Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57485
Automatic Translation
1, 1
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

Summary

نقدم هنا، بروتوكول يجتذ يتدنى وراثيا مسماة الخلايا العصبية بليزر اثنين-فوتون من اليرقات الزرد.

Abstract

لتحديد دور يتدنى من الخلايا العصبية في السلوك، من الضروري اختبار المترتبة على عرقلة نشاطها في الحيوانات الحية. التذرية الليزر الخلايا العصبية طريقة فعالة لهذا الغرض عندما تتم تسمية الخلايا العصبية بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. ويرد في الدراسة الحالية، والبروتوكولات الخاصة بالليزر أبلاتينج يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر اثنين-فوتون واختبار نتائجه الوظيفية والسلوكية. في هذه الدراسة، يتم استخدام السلوك التقاط الفريسة في اليرقات الزرد كنموذج دراسة. حلبة بريتيكتو طائي المعروف أن تكمن وراء هذا فريسة يحركها بصريا اصطياد السلوك. بريتيكتوم الزرد أبلاتيد الليزر، وجرى النظر في نشاط الخلايا العصبية في الفص السفلي من تحت المهاد (إيله؛ والهدف من الإسقاط بريتيكتال). كما تم اختبار السلوك التقاط فريسة بعد التذرية بريتيكتال.

Introduction

لفهم كيفية السلوك ينشأ عن نشاط الخلايا العصبية في الدماغ، من الضروري تحديد الدوائر العصبية التي تشارك في توليد هذا السلوك. مرحلة اليرقات، يوفر الزرد نموذج حيوان مثالي لدراسة وظيفة المخ المرتبطة بالسلوك لأن ادمغتهم الصغيرة وشفافة تجعل من الممكن للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في دقة خلوية في منطقة واسعة من المخ أثناء مراقبة السلوك1. تصوير نشاط الخلايا العصبية في الخلايا العصبية المحددة أصبح ممكناً من خلال اختراع وراثيا المرمزة الكالسيوم (Ca) المؤشرات (جيسيس) مثل جكامب2. جكامب الزرد المعدلة وراثيا أثبتت أن تكون مفيدة لربط الدارة العصبية الوظيفية بالسلوك عن طريق إجراء تصوير Ca في سلوك الحيوانات3.

بينما يمكن إثبات Ca تصوير العلاقات المتبادلة بين نشاط الخلايا العصبية والسلوك، لإظهار العلاقة السببية، قمع نشاط الخلايا العصبية، واختبار consequence(s) شأن سلوك خطوات هامة. هناك طرق مختلفة تحقيق هذا الهدف: استخدام الطفرات الوراثية أن يغير الدوائر العصبية محددة4، التعبير عن أعصاب في الخلايا العصبية المحددة5،6، استخدام أدوات أوبتوجينيتيك مثل هالورهودوبسين7، و ليزر تذرية من الخلايا العصبية المستهدفة8،9. التذرية الليزر مناسبة خاصة للقضاء على النشاط في عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية المحددة. القضاء الذي لا رجعة فيه من نشاط الخلايا العصبية عن طريق قتل الخلايا العصبية يسهل تقييم الآثار السلوكية.

هو واحد من السلوك المثيرة للاهتمام التي يمكن ملاحظتها في مرحلة اليرقات في الزرد فريسة الاستيلاء (الشكل 1أ). يوفر هذا السلوك الموجهة بشكل مرئي، والموجه بهدف نظام تجريبي مواتية لدراسة البصر10والتحول فيسوموتور11،،من1213، الإدراك البصري والاعتراف كائنات14،،من1516،،من1718، وصنع القرار19. كيف المسلم فريسة من الحيوانات المفترسة وكيف يؤدي الكشف عن فريسة فريسة اصطياد السلوك كانت مسألة مركزية في نيوروثولوجي20. في هذه الورقة، علينا أن نركز على دور الدارة بريتيكتو طائي شكلتها إسقاطات نواة في بريتيكتوم (نواة بريتيكتاليس السطحية فارس ماجنوسيلولاريس، يشار إليها فيما بعد، ببساطة ولوحظ بريتيكتوم) إلى إيله. وأبدى التذرية الليزر بريتيكتوم للحد من نشاط التقاط الفريسة وإلغاء نشاط الخلايا العصبية في إيله الذي يرتبط ب تصور فريسة البصرية21. هنا، بروتوكولات لإجراء الليزر التذرية واختبار أثره استخدام Ca2 + تصوير وتسجيل السلوكية في الزرد يرد اليرقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاجتثاث يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون

ملاحظة: إذا كان المستخدمين خطة بشأن أداء الاجتثاث Ca التالي التصوير، استخدم خط UAShspzGCaMP6s21. إذا المستخدمين تنوي القيام بتسجيل السلوكية بعد التذرية، استخدام خط UAS:EGFP، كما الاجتثاث الخلايا اجفب-إيجابية أسهل لأداء من التعبير عن GCaMP6s الخلايا.

  1. ابدأ بإعداد التزاوج من خط Gal4 تسميات محددة من الخلايا العصبية دراستها و UAS:EGFP أو UAShspzGCaMP6s. تأكد من استخدام الخلفية الصدف لكلا الوالدين بحيث يمكن الحصول على homozygotes الصدف .
    ملاحظة: وتتضمن homozygotes من الصدف لا ميلانوفوريس على سطح الجسم (الشكل 1ب). في الوقت الحاضر دراسة، gSAIzGFFM119B خط Gal4 (الذي تسمية في بريتيكتوم) وآخر سطر Gal4 hspGFFDMC76A (الذي التسميات ILH) يتم استخدامها21.
  2. في اليوم التالي من الإعداد التزاوج، جمع البيض الزرد، ورفع لهم إلى مرحلة اليرقات عند هذه النقطة عن الخلايا العصبية التي تهم الصحفيين الفلورسنت.
  3. جبل اليرقة الزرد في 2% انخفاض درجة الانصهار-[اغروس] (الشكل 1ب).
    1. البدء بإعداد 2% [اغروس] الأسهم الحل: حل ز 2 مسحوق [اغروس] نقطة انصهار منخفضة في 100 مل مياه نظام (أي، المياه المستخدمة للحفاظ على الزرد الكبار في نظام المياه المتداولة)22 أو E3 الماء23، بجلب الماء إلى نقطة في فرن ميكروويف الغليان، والاختلاط بقوة.
    2. الميكروويف الأسهم منخفضة نقطة انصهار [اغروس] 2% حتى يغلي. صب مل 3.5-4.0 من [اغروس] على غطاء طبق بيتري 6-سم. انتظر حتى يبرد [اغروس] حيث تكون دافئة عند لمسها قبل المتابعة.
    3. ثم، ضع يرقة واحدة (عدم تخديره في هذه الخطوة) في [اغروس]. الحفاظ على ضبط الموقف والتوجه لليرقة حيث أنها تستقيم، باستخدام إبرة تشريح (الشكل 1ج)، حتى يقوي [اغروس] لضمان تحديد المواقع المناسبة لليرقة.
      ملاحظة: وستواصل اليرقة تسبح حول بينما يتصلب [اغروس].
    4. حالما يتم وضع اليرقة، تسمح 5 دقيقة على [اغروس] ترسيخ تماما.
    5. صب 5 مل محلول تريكيني (0.4% 1 × تركيز العمل) على [اغروس].
      ملاحظة: تجنب الحركات باليرقات أثناء التذرية الليزر، يجب أن تظل اليرقات أنيسثيتيزيد طوال إجراءات الاجتثاث.
  4. يجتذ اليرقة باستخدام الدالة تبيض في نظام الفحص المجهري ليزر اثنين-فوتون.
    1. ضع اليرقة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] تحت ليزر اثنين-فوتون المسح مجهر وبدء نظام الفحص المجهري.
    2. بدء تشغيل البرنامج الحصول على الصورة، وانقر فوق الزر "حول" في علامة التبويب "الليزر" لتشغيل الليزر (الشكل 1د). انتظر "حالة" الليزر لتغيير من "مشغول" إلى "الوضع غير الساحلية."
    3. في علامة التبويب "قنوات"، تعيين الطول الموجي الليزر في 880 نانومتر (الحد الأقصى من الطاقة: حوالي 2,300 ميغاواط) للاجتثاث اجفب، أو 800 نانومتر (الحد الأقصى من الطاقة: حوالي 2,600 ميغاواط) للاجتثاث جكامب.
    4. حدد 20 X عدسة الهدف بتحريك المسدس العدسة يدوياً. انقر فوق علامة التبويب "تحديد"، انقر فوق "بروتينات فلورية خضراء" تغيير مسارات بصري، وعرض الأسفار مباشرة بالعين المجردة.
    5. تحديد موقع الدماغ الزرد اليرقات في مركز العرض؛ ثم انقر فوق علامة التبويب "حيازة" العودة إلى الفحص المجهري اثنين-فوتون.
    6. كسجل للشرط 'قبل الاستئصال'، تأخذ صورة z-مكدس مع العدسة الهدف X 20 في سرعة المسح السريع (لتجنب الأضرار الحرارة). وبعد مقارنة الصور التي اتخذت قبل وبعد تجارب التذرية (الشكل 2أ). للحصول على كومة z, انقر فوق "Z-مكدس" تحديد الخيار z-المكدس وتوسيع علامة التبويب تعيين الحد الأدنى (انقر فوق "تعيين أول" الزر ") بعد التركيز على نهاية البطني للدماغ اليرقات، وتعيين الحد الأعلى (انقر فوق الزر" تعيين الأخير ") بعد التركيز على الظهرية معظم سطح الدماغ. ثم، انقر فوق الزر "بدء التجربة" لتشغيل اكتساب صورة z-المكدس.
    7. حدد العدسة الهدف X 63 بتحريك المسدس العدسة يدوياً.
    8. انقر فوق علامة التبويب "تحديد" للتبديل إلى مجهر فلوري برنامج التحصين الموسع، وتحديد موقع الخلايا لتكون أبلاتيد في مركز العرض بالعين، ثم انقر فوق علامة التبويب "حيازة" العودة إلى الفحص المجهري بالليزر.
  5. في علامة التبويب "اكتساب الوضع"، تعيين "حجم الإطار" في 256 × 256. انقر فوق "لايف" ومراقبة الخلايا العصبية للفائدة.
  6. بدءاً من جانب معظم الظهرية، العثور المستوى البؤري التي الخلايا لتكون أبلاتيد في التركيز.
  7. علامة منطقة دائرية صغيرة الحجم حوالي الثلث للخلية في القطر على كل الخلايا العصبية كمنطقة للفائدة (ROI) باستخدام الدالة "المناطق".
  8. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى s/256 13.93 × 256 بكسل (ميكرومتر 134.42 x 134.42 ميكرومتر)، الذي يتوافق مع وقت يسكن ليزر المايكروثانيه تقريبا 200 بيكسل، أو 200 المايكروثانيه/0.5 ميكرومتر. أيضا، تعيين التكرار 4 ('دورة التكرار: 4'). وبدلاً من ذلك، تحسين عدد التكرارات وسرعة المسح الضوئي حتى يتحقق الاجتثاث كافية.
  9. أداء وظيفة 'التبييض' للاستئصال، بالاشتراك مع 'الوقت سلسلة (دورتان) صورة عينة (قبل وبعد الاستئصال) و' مناطق ' (لتعيين رويس) أو وظائف مماثلة في البرمجيات المستخدمة (الشكل 1د).
  10. بمقارنة الصورة الأولى (قبل التذرية) والصورة الثانية (بعد التذرية) في السلسلة الزمنية دورة، التأكد من أن بعد التبييض، الأسفار في النقصان الخلايا المستهدفة لمراعاتها على مستوى الخلفية (الشكل 2ب).
  11. إذا كانت الأسفار لا تزال موجودة بعد التذرية، زيادة عدد مرات التكرار.
  12. بعد ذلك، نقل المستوى البؤري أعمق قليلاً (أينحو الجانب البطني)، واختر المستوى البؤري القادم حيث تظهر الخلايا أبلاتيد الأمم المتحدة.
  13. أداء وظيفة التبييض كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 9). كرر هذه الخطوات حتى قد تم أبلاتيد كافة الخلايا الموجودة في البنية العصبية للفائدة.
  14. بعد أن يمر على جميع الطائرات المحورية التي تغطي الهياكل العصبية التي تكون أبلاتيد، تحقق من الخلايا للأسفار الملغاة. إذا تم العثور على بعض الخلايا تكون لا تزال الفلورسنت سبب الاجتثاث غير كافية، الليزر-تشعيع لهم مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
  15. إذا كان يحتاج اليرقة استردادها من [اغروس] بعد إشعاع الليزر، لا تحاول إجبارها خارج [اغروس] لأن هذا قد يلحق ضررا اليرقة. بدلاً من ذلك، بعناية إجراء تخفيضات صغيرة في [اغروس] حول اليرقة عمودياً على سطح الجسم. ثم، انتظر اليرقة للسباحة خارج [اغروس] بمفردها عندما يلبس المخدر.
  16. الانتقال إلى اليرقة القادم للاستئصال، أو القيام بتجارب مراقبة استخدام السكان آخر من الخلايا العصبية التي غير الضالعين في السلوك قيد التحقيق.
    ملاحظة: هنا، كعنصر تحكم، لمبة شمي الخلايا العصبية في UAS:EGFP؛ وكانت اليرقات gSAIzGFFM119B أبلاتيد الليزر باستخدام البروتوكول نفسه الموصوفة أعلاه (الشكل 2أ، حق).
  17. السماح لعدة ساعات أو يوم واحد للانتعاش قبل المتابعة إلى تصوير Ca (الفرع 2) أو تسجيل السلوكية (الفرع 3). خلال هذا الوقت الانتعاش، التحقق من صحة اليرقات (أي، سباحة عفوية طبيعية، أي ضرر الحرارة واضحة حول منطقة أبلاتيد، إلخ) وإزالة اليرقات أي دلائل على سوء الحالة الصحية.

2-الكالسيوم تصوير لتسجيل نشاط الخلايا العصبية التي أثارت فريسة في اليرقات الزرد أبلاتيد بريتيكتوم

  1. إعداد دائرة تسجيل ووضع طوقا دائرة تهجين ختم تأمين على شريحة زجاجية، مع الجانب لاصقة تواجه على الزجاج، وإزالة الختم العلوي.
    ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء دائرة تسجيل صغيرة التي من عيار 9 ملم وقطرها 0.8 ملم في العمق (الشكل 3أ).
  2. المقبل، بوضع شبكة نايلون (الحجم لافتتاح: 32 ميكرون) في أنبوب 50 مل يحتوي الجزء السفلي قطع مفتوحة. استخدام الحد الأقصى لإرفاق الشبكة في الأنبوب (الشكل 3ب).
  3. إعداد باراميسيا (وهو فريسة لاستخدامها كحافز البصرية ليرقة).
    ملاحظة: إعداد ثقافة براميسيوم (الخطوات 2.3.1 و 2.3.2) مسبقاً.
    1. الحصول على البذور باراميسيا الثقافة من مصادر تجارية أو مراكز الموارد الأحيائية الأكاديمية24 مقدما.
    2. الثقافة براميسيوم لعدة أيام في المياه التي تحتوي على قش الأرز يعقم وبيليه من خميرة البيرة الجافة22 (الشكل 3ج).
    3. من أجل ثقافة براميسيوم تباعا من خلال ثقب سيتا 2 (واحد مع فتحه 150 ميكرومتر، متبوعاً بآخر مع فتحه 75-ميكرومتر) لإزالة الحطام من الثقافة.
    4. جمع باراميسيا في التدفق عبر من الخطوة السابقة على شبكة نايلون (الفتحة 13-ميكرومتر).
    5. إعادة تعليق باراميسيا على شبكة النايلون في كوب زجاج باستخدام زجاجة ضغط لنظام المياه (الشكل 3د).
  4. شطف في mesh (الشكل 3ب) في نظام المياه 2 x (الشكل 3ه).
    ملاحظة: والغرض من هذه الخطوة إزالة أي ممكن أودورانتس وتاستانتس الواردة في الأجلين المتوسط والثقافة براميسيوم ، كما أن الهدف من هذه الدراسة مراقبة بصريا مدفوعة نشاط الخلايا العصبية.
  5. ضع يرقة الزرد في حل تريكيني تخدير.
  6. جبل يرقة واحدة في 2% نقطة انصهار منخفضة [اغروس].
    1. أولاً، الميكروويف 2% نقطة انصهار منخفضة [اغروس] وإضافة المجلد 1/10 من 10 × تريكيني تتركز [اغروس].
    2. ضع قطره واحدة من [اغروس] التي تحتوي على تريكايني على قاعة تسجيل (الشكل 3أ).
    3. بعد التأكد من [اغروس] ليس حار جداً، وضع اليرقة أنيسثيتيزيد (من الخطوة 2، 5) في [اغروس]، إزالة أي فائض [اغروس] فورا حيث أن سطح [اغروس] يبدو محدب قليلاً.
    4. توجيه اليرقة بسرعة في وضع رأسي بإبرة تشريح (الشكل 1ج).
      ملاحظة: هذه الإجراءات يجب أن تكتمل في غضون عدة ثوان قبل أن يقوي [اغروس].
    5. حالما يتم وضع اليرقة بشكل صحيح، السماح 5 دقيقة على [اغروس] ترسيخ تماما. بعد ذلك، صب قطره 1 x tricaine الحل [اغروس].
  7. إزالة [اغروس] حول رأس اليرقة الزرد، وإفساح المجال براميسيوم للسباحة باستخدام سكين جراحية. للقيام بذلك، أولاً، إجراء تخفيضات صغيرة قليلة في [اغروس] (الشكل 3و). ثم إزالة بعناية [اغروس] الزائدة بلطف صب نظام المياه في الدائرة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تغسل تريكيني.
  8. بعد ذلك، وضع أحد براميسيوم في قاعة التسجيل بمثابة حافز بصرية.
    ملاحظة: عندما تسبح براميسيوم قرب رأس اليرقة الزرد، سوف تثير استجابة الخلايا العصبية (الشكل 3ز).
  9. المكان قاعة تسجيل تحت مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار مزودة بكاميرا CMOS علمية (الشكل 3ح) وحدد عدسة هدف X 2.5 (الشكل 3أنا).
  10. جمع التسجيلات الوقت الفاصل بين الإشارات الأسفار جكامب.
    1. بدء تشغيل التطبيق اقتناء صورة للكاميرا مجهزة تجهيزا.
    2. انقر فوق "جزء التسلسل" وحدد "سجل القرص الثابت" في الجزء. في المقطع "إعدادات المسح الضوئي"، قم بتعيين "عدد الإطارات" إلى 900 أو أي أخرى رقم الإطار الإجمالي المطلوب.
      ملاحظة: إذا كانت متوفرة، استخدم برنامج تسجيل الوقت الفاصل مع وحدة نمطية (هنا، "القرص الثابت سجل") التي تمكن من إنقاذ فعالة من البيانات على القرص صلب.
    3. في جزء "التقاط"، تعيين زمن التعرض في 30 مللي ثانية (أي، 33.3 إطارا في الثانية)، و Binning 2 × 2.
    4. في المجهر السيطرة على لوحة اللمس، اختيار عامل تصفية للتجارة والنقل، كما جكامب قد أطياف الإثارة/الانبعاثات مماثلة للتجارة والنقل.
    5. انقر فوق "لايف" في جزء الالتقاط لتحديد موقع اليرقة في عرض الكاميرا والتركيز (الشكل 4أ)، ثم انقر فوق "إيقاف لايف" وانقر فوق الزر "ابدأ". حفظ الفيلم في.cxd أو أي تنسيق آخر يحتوي على معلومات حول حالة حيازة.
  11. بعد التسجيلات، تحليل الإشارات GCaMP6s نيون (Ca إشارات) عن طريق الحصول على قيم بكسل يعني للعائد على الاستثمار في بنية الدماغ في الوقت الفاصل بين الفيلم باستخدام البرمجيات الحرة فيجي25.
    ملاحظة: فيجي هي نسخة إيماجيج مع العديد من المفيد التوصيل في شكل مسبق ويمكن قراءة ملفات صورة تنسيق.cxd مع بيو-الأشكال في المكونات.
  12. إذا نقل اليرقة قليلاً أثناء التسجيل، إجراء تسجيل الصورة بواسطة تشغيل المكونات في توربوريج26 في فيجي. من القائمة، حدد 'الإضافات'، 'التسجيل'، و 'توربوريج'.
  13. النظر في كيفية تحليل البيانات وفقا لهدف الدراسة. التالي مثال.
    1. حساب و/F0 (شدة الأسفار في كل وقت، مقسوماً على كثافة fluorescence في الراحة أو قبل حدوث أي عابر Ca) على النحو التالي:
    2. تعيين رويس على بريتيكتوم أو إيله استخدام إدارة العائد على الاستثمار: في القائمة، حدد "تحليل،" "أدوات"، "إدارة العائد على الاستثمار"، و "إضافة" إلى قائمة رويس (الشكل 4أ).
    3. حساب قيم بكسل يعني رويس (أي.، كثافة الأسفار GCaMP6s) عن طريق تحديد لوحة إدارة العائد على الاستثمار: "أكثر من ذلك،" "التدبير المتعدد"، و "موافق". حفظ النتائج كملف جدول بيانات.
    4. كما الإشارات صاخبة، متوسط الإشارات ل 11-النقاط الزمنية (متوسط متحرك) باستخدام أحد تطبيقات التي يمكن التعامل مع بيانات جدول البيانات.
    5. القسمة F0 و (الأسفار الكثافات مع مرور الوقت) (شدة الأسفار على المستوى القاعدي) لحساب كثافة fluorescence تم تسويتها. كمثال من البيانات التصور، والتغيرات في تطبيع GCaMP6s fluorescence كثافة في بريتيكتوم وإيله مرمزة والمعينة على المسارات براميسيوم (الشكل 4ب-د).

3-تقييم النتائج السلوكية بعد التذرية الليزر

  1. قم بإعداد نظام تسجيل سلوكية التي تتكون من ستيريوسكوبي مجهزة بكاميرا فيديو. استخدام كاميرا مع صورة مناسبة اقتناء برنامج، تجارية أو مصنوعة خصيصا (الشكل 5ألف).
  2. تحسين ظروف الإضاءة بحيث براميسيوم يمكن الكشف عنها بواسطة معالجة الصور. على سبيل المثال، استخدام ضوء LED الدائري أبيض مع فاصل (الشكل 5ب).
    ملاحظة: المسافة من، والزاوية، الصمام يؤثر على مظهر العينة (أيمشرق في الخلفية الداكنة أو المظلمة في الخلفية مشرق) وهي، بالتالي، ذات أهمية حاسمة لمعالجة الصور الناجحة. تحديد ارتفاع أفضل من المباعدة (الشكل 5ج).
  3. ضع يرقة الزرد (المستردة من التجربة التذرية الليزر المبينة في الفرع 1) في دائرة تسجيل سلوكية (الذي كان يعلق على شريحة زجاجية) بختم أعلى الأصلي إزالتها (الشكل 5د).
  4. جمع 50 باراميسيا من الثقافة (الخطوة 2.3.5) باستخدام ميكروبيبيتي ووضعها في دائرة التسجيل.
  5. ضعه بكشف غطاء أعلى دائرة التسجيل. وضع قطره صغيرة من الماء على كشف الغطاء قبل أن يضع على سطح الماء دائرة التسجيل لتجنب إدخال الهواء في الغرفة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، وتجاوز بعض الماء مع باراميسيا من دائرة التسجيل. وسيكون العدد المتبقي من باراميسيا في قاعة تسجيل حوالي 30-40.
  6. ضع دائرة التسجيل (يتضمن اليرقة و باراميسيا) في نظام الإضاءة (الشكل 5د).
  7. بدء تسجيل الوقت الفاصل بين الساعة 10 إطارا في الثانية لمدة 11 دقيقة (إطارات 6,600).
  8. (اختياري) لكل يرقة التي تم اختبارها للسلوك، مراقبة الأسفار مجالات الليزر أبلاتيد بالفحص المجهري نيون التأكد من فعالية الليزر التذرية (أيغياب أو خلايا الفلورسنت، وعدد من انخفاض كبير في مجال الليزر المشع).
    ملاحظة: حتى بعد التشعيع، ويمكن ملاحظة بعض الخلايا الفلورسنت لا يزال سبب ظهور لاحق Gal4 التعبير الجيني في الخلايا التي ميزت بعد التذرية27.
  9. بعد تسجيل السلوك لليرقة، للتعويض عن عدم الاتساق في الخلفية، وإجراء تقسيم بكسل بكسل لكل إطار بصورة متوسط في فيجي: انقر فوق 'العملية'، '"صورة الحاسبة"'، 'العملية: تقسيم'، 32-بت (عدد عشري) نتيجة '، و' موافق '. لجعل صورة متوسط، انقر فوق 'صورة' 'مكدسات'، 'Z-مشروع'، 'متوسط'، وكثافتها 'موافق' (الشكل 5هاء، واو).
  10. عد عدد باراميسيا غادر في الدائرة عن طريق النقر فوق 'تحليل'، '"تحليل الجزيئات"'، إعداد مجموعة مجال الذي يغطي جميع باراميسيا، التحقق من خانة الاختيار 'إظهار: أقنعة'، والنقر فوق 'موافق'. الخيار 'إظهار: أقنعة' سيوفر صورة المستخرج باراميسيا (الشكل 5ز)، مع قائمة بعدد من الجسيمات (باراميسيا) في كل إطار.
  11. ارسم عدد باراميسيا اليسار في قاعة التسجيل على مر الزمن. نظراً لأن التقديرات لعدد باراميسيا صاخبة، نوصي بأداء متوسط نقل على كل نقطة في مجموعة إطارات 600 (1 دقيقة) في جدول البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت تسمية الخلايا العصبية المحددة وراثيا أما اجفب أو GCaMP6s، التعبير الذين طردوا في خطوط Gal4. GSAIzGFFM119B خط Gal4 استخدمت لتسمية نواة في منطقة بريتيكتال (نواة ماجنوسيلولار بريتيكتال السطحية)، ويتدنى لمبة شمي الخلايا العصبية. خط آخر من Gal4، hspGFFDMC76A، استخدمت لتسمية في إيله. نحن الليزر-أبلاتيد الخلايا العصبية بريتيكتال ثنائيا (الشكل 2 ترك الفريق) وأيضا أبلاتيد الخلايا العصبية في لمبة شمي ثنائيا كعنصر تحكم (الشكل 2ألف اللوحة اليمنى) في الزرد يرقات gSAIzGFFM119B خط Gal4 أن وقد تزاوج مع الأسماك مراسل UAS:EGFP. وتبين النتائج أن الليزر اثنين-فوتون يمكن أن يجتذ الخلايا المستهدفة بينما يترك الخلايا المتجاورة أو نيوريتيس لا تتأثر (الشكل 2ب).

الخلايا العصبية بريتيكتال المشروع على محاور عصبية تجاه إيله إيبسيلاتيرالي. هنا، نحن التحقيق عن الاتصال الوظيفية استخدام التصوير بكاليفورنيا. ويمكن ملاحظة نشاط الخلايا العصبية في هذه المنطقة كإشارات Ca مع تحقيق كاليفورنيا GCaMP6s (الشكل 4أ) والتعبير التي كان يقودها gSAIzGFFM119B خط Gal4 (الشكل 4ب) أو Gal4 آخر خط hspGFFDMC76A (الشكل 4 ج)-رؤوس الأسهم الملونة (الشكل 4) إظهار الاتجاهات سباحة ومسارات براميسيوم، فضلا عن مرمزة Ca إشارة-التغيرات في منطقة محددة من الدماغ، التي كانت أثارت من قبل على مرأى السباحة براميسيوم (الشكل 4ب-د). بريتيكتوم (الشكل 4ب) والنشاط إيله (الشكل 4ج) أظهرت الخلايا العصبية في الوجود الدانية الجارحة، مما يوحي بأن كلا من أنشطة الخلايا العصبية هي التي تحرك بصريا.

باستخدام اليرقات Gal4 GCaMP6s مزدوجة (gSAIzGFFM119B؛ hspGFFDMC76A؛ UAShspzGCaMP6s)، ونحن أبلاتيد التصوير كاليفورنيا بريتيكتال الخلايا العصبية من جانب واحد وكذلك إجراء لمراقبة نشاط الخلايا العصبية في بريتيكتوم وإيله في اليرقات أبلاتيد. وأظهرت بريتيكتوم اليسرى التي كان أبلاتيد الليزر المتبقية لأي نشاط الخلايا العصبية (الشكل 4د، أعلى اليسار)، مما يوحي بأن الليزر-التذرية كانت ناجحة. ومع ذلك، أظهرت ILH عن نشاط الخلايا العصبية انخفاض كبير (الشكل 4د أسفل اليسار)، مما يوحي بأن يأتي مدخلات رئيسية إيله من بريتيكتوم عن. وفي المقابل، إيله على الجانب الآخر من بريتيكتوم أبلاتيد ليزر (الشكل 4د أسفل اليمين) أظهرت نشاط الخلايا العصبية قابلة للمقارنة إلى نشاط الخلايا العصبية في بريتيكتوم عن (الشكل 4د، أعلى اليمين)، الذي ويشير إلى أن إيله الحق هو تلقي المدخلات من بريتيكتوم الحق.

ويتوقف اختيار أي مقايسة السلوكية لاستخدامها في تجربة حول الأدوار المحتملة للخلايا العصبية تحت التحقيق. هنا، نعرض مثالاً للمقايسة فريسة الاستيلاء عقب الاجتثاث نواة بريتيكتال التي تم تحديدها ك فريسة للكشف عن21. باستخدام نظام الإضاءة هو موضح في الشكل 5ألف-دال، يمكن حساب عدد براميسيوم في قاعة التسجيل بالصورة المعالجة (الشكل 5ز ه). الآلي استخراج عيون، وحساب مواقف العين (أيتغييرات في زوايا العينين) يمكن أيضا ممكن لأن أعين اليرقة الزرد تظهر أغمق من الخلفية في هذا الشرط الإضاءة (الشكل 5ح ).

نتائج التجربة تظهر أن الثنائية الاجتثاث النشاط التقاط فريسة الملغاة بريتيكتوم (5I الشكل، PT) بينما لم تفعل الاجتثاث يتدنى من الخلايا العصبية في لمبة شمي (5 الشكلالأول، الحريق المكشوف). هذه النتائج، إلى جانب التجارب هو مبين في الشكل 4، تشير إلى أن الدائرة بريتيكتو طائي أساسيا في السلوك التقاط الفريسة.

Figure 1
الشكل 1 . يرقات الزرد. (أ) البالغ من العمر اليوم خمس (5 أيام بعد الإخصاب (5-إدارة الشرطة الاتحادية)) الزرد اليرقة وفريسته، براميسيوم. (ب) 4-إدارة الشرطة الاتحادية الصدف يرقة مضمن في 2% نقطة انصهار منخفضة [اغروس]. علما بأن سلالة الصدف يفتقر إلى أصباغ سوداء على الجسم حين ظهارة صباغ الشبكية سليمة. شريط الحجم: تشريح إبرة 0.5 مم. (ج) تستخدم لتوجيه الزرد اليرقات في [اغروس]. شريط المقياس: 1 سم. (د) لقطة للشاشة من البرمجيات المستخدمة في مجهرية اثنين-فوتون، عرض لوحات "التبييض"، "السلاسل الزمنية"، و "المناطق" التي استخدمت في الاستئصال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . الاجتثاث يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون- (A) صور اجفب نيون يرقات الزرد 4-إدارة الشرطة الاتحادية قبل وبعد الاستئصال من الخلايا العصبية. عرض أعلى وعرض الجانب من z أعيد بناؤها 3D-رص الصور باستخدام برامج معالجة الصورة. وقد اتخذت z-رص الصور مع عدسة هدف X 20. مجالات أبلاتيد (أما بريتيكتوم أو لمبة شمي) هي دائري باللون الأصفر. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. (ب) مثال التذرية الليزر في المستوى البؤري واحد استخدام الدالة "التبييض". المناطق الليزر المشع (تعيين رويس) تظهر بالألوان في كل خلية. شريط الحجم: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 3
الشكل 3 . إعداد اليرقات الزرد و باراميسيا للتصوير بكاليفورنيا. دائرة التسجيل (A). واستخدم قطره متاحة تجارياً 9 مم × عمق 0.8 ملم التهجين طوقا مع الدوائر 8 كقاعة تسجيل. وكان طوقا على شريحة زجاجية والتقيد بها. وقد انشقت الختم على رأس طوقا. (ب) شبكة النايلون (32 ميكرومتر) المستخدمة شطف باراميسيا. الشبكة وضعت في أنبوب 50 مل. (ج) براميسيوم الثقافة التي تحتوي على قش الأرز وجاف حبيبات الخميرة. (د) براميسيوم إعداد حل الأسهم من ثقافة سيظهر في حل الأسهم جيم (ﻫ) براميسيوم كان شطفها بماء النظام مرتين لإزالة الإشارات حاسة الشم وتذوق ممكن في الأجل المتوسط. (و) براميسيوم المضمنة في دائرة التسجيل. لإزالة جزء من [اغروس]، قدمت تخفيضات عدة. (ز) تسجيل الدائرة مع يرقة الزرد و براميسيوم. تمت إزالة غالبية [اغروس] للسماح براميسيوم للسباحة. يتعرض لها رئيس اليرقة الزرد. (ح) تستقيم مجهر فلوري المستخدمة في التصوير بكاليفورنيا. المجهر مجهز بكاميرا CMOS علمية. (أنا) الزرد اليرقة في قاعة التسجيل تحت المجهر مع الضوء على الإثارة. مع عدسة هدف X 2.5، المنطقة المضاءة أكبر قليلاً من حجم الدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . Ca الممثل تصوير البيانات. (أ) موقف في بريتيكتوم والفص السفلي من تحت المهاد (إيله)، دائري باللون الأصفر، في hspGFFDMC76A Gal4 مزدوجة؛ gSAIzGFFM119B؛ UAShspzGCaMP6s الزرد اليرقة. (ب) التغييرات في بريتيكتوم Ca إشارة (بلغ متوسط ثنائيا)، تعيين اللون على مسارات براميسيوم في gSAIzGFFM119B؛ UAShspzGCaMP6s اليرقة. شريط مقياس: 1-(ج) التغييرات في كاليفورنيا ILH الإشارة (بلغ متوسط ثنائيا)، تعيين اللون على مسارات براميسيوم في hspGFFDMC76A؛ UAShspzGCaMP6s اليرقة. شريط مقياس: 1-(د) تغييرات في إشارات Ca إيله تعيين اللون على مسارات براميسيوم في hspGFFDMC76A؛ وبريتيكتوم gSAIzGFFM119B؛ UAShspzGCaMP6s اليرقة التي تعرضت ليومين-فوتون-التذرية الليزر من بريتيكتوم اليسرى. شريط مقياس: 1 مم. تكررت هذه الصورة من نفس البيانات المنشورة سابقا21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . فريسة التقاط البيانات المقايسة والممثل في اليرقات الزرد الليزر أبلاتيد- نظام تسجيل السلوكية (A). ستيريوميكروسكوبي كانت مجهزة بكاميرا CMOS. الصور تم الحصول عليها باستخدام برنامج نصي مخصص الصنع. (ب) مكونات نظام الإضاءة. ورقة ذات لون رمادي والناشر زجاج، أبيض حلقة الصمام الخفيفة، الناشر، ومباعدة مصنوعة خصيصا (الورق المقوى) والناشر مع وجود ثقب في المركز. (ج) نظام الإضاءة تجميعها من أجزاء هو مبين في الدائرة باء (د) تسجيل للمقايسة التقاط الفريسة. دائرة (القطر: 20 مم؛ والعمق: 2.5 ملم) تم وضعها على شريحة زجاجية. وقد انشقت الختم الأصلي أعلى الدائرة. وضع غطاء من زجاج في دائرة التسجيل. (ه) صورة Raw من إطار فيلم مسجل. تقسيم الإطار (F) (بكسل بكسل) صورة متوسط في فيلم. لاحظ أن الخلفية غير موحدة في الإضاءة يمكن أن يعوض بمعالجة هذه الصور. (ز) باراميسيا المستخرجة من إطار باستخدام الدالة "تحليل الجسيمات" في فيجي. (ح) مثال للصورة في فيجي مع حد تطبيقية. باراميسيا تظهر مشرقة، بينما عيون اليرقة الزرد تظهر مظلمة، والخلفية رمادية. ويمكن حساب التغيرات في وظائف العين (أي، الزوايا فيما يتعلق بمحور الجسم)، إذا لزم الأمر. (أنا) ممثلة من البيانات التجريبية استهلاك براميسيوم في يرقة تحكم أبلاتيد من لمبة حاسة الشم (OB) ويرقة أبلاتيد بريتيكتوم (PT). تذرية بريتيكتوم انخفاضا كبيرا قدرة الصيد فريسة بينما الاجتثاث لمبة شمي لا يؤثر عليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبالرغم من أن الليزر اثنين-فوتون قرار مكانية ممتازة ليجتذ الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد، ينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيها في أنسجة المخ سبب الحرارة. الخطوة الأكثر أهمية في هذه التجربة الاجتثاث لتحديد مقدار الأمثل لإشعاع الليزر. فشل تشعيع غير كافية لقتل الخلايا العصبية. وسوف الكثير تشعيع الحرارة-الأضرار الأنسجة المحيطة، مما سيؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها. النطاق الأمثل لإشعاع الليزر (مناطق رويس، عدد مرات التكرار، وسرعة المسح الضوئي) يبدو ضيقاً. عدد قليل من العوامل تؤثر على كفاءة الاستئصال.

أولاً، باستخدام البروتينات مراسل الفلورسنت مختلفة، تحتاج إلى شروط الاجتثاث الأمثل لكل مراسل. ويلاحظ التعبير جكامب في السيتوبلازم خالية من الأنوية. في المقابل، يظهر الأسفار اجفب في جميع أنحاء داخل الخلية، والذي قد يكون مفيداً للاجتثاث فعالة ومحددة للخلايا المستهدفة، بالمقارنة مع جكامب. استخدام جكامب أيضا غير ملائم كما خلية معربا عن جكامب أبلاتيد الليزر يمكن أن يحمل الأسفار زيادة كثافة نتيجة فورية كاليفورنيا تدفقا، على النقيض من الأسفار تناقص كثافة عندما استخدمت اجفب للاجتثاث. وهكذا، لا يمكن أن يكون التغيير في الأسفار مؤشرا موثوقاً لمدى الاستئصال مع جكامب. وفي مثل هذه الحالات، قد يكون ضروريا للتحقق من صحة التذرية عن طريق مراقبة فقدان الخلايا الفلورسنت بعد فترة زمنية محددة. غياب أو انخفاض كبير لإشارات Ca في منطقة أبلاتيد يمكن أن يكون هناك معيار آخر للاستئصال الناجحة مع جكامب.

ثانيا، يمكن أن تختلف كمية إشعاع الليزر اللازمة للاستئصال الناجحة (أيسرعة المسح الضوئي، وعدد التكرار لمسح) تبعاً لعمق الموقع من الخلايا العصبية من سطح الدماغ. بالمقارنة مع الخلايا التي تقع بالقرب من السطح، تلك التي تقع في عمق الدماغ تتطلب أكثر الليزر التشعيع، وهكذا، مما يجعل من الصعب أكثر يجتذ لهم. ينبغي أن تحدد الأمثل مقدار إشعاع الليزر على وجه التحديد لكل يتدنى المستهدفة من الخلايا العصبية.

ثالثا، لوحظ تجريبيا أن وضع عدد من رويس في منطقة صغيرة في مسح واحد كثيرا ما تضررت من جراء الحرارة الأنسجة حول الخلايا، فضلا عن (الحكم بظهور فقاعات في مجال الليزر المشع)، بينما تستهدف خلية واحدة مفردة، أو قليلة رويس الموزعة في تفحص تحت نفس الشرط لم تكن الآثار الضارة. في هذه الدراسة، تبيض كان يطبق فقط في منطقة صغيرة (حوالي ثلث حجم الجسم خلية) تجنب إلحاق الضرر بالانسجة خارج الخلايا المستهدفة. عادة، قد استهدفت 5-10 خلايا في كل المستوى البؤري (4-8 طائرات لتغطية كامل المنطقة بريتيكتال).

بالإضافة إلى تحسين كمية إشعاع الليزر، التحقق من صحة واسعة من التذرية الليزر عن طريق إجراء تجارب التحكم أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تتضمن تجربة مراقبة واحدة التذرية الليزر من يتدنى آخر من الخلايا التي من المحتمل أن تشارك في السلوك قيد الدراسة. بمثابة الخلايا العصبية لمبة شمي المسمى في نفس السطر Gal4 التحكم في هذه الدراسة (الشكل 2أ، على حق، و الرقم 5أنا). ومع ذلك، للسبب المبين أعلاه، لا مجموعات من الخلايا العصبية يمكن أن تكون عنصر تحكم مثالية. كل يتدنى من الخلايا العصبية يختلف عن الآخرين فيما يتعلق بمركزها في الدماغ وكثافة الخلية ومراسل الفلورسنت التحوير مستوى التعبير، ومعدل انتشار وتوقيت التعبير التحوير مراسل. هذه الاختلافات تجعل من المستحيل استخدام نفس الإعداد الدقيق للاجتثاث (الدالة 'التبييض') في تجارب التحكم. وهكذا، أنواع مختلفة من تجارب التحكم كما ينبغي، مثل قياسات استجابة أوبتوكينيتيك والسلوك المرئي28، والنشاط القاعدي في الحركة21 لضمان تأثير محدد الاجتثاث.

في تجربتنا، يأخذ الاجتثاث العشرات من الخلايا بريتيكتال على الصعيد الثنائي، حوالي 1 ح (من التضمين في [اغروس]، الاجتثاث باستخدام مجهر اثنين-فوتون، إلى استرداد من [اغروس] بعد الاستئصال). يرقات يصل إلى 8 في اليوم (مثلاً، اليرقات 4 4 والتجريبية لمراقبة) يمكن أن تكون أبلاتيد؛ ومن ثم، قد يكون مطلوباً بضع مجموعات من التجارب للتأكد من وجود اليرقات ما يكفي لمجموعة تجريبية (مثلاً، n = 12) ومجموعة مراقبة (مثلاً، n = 12). بالإضافة إلى ذلك، من المستحسن السماح لنصف يوم أو يوم واحد لليرقات للتعافي من التذرية (مثلاً، التذرية الليزر في 4--إدارة الشرطة الاتحادية متبوعاً بتسجيل سلوكية في 5--إدارة الشرطة الاتحادية، أو الاستئصال في الصباح متبوعاً بتصوير Ca في فترة ما بعد الظهر). خلال هذا الوقت الانتعاش، ينبغي أن تستبعد أي يرقات سوء المظهر من الدراسة.

بروتوكول يستخدم لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها يعتمد تماما على هدف الدراسة. وركزت الدراسة الحالية على العلاقات بين موقع براميسيوم في المجال البصري ونشاط الخلايا العصبية في بريتيكتوم وإيله. النظر في الانحلال البطيء (~ ثانية) من GCaMP6s الإشارات29، إلا أن توقيت هذه الزيادة، ولكن عدم النقصان، GCaMP6s إشارات يرتبط بموقع براميسيوم. يمكن أن تكون إشارات Ca عالية حتى عند نقل براميسيوم بعيداً. ومن ثم، نحن فقط تضمنت الأسفار زيادة كثافة GCaMP6s في العرض التقديمي للبيانات. غالباً ما يتطلب هذا النوع من التحليل مصنوعة خصيصا البرامج النصية المكتوبة بلغات برمجة معينة أو لغات الماكرو. وتتوفر البرامج النصية المستخدمة في هذه الورقة عند الطلب.

حالة ضبط النفس (أي، جزءا لا يتجزأ من [اغروس]) قد تكون مرهقة لليرقات الزرد إلى حد ما؛ ومع ذلك، نحن لم يلاحظ الظاهر نشاط الخلايا العصبية الناجمة عن الإجهاد أو السلوك في هذا الشرط، بالمقارنة مع21،حالة تخترق22. يرقات الزرد جزءا لا يتجزأ من [اغروس] يمكن البقاء على قيد الحياة على الأقل 24 ح، (وربما أكثر) دون أي مشكلة واضحة. براميسيوم-كاليفورنيا مدفوعة إشارات في بريتيكتوم وإيله في حالة مقيدة مماثلة للتي لوحظت في تخترق اليرقات21. يمكن التحكم في السلوك المرئي بإيقاع circadian الزرد. ومن ثم، أجرينا التجارب السلوكية من وقت مبكر في وقت متأخر من المساء. نوع البرية ومراقبة اليرقات تستهلك عددا كبيرا من باراميسيا خلال هذا الوقت التسجيل.

الاختبارات الوظيفية والسلوكية الموصوفة هنا استخدام المعدات المتاحة الأكثر شيوعاً التي يمكن العثور عليها في العديد من المختبرات أو يمكن أن يكون إعداد بسهولة، وهكذا ينبغي أن يكون تطبيقات واسعة في مختلف ميادين العلوم السلوكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في التقرير.

Acknowledgments

ومولت هذه الدراسات بالحصول على منح من يأمرون و JSPS كاكينهي منحة أرقام JP25290009، JP25650120، JP17K07494، و JP17H05984.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NuSieve GTG Agarose Lonza Cat.#50080 low-melting temperature agarose
6 cm petri dish FALCON Product#:351007
dissecting needle AS ONE Corporation Cat. No. 2-013-01 https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP Carl Zeiss two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0 Carl Zeiss 63X objective lens
Imager.Z1 Carl Zeiss an epi-fluorescence microscope
ZEN Carl Zeiss Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 Used as a behavioral recording chamber
surgical knife MANI Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics model:C11440-22CU a scientific CMOS camera
HCImage Hamamatsu Photonics image acuisition software
Hard Disk Recording module Hamamatsu Photonics An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7 Olympus stereoscope
DF PL 0.5X Olympus objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio FLIR Systems, Inc. Product No. GS3-U3-41C6NIR-C CMOS camera
XIMEA xiQ camera XIMEA Product No. MQ042RG-CM CMOS camera
a ring LED light CCS Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Nylon mesh 32µm Tokyo Screen N-No.380T http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm Tokyo Screen N-No. 508T-K http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. dry beer yeast
LabVIEW National Instruments an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP Spectra Physics  two-photon laser 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
  24. National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
  25. Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  28. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
  29. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

Tags

علم الأعصاب، المسألة 136، التذرية الليزر، اليرقات الزرد، تصوير الكالسيوم، التقاط فريسة، تغذية، بريتيكتوم، تحت المهاد، مجهرية اثنين-فوتون، والرؤية، والعصبية، جكامب، والتجارة والنقل
الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a … More

Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57485, doi:10.3791/57485 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter