ve bilateral IMMUNO şaibeli, NOD scid gama (NSG), fare engrafted. Fibrin pıhtısı yalnız (ECs) ve diğer içeren ExECs (Şekil 1a) gömülü bir tarafı ile her fare kendi kontrolü görev yaptı. ExECs insan göbek bağları ve Adenoviral gen parça E4-ORF1, sonraki tedaviyle yukarıda açıklanan22,23olarak birincil endotel yalıtım ile elde edilmiştir. Pasajlar içinde 2-5, insan Umbilikal ven ECs (hUVEC) kurucu ifade cDNA adenoviral gen parça E4-ORF1 kodlama kodlama lentiviral parçacıkları ile tedavi edildi. Bu tedavi yaşam geliştirir ve endotel anjiogenik potansiyelinin daha önce22,23açıklandığı gibi. İki hafta sonra işlevsel olarak periosteum damarları GFP etiketli exECs ana bilgisayar doku ve greft (Şekil 1b) arayüz üzerinden kuruldu. Fonksiyonel kan damarları etiketlemek için fare ile 100 mL lektin (0,5 mg/mL) isoflurane anestezi altında doku hasat öncesinde 10 dakika enjekte edildi. 2 hafta aşağıdaki nakli göreli kökü için önemli bir yararı gösterdi köklerinin miktar iki hafta (şekil 1 c) açıkça belirgin ExECs destekli Greftler varım. Eksojen ECs oluşan işlevsel damarları co transplante yumurtalık dokusu (Şekil 1b) ve kortikal adet fare ile birlikte nakledilen veya insan ExECs denetim Greftler (Resim 1 c göre hayatta kalan folikül sayısı arttı ). Bu yarar ExECs destekli Greftler (şekil 1 d) azalan fibrotik alanına bağlı — her transplante greft 3 bölümden Trichrome, değerlendirmek için fibrotik doku24, operasyona, kurulan bir yol ile lekeli fibrotik alan: greft alt ve üst taraftan 600 µm derinlik bölümü ve orta bölüm. Lekeli bölümleri tarandı ve yüzey alanı ölçmek için ImageJ kullanılarak analiz ve fibrotik alana el ile özetlenen ve tüm greft alanında (ImageJ yazılımı) yüzdesi olarak sayılabilir. Son değerleri her greft için analiz 3 bölümden ortalama hesaplanmıştır. Önemlisi, insan sünnet derisi fibroblastlar ile birlikte transplante Greftler zavallı doku canlılığı ve nispeten daha az sayıda köklerinin gösterdi. (Şekil 1e).

Biz sonraki yumurtalık dokusu greft ve ExECs (şekil 2ad, f, h) olmadan uzun vadeli işlevi değerlendirilir. 14 hafta fareler her gün menotropins için değişken hayvanlar, MRI (şekil 2b-c) üzerinden iki farelerde izlenmekte folikülü büyüme ilerleme ile kurban edildi önce zaman uzunlukları ile uyarılmış. Gelişmekte olan köklerini denetim (şekil 2e) ve ExECs destekli Greftler (Şekil 2 g, ben) kaydedildi. Daha fazla ve daha büyük ölçekli köklerinin ExECs destekli Greftler içinde (Şekil 2 g, ben) fark edildi. Aynı hastanın doku, menotropins ile uyarılan türetilen ve ExECs ile birlikte nakledilen antral folikül karşılaştırıldığında, daha gelişmiş folikül granulosa hücre katmanda görüntülenen ovulatory işaretleri CD4425 artan ifade ve HABP126, de olarak artmış hücre-ölüm (Caspase) ve nükleer silahların yayılmasına karşı (Ki67) azaltılmış (şekil 2j).

Çeşitli çalışmalarda havuzun köklerinin zamanından önce greft yumurtalık dokusu27,28,29,30takip aktive göstermiştir. 2, 3 ve 14 hafta (şekil 3a) tek bir hastadan birden çok Greftler benzer bir eğilim gözlendi. Harekete geçirmek ve/veya büyüme köklerinin17,31bastırmak AMH varsayılan işlev üzerinde yararlanmak için biz mühendislik ExECs yapısal hızlı ve böylece doğrudan parakrin kaynağı sağlamak için lentivirus ile AMH için salgılar transplante yumurtalık dokusu (şekil 3b). Lentiviral iletim hangi başka türlü-AMH tespit edilemez miktarda ifade ExEC 100-fold yukarıdaki GC arttı. Granulosa hücreler tümör hücreleri, öte yandan, AMH Bazal bir düzeyde süpernatant hücre kültüründe salgılanan. (Şekil 3 c). İki hafta sonra eş nakli, ExECs elde edilen gemiler ana bilgisayar-greft arabirimi gözlendi ve Lümen AMH-ExECs (şekil 3d) oluşmuştur damarları göre elde edilen gemilerin bol AMH protein immunostaining ortaya Denetim ExECs. AMH işlev bağımsız olarak gelen ExECs pro-anjiogenik etkisini test etmek için biz Mezenkimal Kök yumurtalık medulla parçalardan izole edildi hücreleri (MSC) kullanılır. Bu hücreler AMH kodlama lentiviral parçacıkları ile transduced ve kültür kullanılmak üzere ortak nakli genişletilmiş. AMH-ExECs ile ortak ekimi ilkel köklerinin oranı logosuna 2 kat artış gözlendi. Bu, ancak, birincil foliküller yüzdesi azalmasına yol açar. AMH MSCs götürmek için ilkel köklerinin artan saklama 10 kat göreceli olarak denetim MSCs (şekil 3f, h) yanında. MSCs, yöneticilerin, hücresel olmayan Greftler (Ctl), AMH MSCs ExEC ve AMH-ExECs (şekil 3i) arasında bir karşılaştırma yapıldığında deneniyor foliküler havuzu tutma için en önemli yararı AMH-ECs tarafından haiz.

Figure 1
Şekil 1: yumurtalık kortikal şeritler ile ortak nakli ExECs canlılığı artırır ve foliküler havuzu korur. deneysel tasarım (a) şeması. Dondurulmuş çözdürülen insan yumurtalık dokusu fibrin pıhtısı ile ya da ezelî ExECs kapsüllü. Pıhtı oophorectomized NSG fareler nakledilen ve deneme uç noktada hasat edildi. (b) insan kortikal Greftler (yeşil); hUVEC kaynaklı ExECs ile birlikte nakledilen kırmızı kan hücreleri TER-119 tarafından etiketlenir ve greft sınırlarını beyaz özetlenmiştir. (c) ekimi ile ve ezelî fare ya da insan exECs + MAD. üzerinden toplam köklerinin medyan yüzdesi * P < 0,05. (d) ekimi ile ve ezelî fare ya da insan ExECs + MAD. fibrotik alanından medyan yüzdesi ** P < 0,001. (e) temsilcisi bölümleri yumurtalık greft ExECs, hücreleri, olmadan ve insan sünnet derisi fibroblastlar ile birlikte nakledilmektedir. Bu rakam adam ve ark. değiştirildi Sci rep 2017 15 Ağustos; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: uzun vadeli canlılığı ve işlev yumurtalık dokusu greft exECs tarafından geliştirilmiş. Sağ taraftaki Greftler ExECs ile birlikte nakledilen rakamlar b, c, d, f ve h Greftler soldaki denetim-Hayır ECs iken. kortikal Yumurtalık dokusunun uzun vadeli xenograft (a) deneysel şeması. (b) rakamlar b ve c, yıldız işareti (sağ tarafta) (sol taraf) ok ucu yok hücreleri ile nakledilen yumurtalık dokusu temsil ederken ECs ile birlikte nakledilen yumurtalık dokusu temsil eder. Fare #1 6 yaş donörden doku ile xenografted ve stimülasyon (14 hafta, sol) ve stimülasyon (15,5 hafta, doğru) on gün sonra tekrar başlaması, MRG tarafından izlenen. (c) fare #3 19 yaşındaki donörden doku ile xenografted ve 6 (20 hafta sonrası nakli), MRG tarafından izlenen 7 (21 w) ve 8 (22 inç) stimülasyon başlangıcı izleyen hafta. (d) makroskopik engrafted insan yumurtalık dokusu 15.5 hafta fare #1, greft sağ tarafında hasat ExEC destekli greft görüntüsüdür ve denetim greft histolojik bir görünümünü (e) gösterilir. (f) makroskopik görüntü greft, fare #2 20 hafta sonra kurban edildi ve denetim ve exEC destekli Greftler histolojik analiz için hasat edildi; ExEC destekli greft gösterildiği (g). (h) makroskopik resim 22 hafta sonra kurban edildi Mouse #3 greft ExEC destekli greft histolojik analizi (i) gösterilir. (j) bölümleri fare #2 ve #3 fare ExEC destekli greft için moleküler işaretleyiciler lekeli ve ilişkili kutusunda genişlemiş. Ölçek çubukları 100 µm =. Bu rakam adam ve ark. değiştirildi Sci rep 2017 15 Ağustos; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: ExECs AMH ifade etmek için tasarlanmış korumak deneniyor foliküler havuzumuz. (a) oranı köklerinin uzun ve kısa vadeli aralıkları için ECs ile birlikte transplante birden çok yumurtalık dokusu parçaları aynı hastadan için sayısal; n 2 haftalık, n = 3 = 4 3 hafta ve n = 2 14 haftalık. deneysel tasarım (b) şeması. Dondurulmuş çözdürülen insan yumurtalık dokusu bir fibrin pıhtısı ExECs/MSCs bir denetim olarak hizmet veren bir RFP lentiviral parçacık ile transduced ya da ExECs/MSCs bir AMH mCherry lentiviral parçacık AMH-ECs/MSCs üreten transduced ile kapsüllü. Pıhtı oophorectomized NSG fareler nakledilen ve 2 haftalık hasat edildi. (c) ExECs salgılanan insan AMH kodlama lentivirus ile transduced; hücre kültür süpernatant AMH transduced exECs COV-434 kültür granulosa Hücre Tümörü satırı ve denetim ExECs ile karşılaştırıldı. (d) iki hafta sonra nakli, yumurtalık dokusu bu ya ECs (solda) ile birlikte nakledilen parçaları veya AMH-ExECs (sağda) bir antikor özel AMH protein ile lekeli. (e) denetim ve AMH-ExECs ile birlikte nakledilen xenografts köklerinin göreli oranı 2 hafta sonra sayısal (n = 6). (f) denetim ve AMH MSCs ile birlikte nakledilen xenografts köklerinin göreli oranı 2 hafta sonra sayısal (n = 6). (g) medyan + köklerinin göreli oranı MAD karşılaştırıldığında kontrol ve ExECs AMH transduced nakledilen xenografts içinde (n = 6) 2 hafta takip. (h) denetim ve MSCs AMH transduced ile nakledilen xenografts köklerinin medyan + kızgın göreli oranı karşılaştırıldı (n = 6) 2 hafta takip. (i) gözlenen ilkel köklerinin MSCs ile nakledilen xenografts greft başına ortalama yüzdesini (n = 6), yöneticilerin (n = 6), AMH MSCs (n = 6) ve AMH-ExECs (n = 6) toplu denetim koşulları için karşılaştırıldığında (hiçbir hücre, n = 15). İnsets (d) büyütülmüş AMH-ExECs ve için sağdaki kutulara diye için Ctl ExECs; (d) kırmızı ve mavi kontur satırlarında yumurtalık dokusu ve ana bilgisayar doku, sırasıyla anahat. Hata çubukları (c) 3 çoğaltır arasında standart sapmayı temsil eder. Hata çubukları (a, g-i içinde) MAD arasında listelenen veya grafikte gösterilen çoğaltır sayısını temsil eder. Ölçek çubuğu 100 µm (d) =. * P < 0,05, ** P < 0.005. Bu rakam adam ve ark. değiştirildi Sci rep 2017 15 Ağustos; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Çözüm Sükroz-BTS μL içinde (4.2.2 adımda hazırlanan) DMSO μL
Sükroz-BTS 1 mol/L DMSO ile 2787 213
Sükroz-BTS 0,5 mol/L DMSO ile 2894 106

Tablo 1: Sükroz eriyik hazırlığı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada biz exECs Co o nakli göstermek yumurtalık dokusu canlılık ve xenograft farelerde aşağıdaki işlevi önemli bir yarar sağlar. Yumurtalık dokusu auto-nakli doğurganlık korunmasına ilişkin klinik uygulama için standartlar kümesi ve optimum parametreleri (boyut, nakli sitesi, süresi greft, vb) olmamıştır 32 , 33 , 34 foliküler havuzun gelişmiş kurtarma için tanımsız kalır. Auto-ekimi yapılırken, avasküler çözdürülen kortikal Yumurtalık dokusunun aşılama başta olmak üzere kalan yumurtalık, yumurtalık fossa veya geniş bağ35,36gibi pelvik siteleri gerçekleştirilir. Hiçbir uçtan uca anastomoz yer alır bu yana, bu ekimi yöntemi bir dalga iskemik doku kaybı ve greft içinde ikamet eden köklerinin erken harekete geçirmek sonuçlanır. Bu nedenle, exECs ile ortak ekimi için klinik uygulama düşünmeden önce çok daha fazla inceleme gerektiren proliferatif endotel hücrelerinin teslim gerektirir, bu yaklaşım doku revaskülarizasyon hızlandırabilirsiniz ve kurtarma bir follikül yumurtalık Greftler içinde sağlam oranı.

Bu bulgular ortaya yumurtalık dokusu canlılığı ve nakli takip fonksiyonu optimize etmek için bir roman vasküler hücre tabanlı strateji koymak. Hastaların klinik uygulama37,38açmak için deneysel durumu taşımak yumurtalık dokusu ve yumurtalık dokusu nakli için son çağrı cryopreserve gözle büyüyen havuzu göz önüne alındığında, bu yöntem bir tedavi sunabilir Böylece nakledilen gerekir yumurtalık kortikal şeritler sayısını azaltarak ve onların uzun ömürlü ve/veya işlevi artan greft, büyük canlılık sağlar strateji.

Erken işe alım veya "burnout", aynı zamanda kemoterapi39sırasında foliküler havuzun tükenmesi yanı sıra aşağıdaki otomatik nakli yumurtalık dokusu34bağlanmıştır. Çok sayıda çalışma sinyal yolları foliküler seferberlik baskılayarak etkinleştirmek için bu işlevi kimliklerini teşhis ettik ve bu düzenleyici fonksiyonu bozulma foliküler havuzu bir toplu etkinleştirme sırasında kritik bir iskemik pencere neden olabilir ne zaman yeni doğmakta olan köklerinin metabolik ihtiyaçlarını karşılanması mümkün değildir. Bu bağlamda exECs uygulanması değil sadece hızlandırmak reperfüzyon ama potansiyel onların engraftment nedeniyle, exECs da o doğrudan foliküler seferberlik faktörler doğrudan parakrin teminini sağlamak için tasarlanmış. AMH foliküler büyüme bir modülatör kullanan kavramını diğer gruplar tarafından uygulanmıştır. Kano vd. teslim edilen AMH rekombinant protein veya IP enjeksiyon viral parçacıkların40içeren ozmotik ya pompalar ile. İlkel köklerinin tutma benzer bir eğilim bu yaklaşımlar sonucunda, ama teslim sistemik. Alternatif olarak, AMH salgılayan exECs AMH bir yerel ve sürekli kaynak sağlamak, ancak, birleşme yumurtalık dokusu Greftler mühendislik vasküler hücre hücre tabanlı terapiler ile ilgili sayısız riskleri ile sınırlıdır. ExECs yabancı antijenlere bağışıklık yanıtı mümkündür ve proliferatif hücreleri kullanımı dolaşan, geliştirme ve vücudun başka yerlerinde neoplastik büyüme teşvik hücreleri olasılığını yükseltir. Bu sınırlamalar geçerli otomatik-nakli geçiren hastalar için bu yaklaşımın çeviri engel olsa da, bu deneyler çoğaltmak için pro-anjiogenik etkiler ve erken foliküler seferberlik bir baskı için potansiyel kanıtlamak Yumurtalık dokusunun çıkış greft ve insan yumurtalık fizyolojisi mekanik incelenmesi için sağlam xenograft modeli kurmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michael Ginsberg Angiocrine Biosciences, Inc, San Diego, CA, 92130, izole, E4-ORF-1 ile transfected ve biz kullanılan endotel hücre etiketli ABD, bir çalışandır.

Acknowledgments

Omar Alexander adam resimler için.
Translational bilim merkezi ve bir ASRM grant araştırma ve L.M. Cornell klinik bir Pilot Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Yazar James laboratuvar üyeleri şekilde alt alta yazılmalıdır eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23, (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104, (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384, (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14, (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11, (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92, (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114, (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82, (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95, (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27, (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17, (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6, (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52, (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23, (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140, (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18, (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30, (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69, (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174, (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93, (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22, (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79, (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75, (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134, (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28, (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30, (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153, (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99, (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45, (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30, (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377, (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34, (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32, (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5, (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (9), E1688-E1697 (2017).
İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter