Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine genetisch beschrifteten Subpopulation von Neuronen durch einen zwei-Photonen-Laser von Zebrafisch-Larven abtragen.
Abstract
Um die Rolle einer Subpopulation von Neuronen im Verhalten zu erkennen, ist es wichtig, die Folgen der Blockierung der Aktivität in lebenden Tieren zu testen. Laser-Ablation von Neuronen ist eine wirksame Methode für diesen Zweck, wenn Neuronen mit fluoreszierenden Sonden selektiv beschriftet sind. In der vorliegenden Studie werden Protokolle für Laser Abtrag einer Subpopulation von Neuronen mit ein zwei-Photonen-Mikroskop und Testen ihrer funktionalen und Verhaltensstörungen Folgen beschrieben. In dieser Studie wird Beute Erfassung Verhalten im zebrafischlarven als ein Studienmodell verwendet. Die Pretecto-Hypothalamus Schaltung ist bekannt, dieses optisch getriebene Beute fangen Verhalten zugrunde liegen. Zebrafisch pretetto wurden Laser abgetragen und neuronaler Aktivität in der minderwertigen Lappen des Hypothalamus (ILH; das Ziel der pretectal Projektion) wurde untersucht. Beute Erfassung Verhalten nach pretectal Ablation wurde ebenfalls getestet.
Introduction
Um zu verstehen wie Verhalten von neuronaler Aktivität im Gehirn entsteht, ist es notwendig, die neuronalen Schaltkreise zu identifizieren, die bei der Erzeugung von diesem Verhalten beteiligt sind. Das Larvenstadium der Zebrabärbling bietet ideale Tiermodell für die Funktion des Gehirns zu studieren mit dem Verhalten verbunden, weil ihre kleine, durchsichtige Gehirne neuronalen Aktivität mit einer zellulären Auflösung in einem breiten Bereich der untersuchen ermöglichen die Gehirn beobachtend Verhalten1. Bildgebung neuronaler Aktivität in bestimmten Nervenzellen ist möglich durch die Erfindung der genetisch codierten Kalzium (Ca) Indikatoren (GECIs) wie GCaMP2geworden. GCaMP transgenen Zebrafisch haben sich als nützlich für Verhalten durch die Durchführung von Ca Bildgebung im Verhalten der Tiere3neuronale funktionskreis zuordnen.
Während Ca Bildgebung Korrelationen zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten nachweisen kann, um zu zeigen, Kausalität, Unterdrückung der neuronalen Aktivität und testen ihre Consequence(s) auf das Verhalten sind wichtige Schritte. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, dies zu erreichen: Nutzen der genetischen Mutation, die bestimmte neuronale Schaltkreise4, Ausdruck von Neurotoxinen in spezifischen Neuronen5,6, Verwendung von optogenetische Tools wie Halorhodopsin7, verändert und Laser-Ablation von gezielten Neuronen8,9. Laser-Ablation ist besonders geeignet für die Beseitigung der Aktivität in eine relativ kleine Anzahl von spezifischen Neuronen. Irreversiblen Beseitigung von neuronaler Aktivität durch das Töten von Neuronen erleichtert die Beurteilung Verhaltensstörungen folgen.
Ein interessantes Verhalten, das auf das Larvenstadium im Zebrafisch beobachtet werden können ist Beutefang (Abb. 1A). Dieses optisch geführte, zielgerichtetes Verhalten bietet eine günstige Experimentiersystem für die Untersuchung der Sehschärfe10, antwortauslösung Transformation11,12,13, visuelle Wahrnehmung und Anerkennung von Objekte14,15,16,17,18, und Entscheidungsfindung19. Wie wird Beute erkannt durch Raubtiere und wie Beute Erkennung führt um zu Beute fangen Verhalten wurde eine zentrale Frage in Neuroethologie20. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Rolle der Pretecto Hypothalamus Schaltung von Projektionen aus einem Kern in der pretetto gebildet (Nucleus Pretectalis Superficialis pars Magnocellularis, im folgenden einfach als die pretetto gemerkt), die ILH. Laser-Ablation von der pretetto zeigte sich Beute erfassen Aktivität reduzieren und neuronalen Aktivität in der ILH, die mit der Beute visuelle Wahrnehmung21ist, abzuschaffen. Hier, laser Protokolle für die Durchführung von-Ablation und testen seine Wirkung mit Ca2 + Bildgebung und Verhaltensstörungen Aufnahme im Zebrafisch, die Larven beschrieben werden.
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Protocol
(1) Ablation von einer Subpopulation von Neuronen, die mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop
Hinweis: Wenn Benutzer Ca bildgebenden folgende Ablation durchführen planen, verwenden Sie die UAShspzGCaMP6s Linie21. Wenn Benutzer planen auf Verhaltensstörungen Aufnahme nach Ablation durchführen, verwenden Sie die UAS:EGFP Zeile, da die Ablation von EGFP-positiven Zellen einfacher durchzuführen als GCaMP6s exprimierenden Zellen.
- Durch die Paarung einer Gal4-Linie, die spezifische Neuronen untersucht werden und UAS:EGFP oder UAShspzGCaMP6s Etiketten einrichten beginnen. Achten Sie darauf, die Perlmutt -Hintergrund für beide Elternteile zu verwenden, so dass Perlmutt homozygoten erreicht werden können.
Hinweis: Homozygoten NACRE enthalten keine Melanophoren auf der Oberfläche des Körpers (Abbildung 1B). In der Gegenwart zu studieren, eine Gal4-Linie gSAIzGFFM119B (die die pretetto Etiketten) und anderen Gal4-Linie hspGFFDMC76A (die die ILH Etiketten) sind gebrauchte21. - Am nächsten Tag von der Paarung Setup sammeln Sie der Zebrafisch-Eier zu, und heben Sie sie auf das Larvenstadium, an welcher, das Stelle die Neuronen des Interesses fluoreszierende Reporter zum Ausdruck bringen werden.
- Montieren Sie die Zebrafisch-Larven in 2 % niedriger Schmelzpunkt-Agarose (Abbildung 1B).
- Beginnen Sie mit der Vorbereitung 2 % Agarose-Stammlösung: lösen Sie 2 g niedriger Schmelzpunkt Agarose-Pulver in 100 mL Wasser (d.h., das Wasser benutzt, um Erwachsenen Zebrafisch in einem zirkulierenden Wasser System beizubehalten)22 oder E3 Wasser23, indem man das Wasser der Siedepunkt in der Mikrowelle, und kräftig mischen.
- Mikrowelle den 2 % niedriger Schmelzpunkt Agarose bestand, bis es kocht. Gießen Sie 3,5-4,0 mL Agarose auf den Deckel einer Petrischale 6 cm. Warten Sie, bis die Agarose abkühlt, so dass es warm an, bevor Sie fortfahren.
- Als nächstes legen Sie eine einzelne Larve (bei diesem Schritt nicht betäubt) in die Agarose. Halten Sie die Position und Ausrichtung der Larve so angepasst, dass es aufrecht, mit Hilfe einer sezierenden Nadel (Abbildung 1C), ist bis die Agarose verfestigt sich, um die korrekte Platzierung der Larve zu gewährleisten.
Hinweis: Die Larve wird weiterhin um zu schwimmen, während die Agarose erstarrt. - Sobald die Larve sitzt, lassen Sie 5 min für die Agarose komplett zu festigen.
- Die Agarose 5 mL Tricaine-Lösung (0,4 % bei 1 x arbeiten Konzentration) übergießen.
Hinweis: Zur Vermeidung von Bewegungen durch die Larven während Laser-Ablation ist die Larven während der ablationsverfahren narkotisierten aufzubewahren.
- Abtragen der Larve über die bleichen Funktion in ein zwei-Photonen-Laser-Mikroskopie-System.
- Legen Sie die Agarose eingebettet Larve unter zwei-Photonen-Laser-scanning-Mikroskop und starten Sie die Mikroskopie-System.
- Starten Sie die Bild-Datenerfassungs-Software, und klicken Sie auf "On" im Register "Laser" schalten Sie den Laser (Abbildung 1D). Warten Sie auf die "Status" des Lasers Wechsel von "Busy" zu "Modengekoppelten."
- Auf der Registerkarte "Kanäle" legen Sie die Laser-Wellenlänge bei 880 nm (maximale Leistung: ca. 2.300 mW) für EGFP Ablation oder bei 800 nm (maximale Leistung: ca. 2.600 mW) für GCaMP Ablation.
- Wählen Sie das 20 X Objektiv durch manuelles Verschieben des Objektiv-Revolvers. Klicken Sie auf "Suchen"-Registerkarte, klicken Sie auf "GLP" ändern die optischen Wege und direkt die Fluoreszenz vom Auge zu sehen.
- Suchen Sie Zebrafisch Larven Gehirn in den Mittelpunkt der Ansicht; Klicken Sie auf die Registerkarte "Übernahme" ", um wieder auf die zwei-Photonen-Mikroskopie.
- Als Datensatz "vor Ablation" Zustand nehmen Sie ein Z-Stapel-Bild mit den 20 X Objektiv bei schnellen Scan-Geschwindigkeit (zur Vermeidung von Hitzeschäden). Vergleichen Sie später die Aufnahmen vor und nach der Ablation Experimente (Abb. 2A). Um eine Z-Stapel zu erhalten, klicken Sie auf "Z-Stapel", um die Option Z-Stapel und erweitern Sie die Registerkarte "die untere Grenze (Klicken Sie auf"Set 1."Taste") nach dem fokussieren auf dem ventralen Ende des larvalen Gehirns und die obere Grenze (Klicken Sie auf "Letzte gesetzt") festgelegt nach dem fokussieren auf die dorsalen die meisten-Oberfläche des Gehirns. Klicken Sie auf die "Start-Experiment"-Schaltfläche, um die Z-Stapel-Bildaufnahme laufen.
- Wählen Sie das 63 X Objektiv durch manuelles Verschieben des Objektiv-Revolvers.
- Klicken Sie auf "Suchen", um wechseln Sie in das Epi-Leuchtstoff-Mikroskopie, suchen die Zellen, die mit dem Auge in der Mitte der Ansicht abgetragen werden, dann klicken Sie auf Registerkarte "Acquisition" zurück zur laser-scanning-Mikroskopie.
- Auf der Registerkarte "Acquisition Mode" eingestellt "Bildgröße" auf 256 x 256. Klicken Sie auf "Live" und beobachten Sie die Neuronen von Interesse.
- Ausgehend von der dorsalen-die meisten Seite, finden Sie eine Brennebene, in der die Zellen abgetragen werden im Mittelpunkt stehen.
- Markieren Sie eine kleine, kreisrunde Fläche etwa ein Drittel der Zelle Größe Durchmesser auf jedes Neuron als einer Region of Interest (ROI) mit der Funktion "Regionen".
- 13.93 S/256 x 256 Pixel (134.42 µm x 134.42 µm), was eine Laser-Verweilzeit von etwa 200 µs/Pixel oder 200 µs/0,5 µm entspricht die Scan-Geschwindigkeit gesetzt. Legen Sie außerdem fest 4 Wiederholungen ("Iterationszyklus: 4'). Alternativ optimieren Sie die Anzahl der Iterationen und Scan-Geschwindigkeit, sodass ausreichend Ablation erreicht wird.
- Führen Sie die "Bleichen" Funktion für Ablation, in Kombination mit der "Zeit-Serie (2 Zyklen)" um die Probe (vor und nach der Ablation) und "Regionen" (Einstellen der ROIs) oder gleichwertige Funktionen in der Software verwendet (Abbildung 1D) Bild.
- Durch den Vergleich das erste Bild (vor der Ablation) und das zweite Bild (nach Ablation) in der Zeitreihe Zyklus, stellen sicher, dass nach dem Bleichen, der Fluoreszenz im gezielten Zellen abnimmt, dass auf der Hintergrund-Ebene (Abbildung 2B) beobachtet.
- Wenn Fluoreszenz nach Ablation noch vorhanden ist, erhöhen Sie die Anzahl der Iterationen.
- Als nächstes bewegen der Brennebene etwas tiefer (d. h.in Richtung der Bauchseite), und wählen Sie die nächste Brennebene, wo UN-Ablation Zellen erscheinen.
- Führen Sie die bleichende Funktion aus, wie oben (Schritt 1,9) beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Zellen in der neuronalen Struktur der Zinsen abgetragen worden.
- Überprüfen Sie nachdem man durch die fokale Flugzeuge über die neuronalen Strukturen abgetragen werden die Zellen für abgeschafft Fluoreszenz. Wenn einige Zellen gefunden werden, um noch fluoreszierende aufgrund unzureichender Ablation, Strahlen sie Laser-wieder wie oben beschrieben.
- Wenn die Larve aus Agarose nach Laserbestrahlung wiederhergestellt werden muss, versuchen Sie nicht, es aus dem Agarose zu zwingen, da dies die Larve beschädigen könnte. Stattdessen machen Sie sorgfältig kleine Einschnitte in der Agarose um die Larve senkrecht auf die Oberfläche des Körpers. Warten Sie auf die Larve aus Agarose eigenständig zu schwimmen, wenn die Betäubung nachlässt.
- Fahren Sie mit der nächsten Larve für Ablation oder führen Sie Experimente mit anderen Bevölkerung der Neuronen, die unbeteiligt im Verhalten untersucht werden.
Hinweis: Hier, wie ein Steuerelement Riechkolben Neuronen im UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B Larven wurden mit dem gleichen Protokoll (Abb. 2A, rechts) beschriebenen Laser abgetragen. - Können Sie mehrere Stunden oder 1 Tag für Erholung, bevor Sie fortfahren, Ca Bildgebung (Abschnitt 2) oder Verhaltensstörungen Aufnahme (Abschnitt 3). Während dieses Recovery-Zeit überprüfen Sie die Larven Gesundheit (d.h., normale spontan Schwimmen, keine offensichtliche Hitzeschäden rund um die abgetragene Fläche, etc.) zu und entfernen Sie Larven, die Anzeichen von schlechter Gesundheit.
2. Calcium Imaging Beute-evozierten neuronalen Aktivität in der Pretetto abgetragen Zebrafischlarven aufnehmen
- Vorbereiten einer Aufnahme Kammer, stellen eine sichere Dichtung Hybridisierung Kammer-Dichtung auf einem Objektträger mit der klebenden Seite mit Blick auf das Glas, und entfernen die obere Dichtung.
Hinweis: Dadurch entsteht eine kleine Aufnahme Kammer 9 mm im Durchmesser und 0,8 mm in der Tiefe (Abb. 3A). - Als nächstes legen Sie eine Nylon-Mesh (Größe der Öffnung: 32 µm) auf ein 50-mL-Schlauch, der unten aufgeschnitten hat. Verwenden Sie die Kappe um das Netz mit der u-Bahn (Abbildung 3B) befestigen.
- Bereiten Sie das Pantoffeltierchen (das ist die Beute als die visuellen Stimulus für Larve verwendet werden).
Hinweis: Bereiten Sie die Paramecium Kultur (Schritte 2.3.1 und 2.3.2) im voraus.- Erhalten Sie Pantoffeltierchen Impfkultur aus kommerziellen Quellen oder akademische Bio-Ressource-Center24 im voraus.
- Kultur der Paramecium für mehrere Tage in Wasser mit autoklaviert Reisstroh und ein Pellet trocken Bierhefe22 (Abb. 3C).
- Gießen Sie die Paramecium Kultur sukzessive durch 2 Siebe (eine mit 150 µm Blende, gefolgt von einem weiteren mit einer 75-µm-Blende), Schmutz aus der Kultur.
- Sammeln Sie Pantoffeltierchen in den durchströmten aus dem vorherigen Schritt auf eine Nylon-Mesh (13-µm-Blende).
- Wieder aussetzen der Pantoffeltierchen auf die Nylon-Netzgewebe in ein Becherglas mit einem Squeeze-Flasche Wasser (Abbildung 3D).
- Spülen Sie das Netz (Abb. 3B) im System Wasser 2 x (Abbildung 3E).
Hinweis: Dieser Schritt dient um möglich Geruchsstoffe und Geschmacks-enthalten in dem Kulturmedium Paramecium zu entfernen, da das Ziel der vorliegenden Studie ist zu beobachten, visuell neuronalen Aktivität angetrieben. - Legen Sie ein Zebrafisch-Larven in die Tricaine Lösung zu betäuben.
- Montieren Sie eine einzelne Larve in 2 % niedriger Schmelzpunkt Agarose.
- Erstens Mikrowelle 2 % niedriger Schmelzpunkt Agarose und die Agarose 1/10-bändige 10 x konzentrierter Tricaine hinzufügen.
- Legen Sie einen Tropfen des Tricaine-haltigen Agarose auf der Aufnahme-Kammer(Abbildung 3).
- Nach der Bestätigung der Agarose nicht zu heiß ist, legen Sie die narkotisierten Larve (aus Schritt 2.5) in der Agarose, jede überschüssige Agarose sofort zu entfernen, so dass die Oberfläche der Agarose leicht konvex aussieht.
- Orientieren Sie schnell sich die Larve in eine aufrechte Position mit einer sezierenden Nadel (Abbildung 1C).
Hinweis: Diese Schritte müssen ausgeführt werden, innerhalb weniger Sekunden bevor die Agarose erstarrt. - Sobald die Larve richtig positioniert ist, lassen Sie 5 min für die Agarose komplett zu festigen. Dann geben Sie einen Tropfen von 1 X tricaine Lösung auf die Agarose.
- Entfernen Sie die Agarose um den Kopf des Zebrafisch-Larven und machen Sie Platz für das Paramecium Schwimmen mit einem chirurgischen Messer. Um dies zu tun, stellen Sie zuerst ein paar kleine Einschnitte in der Agarose (Abbildung 3F). Dann entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Agarose durch sanft System gießt Wasser auf die Kammer.
Hinweis: In diesem Schritt wird die Tricaine ausgewaschen werden. - Als nächstes setzen Sie eine Paramecium in der Aufnahme-Kammer, als visuelle Anregung dienen.
Hinweis: Wenn das Paramecium in der Nähe der Leiter der Zebrafisch-Larven schwimmt, wird es eine neuronale Antwort (Abbildung 3G) hervorrufen. - Ort der Aufnahme Kammer unter einem Epi-Fluoreszenz-Mikroskop ausgerüstet mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera (Abbildung 3H) und wählen Sie eine 2,5 X Objektiv (Abbildung 3ich).
- Zeitraffer-Aufnahmen der GCaMP Fluoreszenz Signale zu sammeln.
- Starten Sie die Bild Erwerb Anwendung für die ausgestattete Kamera.
- Klicken Sie auf "Sequenz Pane" und wählen Sie "Festplatte Record" auf der Scheibe. Legen Sie im Abschnitt Scan-Einstellungen "Frame Count" auf 900 oder eine beliebige andere total Rahmennummer gewünscht.
Hinweis: Falls vorhanden, Zeitraffer-Aufnahme-Software mit einem Modul verwenden (hier "Festplatte aufzeichnen"), die effiziente Speicherung von Daten auf einer Festplatte ermöglicht. - Setzen Sie im Bereich "Capture" die Belichtungszeit bei 30 ms (d.h. 33,3 fps) und Binning 2 x 2.
- Wählen Sie auf dem Mikroskop Touch-Panel Steuerung einen Filter set für GLP, wie die GCaMP ähnliche Erregung/Emissionsspektren zur GFP hat.
- Klicken Sie auf "Live" im Bereich "Capture", suchen die Larve in die Kamera-Ansicht und die Schärfe (Abb. 4A), und dann klicken Sie auf "Stop Live" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Start". Speichern Sie den Film in .cxd oder jedes andere Format, die Informationen über den Erwerb Zustand hält.
- Analysieren Sie nach den Aufnahmen die GCaMP6s fluoreszierenden Signale (Ca) durch den Erwerb mittlere Pixelwerte für den ROI auf eine Gehirnstruktur im Zeitraffer-Film mit der kostenlosen Software Fidschi25gesetzt.
Hinweis: Fidschi ist eine Version von ImageJ mit viele nützliche Plug-ins ist vorinstalliert und .cxd Format Bilddateien mit Bio-Formate lesen kann-Plug-in. - Wenn die Larve während der Aufnahme bewegen, führen Sie Bild-Registrierung durch Ausführen der TurboReg-Plug-in26 in Fidschi. Wählen Sie aus dem Menü "Plugins", "Registrierung" und "TurboReg".
- Überlegen Sie, wie die Daten entsprechend der Zielsetzung der Studie analysieren. Im folgenden ist ein Beispiel.
- F/F0 (Fluoreszenzintensität zu jedem Zeitpunkt geteilt durch die Fluoreszenzintensität in Ruhe oder vor jeder Ca Transient aufgetreten ist) wie folgt zu berechnen:
- ROIs auf der pretetto oder der ILH mit dem ROI-Manager festlegen: Wählen Sie im Menü "Analysieren", "Tools", "ROI-Manager" und "Hinzufügen", um die Liste der ROIs (Abb. 4A).
- Berechnen Sie die mittlere Pixelwerte für ROIs (i.e., Fluoreszenz-Intensität von GCaMP6s) durch die Auswahl im Feld ROI-Manager: "More", "Multi-Measure" und "OK". Speichern Sie die Ergebnisse als eine Tabellenkalkulationsdatei.
- Da die Signale verrauscht sind, durchschnittlich die Signale für 11 Zeit-Punkte (gleitender Durchschnitt) mit einer Anwendung, die Daten verarbeiten kann.
- Teilen Sie F (Fluoreszenz-Intensität im Laufe der Zeit) durch F0 (Fluoreszenzintensität auf der basalen Ebene) der normalisierten Fluoreszenzintensität zu berechnen. Ein Beispiel der Datenvisualisierung, Änderungen der normalisierten GCaMP6s Fluoreszenz-Intensität in der pretetto und der ILH sind farblich gekennzeichnet und Paramecium Bahnen (Abbildung 4B - D) zugeordnet.
3. Bewertung des Verhaltens Konsequenzen nach Laser-Ablation
- Richten Sie ein behavioral Aufnahmesystem, das besteht aus ein Stereoskop mit einer Videokamera ausgestattet. Verwenden Sie eine Kamera mit einer entsprechende Bild Software zur Datenerfassung, kommerzielle oder nach Maß (Abb. 5A).
- Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, sodass Paramecium durch Bildverarbeitung nachgewiesen werden kann. Z. B. eine weiße LED Ringlicht mit einem Abstandhalter (Abb. 5B).
Hinweis: Die Entfernung und Winkel, die LED beeinflusst das Aussehen der Probe (d. h., im dunklen Hintergrund hell oder dunkel auf hellem Hintergrund) und sind daher entscheidend für die erfolgreiche Bildverarbeitung. Bestimmen Sie die beste Höhe der Abstandhalter (Abbildung 5C). - Legen Sie Zebrafisch Larve (erholte sich von der Laserablation Experiment in Abschnitt 1 beschrieben) in einer Verhaltenstherapie Aufnahme Kammer (die auf einem Objektträger befestigt war) mit der ursprünglichen obere Dichtung entfernt (Abbildung 5D).
- Sammle 50 Pantoffeltierchen von Kultur (Schritt 2.3.5) mit einer Mikropipette und legen Sie sie in der Aufnahme-Kammer.
- Legen Sie ein Deckglas auf der Aufnahme-Kammer. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf das Deckglas vor der Platzierung auf der Wasseroberfläche der Aufnahme Kammer zur Einführung von Luft in der Kammer zu vermeiden.
Hinweis: In diesem Schritt wird etwas Wasser mit Pantoffeltierchen aus der Aufnahme Kammer Überlauf. Die verbleibende Anzahl der Pantoffeltierchen in der Aufnahme-Kammer werden ca. 30-40. - Legen Sie die Aufnahme-Kammer (mit einer Larve und Pantoffeltierchen) in das Beleuchtungssystem (Abbildung 5D).
- Starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme bei 10fps für 11 min (6.600 Bilder).
- (Optional) Beobachten Sie für jede Larve, die für das Verhalten getestet wurde die Fluoreszenz der Laser abgetragen Bereiche durch Fluoreszenz-Mikroskopie bestätigen die Wirksamkeit der Laser-Ablation (d.h., fehlen oder deutlich reduzierten Anzahl, fluoreszierende Zellen in der Laser bestrahlt Bereich).
Hinweis: Auch nach der Bestrahlung können einige fluoreszierenden Zellen noch aufgrund der späteren Beginn der Gal4-gen-Expression in Zellen beobachtet werden, die nach Ablation27unterschieden. - Nach der Aufnahme der Larve Verhalten, Ausgleich für die fehlende Einheitlichkeit im Hintergrund ausführen eine Pixel für Pixel-Abteilung jedes Rahmens durch eine durchschnittliche Bild in Fidschi: Klicken Sie auf "Bearbeiten", "Bild-Rechner", "Operation: Teilen" 32- Bit (Float) Ergebnis ", und" "OK" ". Um eine durchschnittliche Bild zu machen, klicken Sie auf "Bild", "Stacks", "Z-Projekt", 'Mittlere Intensità ¤ t' und 'OK' (Abbildung 5E, F).
- Count die Anzahl der Pantoffeltierchen noch in der Kammer durch Klicken auf "Analysieren", "Analysieren Teilchen", ein Bereich Einstellbereich, die alle das Pantoffeltierchen, deckt das Häkchen bei "Show: Masken", und klicken Sie auf "OK". Die Option "Show: Masken" bieten ein extrahierten Pantoffeltierchen Bild (Abbildung 5G), mit einer Liste die Anzahl der Teilchen (Pantoffeltierchen) in jedem Frame.
- Darstellen Sie die Anzahl verbleibender Pantoffeltierchen in der Aufnahme-Kammer im Laufe der Zeit. Da die Schätzungen über die Zahl der Pantoffeltierchen laut sind, empfiehlt es sich, einen gleitenden Durchschnitt auf jeden Punkt in einem Bereich von 600 Frames (1 min) auf dem Arbeitsblatt durchführen.
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Representative Results
Spezifische Neuronen wurden genetisch beschriftet mit EGFP oder GCaMP6s, deren Ausdruck in Gal4 Linien Gefahren wurden. Eine Gal4 Linie gSAIzGFFM119B wurde verwendet, um einen Kern im pretectal Bereich (magnozelluläre oberflächlichen pretectal Zellkern) und einer Subpopulation der Riechkolben Neuronen zu beschriften. Eine weitere Gal4-Linie, hspGFFDMC76A, wurde verwendet, um die ILH beschriften. Wir Laser-abgetragen pretectal Neuronen bilateral (Abbildung 2A linken) und auch Neuronen in den Riechkolben bilateral als ein Steuerelement (Abbildung 2A Rechte Abbildung) im zebrafischlarven der eine Gal4 Linie gSAIzGFFM119B abgetragen, die mit UAS:EGFP Reporter Fisch gedeckt wurden. Ergebnisse zeigen, dass die zwei-Photonen-Laser gezieltere Zellen Abtragen kann, wobei benachbarte Zellen oder Neuriten unberührt (Abbildung 2B).
Die pretectal Neuronen projizieren ihre Axone in Richtung der ILH ipsilaterally. Hier untersuchten wir die funktionelle Verknüpfung mit Ca Bildgebung. Neuronaler Aktivität in dieser Region beobachtet werden, als Ca Signale mit einer Ca-Sonde GCaMP6s (Abb. 4A), deren Ausdruck eine Gal4-Linie gSAIzGFFM119B trieb (Abbildung 4B) oder ein anderes Gal4-Linie hspGFFDMC76A (Abbildung 4 ( C). die farbigen Pfeilspitzen (Abbildung 4) zeigen Richtungen Schwimmen und Flugbahnen von Parameciumsowie farbcodierten Ca Signaländerungen in dem angegebenen Hirnareal, die durch den Anblick des Schwimmens hervorgerufen wurden Paramecium (Abbildung 4B-D). Pretetto (Abbildung 4B) und der ILH (Abb. 4C) zeigten neuronale Aktivität in der proximalen Gegenwart von Beute, was darauf hindeutet, dass beide neuronalen Aktivitäten optisch orientieren.
Durch die Verwendung der doppelten Gal4 GCaMP6s Larven (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), abgetragen wir pretectal Neuronen einseitig und weitere durchgeführt Ca Bildgebung neuronaler Aktivität in der pretetto und der ILH in die abgetragenen Larven zu beobachten. Die linke pretetto, die Laser abgetragen war zeigte Rückstände, keine neuronaler Aktivität (Abbildung 4D, oben links), was darauf hindeutet, dass Laser-Ablation erfolgreich war. Die ipsilateralen ILH ergab jedoch drastisch reduzierten neuronalen Aktivität (Abbildung 4D unten links), was darauf hindeutet, dass die wichtigen Input für die ILH von ipsilateral pretetto kommt. Im Gegensatz dazu ILH auf der anderen Seite der Laser abgetragen pretetto (Abbildung 4D unten rechts) zeigte neuronalen Aktivität vergleichbar mit der neuronalen Aktivität in der ipsilateralen pretetto (Abbildung 4D, oben rechts), die deutet darauf hin, dass die richtige ILH Eingänge von der richtigen pretetto empfängt.
Die Wahl welche Verhaltens Assays in einem Experiment verwenden hängt die möglichen Rollen der Neuronen untersucht. Hier zeigen wir ein Beispiel eines Beutefang Assays nach Abtragung von einem pretectal Kern, der als eine Beute Detektor21identifiziert wurde. Mit Hilfe der Beleuchtungsanlage, dargestellt in Abbildung 5A-D, kann die Anzahl der Paramecium in der Aufnahme-Kammer von Bildverarbeitung (Abbildung 5E-G) gezählt werden. Automatische Extraktion von Augen und Berechnung von Auge-Positionen (d. h., Änderungen in den Winkeln der Augen) kann auch möglich sein, weil die Augen der Zebrafisch-Larven dunkler als der Hintergrund bei diesen Lichtverhältnissen (Abbildung 5H erscheinen ).
Ergebnisse des Experiments zeigen, dass bilaterale-Ablation der pretectum abgeschafft Beutefang Aktivität (Abb. 5I, PT), während Ablation von einer Subpopulation von Neuronen in den Riechkolben nicht (Abbildung 5ich, OB). Diese Ergebnisse zusammen mit Experimenten, die in Abbildung 4dargestellte legen nahe, dass die Pretecto Hypothalamus Schaltung in Beutefang Verhalten wesentlich ist.
Abbildung 1 . Zebrafischlarven. (A) fünf Tage alten (5 Tage nach Befruchtung (5-Dpf)) Zebrafisch Larve und seine Beute, eine Paramecium. (B) 4-Dpf Perlmutt Larve in 2 % niedriger Schmelzpunkt Agarose eingebettet. Beachten Sie, dass die Perlmutt -Belastung Schwarzpigmente auf den Körper, fehlt während das retinale Pigmentepithel intakt ist. Maßstabsleiste: 0,5 mm. (C) Dissecting Nadel zebrafischlarven in Agarose orientieren. Maßstab: 1 cm. (D) Screenshot der Software verwendet, in der zwei-Photonen-Mikroskopie zeigt "Bleaching", "Time Series" und "Regionen" Platten, die verwendet wurden bei Ablation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Ablation von einer Subpopulation von Neuronen, die mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop. (A) EGFP fluoreszierende Bilder von 4-Dpf zebrafischlarven vor und nach der Ablation von Neuronen. Draufsicht und Seitenansicht des 3D rekonstruierten Z-Stapel Bilder mit Bildverarbeitungs-Software. Die Z-Stapel-Bilder wurden mit einem 20 X Objektiv. Die abgetragenen Bereiche (entweder pretetto oder Riechkolben) sind gelb markiert. Maßstab: 100 µm. (B) Beispiel für Laser-Ablation bei einer einzigen Brennebene mit der "Bleichen"-Funktion. Laser-Bestrahlung sind (gesetzt als ROIs) im Farben für jede Zelle gezeigt. Maßstab: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Vorbereitung der zebrafischlarven und Pantoffeltierchen für Ca Bildgebung. (A) Aufnahme Kammer. Ein handelsübliche 9 mm Durchmesser x 0,8 mm Tiefe Hybridisierung Dichtung mit 8 Kammern war als die Aufnahme Kammer genutzt. Die Dichtung wurde auf einen Objektträger gelegt und eingehalten. Das Siegel auf der Oberseite der Dichtung war abgeschält. (B) die Nylon-Mesh (32 µm) verwendet, um die Pantoffeltierchenzu spülen. Das Netz wurde auf einen 50-mL-Tube gelegt. (C) Paramecium Kultur mit Reisstroh und Hefe Granulat zu trocknen. (D) Paramecium Stammlösung aus der Kultur in C. (E) Paramecium Stammlösung gezeigt vorbereitet wurde mit System Wasser zweimal, um mögliche olfaktorischen und gustatorischen Signale in das Medium entfernen gespült. (F) Paramecium eingebettet in der Aufnahme-Kammer. Um einen Teil der Agarose zu entfernen, wurden mehrere Kürzungen vorgenommen. (G) Aufnahme Kammer mit einem Zebrafisch-Larven und ein Paramecium. Der Großteil der Agarose wurde entfernt, um das Paramecium schwimmen lassen. Der Leiter der Zebrafisch-Larven ausgesetzt ist. (H) aufrecht fluoreszierende Mikroskop in Ca Bildgebung verwendet. Das Mikroskop ist mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera ausgestattet. (ich) Zebrafisch Larve in der Aufnahme-Kammer unter dem Mikroskop mit das Anregungslicht auf. Mit einer 2,5 X Objektiv ist der beleuchteten Fläche etwas größer als die Größe der Kammer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Vertreter Ca Bilddaten. (A) Position der pretetto und der minderwertigen Lappen des Hypothalamus (ILH), in einer doppelten Gal4 hspGFFDMC76A gelb eingekreist; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s Zebrafisch-Larven. (B) Änderungen im pretectum Ca Signal (bilateral gemittelt), auf die Flugbahnen der ein Paramecium in eine gSAIzGFFM119B Farbe abgebildet; UAShspzGCaMP6s-Larve. Maßstab: 1 mm. (C) Änderungen im ILH Ca Signal (bilateral gemittelt), Farbe abgebildet auf die Flugbahnen der ein Paramecium in eine hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s-Larve. Maßstab: 1 mm. (D) Änderungen in der pretetto und der ILH Ca Signale Farbe abgebildet auf die Flugbahnen der ein Paramecium in eine hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s-Larve, die zwei-Photonen-Laserablation von der linken pretetto unterzogen wurde. Maßstab: 1 mm. Dieses Bild wurde aus dem gleichen reproduziert Daten zuvor21veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Beute Capture-Assay und Vertreter-Daten in Laser abgetragen zebrafischlarven. (A) Behavioral Recording-System. Das Stereomikroskop wurde mit einer CMOS-Kamera ausgestattet. Bilder wurden mit einem maßgeschneiderten Skript erworben. (B) Komponenten des Beleuchtungssystems. Ein grau-farbigem Papier, einem Glasdiffusor, weiße LED-Ringlicht, Diffusor, eine maßgeschneiderte Abstandhalter (Karton) und Diffusor mit einem Loch in der Mitte. (C) das Beleuchtungssystem aus in B. (D) Aufnahme Kammer für die Beute-Capture-Assay abgebildeten Teile zusammengefügt. Eine Kammer (Durchmesser: 20 mm; Tiefe: 2,5 mm) wurde auf einen Objektträger gelegt. Die ursprüngliche obere Dichtung der Kammer war abgeschält. Eine Glasabdeckung wurde auf der Aufnahme Kammer gelegt. (E) Raw-Bild aus einem Rahmen aus den aufgezeichneten Film. (F) A Frame geteilt (pixelweise) durch eine durchschnittliche Bild in einem Film. Beachten Sie, dass nicht einheitlichen Hintergrund Beleuchtung durch diese Bildverarbeitung ausgeglichen werden kann. (G) Pantoffeltierchen extrahiert aus einem Frame mit der Funktion "Partikelanalyse" in Fidschi. (H) Beispiel für Bild in Fidschi mit einer angewandten Schwelle. Pantoffeltierchen erscheinen hell, während die Augen der Zebrafisch-Larven erscheinen dunkel, und der Hintergrund ist grau. Veränderungen im Auge Positionen (d.h. Winkel in Bezug auf die Körperachse) können bei Bedarf berechnet werden. (ich) repräsentativen Versuchsdaten Paramecium Konsum in eine olfaktorische Birne abgetragen Kontrolle Larve (OB) und eine pretetto abgetragen Larve (PT). Pretectum Ablation deutlich reduziert Beute jagdlichen während Riechkolben Ablation hatte keinen Einfluss auf sie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl der zwei-Photonen-Laser eine hervorragende räumliche Auflösung hat, speziell Abtragen einzelne Neuronen, sollte große Vorsicht genommen werden, um unerwünschte Beschädigungen auf das Hirngewebe durch Hitze zu vermeiden. Der wichtigste Schritt bei der Ablation Experiment soll die optimale Höhe der Laserbestrahlung bestimmen. Unzureichende Bestrahlung schlägt fehl, die Neuronen zu töten. Zu viel Bestrahlung Hitzeschäden wird das umliegende Gewebe, was zu unerwünschten Effekten führt. Optimale Bereich der Laserbestrahlung (Bereiche des ROIs, Anzahl der Iterationen und Scan-Geschwindigkeit) scheint zu schmal sein. Einige Faktoren beeinflussen die Effizienz der Ablation.
Zunächst mithilfe von verschiedenen fluoreszierenden Reporter Proteine die Ablation Bedingungen für jeden Reporter optimiert werden müssen. GCaMP Ausdruck wird im Zytoplasma Kerne beobachtet. Im Gegensatz dazu erscheint EGFP Fluoreszenz in das Innere der Zelle, die für effiziente und spezifische Ablation der gezielten Zellen, im Vergleich zu GCaMP vorteilhaft sein kann. Die Verwendung von GCaMP ist auch nachteilig, da ein Laser abgetragen GCaMP exprimierenden Zellen aufweisen kann höhere Fluoreszenzintensität aufgrund unmittelbarer Ca Massenzustrom, im Gegensatz zu verringerten Fluoreszenzintensität als EGFP für Ablation verwendet wurde. Daher kann nicht die Änderung der Fluoreszenz ein zuverlässiger Indikator für das Ausmaß der Ablation mit GCaMP sein. In solchen Fällen ist die Ablation zu validieren, durch die Beobachtung der Verlust von fluoreszierenden Zellen nach einer bestimmten Zeit erforderlich. Abwesenheit oder signifikante Reduktion der Ca-Signale im Bereich Ablation kann ein weiteres Kriterium für erfolgreiche Ablation mit GCaMP sein.
Zweitens kann die (d.h., Scan-Geschwindigkeit, Iteration Anzahl der Scans) der Laserbestrahlung erforderlich für erfolgreiche Ablation abhängig von der Tiefe des Standortes der Neuronen von der Oberfläche des Gehirns variieren. Verglichen mit Zellen, die in der Nähe der Oberfläche, erfordern diejenigen befindet sich tief im Inneren des Gehirns weitere Laserbestrahlung, so machen es immer schwieriger, sie abtragen. Optimierung für die Höhe der Laserbestrahlung sollte speziell für jede gezielte Subpopulation von Neuronen bestimmt werden.
Drittens wurde empirisch festgestellt, dass die Festlegung verschiedener ROIs in einem kleinen Gebiet in einem Scan oft Hitze beschädigt des Gewebes rund um die Zellen als auch (gemessen durch das Auftreten von Luftblasen im Bereich Laser bestrahlt), während eine Zelle allein oder dünn targeting verteilte ROIs in einem Scan unter den gleichen Bedingungen haben keine schädliche Auswirkungen. In der vorliegenden Studie wurde bleichen nur auf eine kleine Region (etwa ein Drittel der Zellkörper Größe) angewandt, um Schäden an Gewebe außerhalb der gezielten Zellen zu vermeiden. In der Regel zielten 5-10 Zellen auf jeder Brennebene (4-8 Ebenen, decken den gesamten pretectal Bereich).
Neben der Optimierung des Betrags der Laserbestrahlung, ist umfassende Validierung der Laserablation von Kontrolle experimentieren entscheidend. Ein kontrollexperiment gehören Laser-Ablation von einem anderen Subpopulation von Zellen, die wahrscheinlich nicht einbezogen in das Verhalten untersucht werden. Riechkolben Neuronen mit der Bezeichnung in der gleichen Zeile Gal4 diente als Kontrolle in der vorliegenden Studie (Abbildung 2A, rechts, und Abbildung 5ich). Aus dem oben beschriebenen Grund können jedoch keine Gruppen von Neuronen als ideale Kontrolle dienen. Jeder Subpopulation von Neuronen unterscheidet sich von anderen in Bezug auf ihre Position im Gehirn, Zelldichte, fluoreszierende Reporter Transgene Ausdruck Ebene, die proliferationsrate und das Timing des Reporter Transgene Ausdrucks. Diese Unterschiede machen es unmöglich, die genaue dieselbe Einstellung für Ablation (die "Bleichen" Funktion) in Experimente verwenden. So sollten verschiedene Experimente, wie Messungen der optokinetischen Reaktion, visuelle Verhalten28und basale Aktivität in der Fortbewegung21 berücksichtigt werden, die spezifische Wirkung der Ablation zu gewährleisten.
Nach unserer Erfahrung nimmt die Ablation von Dutzenden von pretectal Zellen bilateral, ca. 1 h (von der Einbettung in Agarose, Ablation mit einem zwei-Photonen-Mikroskop, um Abrufen aus dem Agarose nach Ablation). Bis zu 8 Larven pro Tag (z.B., 4 Larven für experimentelle und 4 zur Steuerung) können abgetragen werden; daher ein paar Sätze von Experimenten erforderlich sein, um sicherzustellen, dass es genug Larven für eine experimentelle Gruppe gibt (z.B.n = 12) und eine Kontrollgruppe (z.B.n = 12). Darüber hinaus ist es wünschenswert, halben Tag oder einen Tag für die Larven zur Ablation (z.B.Laser-Ablation bei 4-Dpf gefolgt von Verhaltensstörungen Aufnahme bei 5-Dpf oder Ablation am Morgen, gefolgt von Ca Bildgebung am Nachmittag) Wiederherstellung zu ermöglichen. Während dieser Erholungszeit sollte jeder krank aussehende Larven aus der Studie ausgeschlossen werden.
Das Protokoll verwendet, um die gewonnenen Daten analysieren hängt ganz von der Zielsetzung der Studie. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Beziehungen zwischen der Position des Paramecium im Gesichtsfeld und neuronaler Aktivität in der pretetto und der ILH. Angesichts der langsamen Verfalls (~ Sekunden) der GCaMP6s Signale29, nur der Zeitpunkt der Erhöhung, aber nicht die Abnahme, der die GCaMP6s Signale korreliert mit der Lage des Paramecium. Die Ca-Signale können hoch sein, selbst wenn das Paramecium wegziehen. Daher nahmen wir nur höhere Fluoreszenzintensität von GCaMP6s in der Darstellung der Daten. Diese Art der Analyse erfordert oft nach Maß mit bestimmter Programmiersprachen oder Makrosprachen geschriebene Skripts. In diesem Dokument verwendeten Skripte sind auf Anfrage erhältlich.
Die zurückhaltende Zustand (d. h.Agarose eingebettet) könnte für die zebrafischlarven zu einem gewissen Grad stressig sein; Allerdings wir nicht beobachten scheinbare Stress-induzierte neuronaler Aktivität oder Verhalten in diesem Zustand im Vergleich zu den freischwimmenden Zustand21,22. Agarose eingebettet zebrafischlarven können mindestens 24 h, (wahrscheinlich mehr) ohne offensichtliche Probleme überleben. Paramecium-angetriebenen Ca Signale in der pretetto und der ILH in den eingeschränkten Zustand waren ähnlich wie im freischwimmenden Larven21. Zebrafisch visuelle Verhalten kann durch den zirkadianen Rhythmus gesteuert werden. Daher haben wir Verhaltensexperimente vom frühen bis späten Abend durchgeführt. Wildtyp und Kontrolle Larven verbraucht eine beträchtliche Anzahl von Pantoffeltierchen während dieser Aufnahmezeit.
Die Funktions- und Verhaltensstörungen Assays, die hier beschriebenen nutzen die am weitesten verbreitete Ausrüstung, die in vielen Laboratorien gefunden werden kann oder könnte einfach eingerichtet, und so sollte es breite Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Verhaltensforschung haben.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu berichten.
Acknowledgments
Diese Studien wurden durch Zuschüsse vom MEXT, JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP25290009, JP25650120, JP17K07494 und JP17H05984 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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