Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.
Abstract
動作における神経細胞の亜集団の役割を識別するためには、生きている動物の活動をブロックの結果をテストするのには不可欠です。レーザーアブレーションのニューロンは、神経細胞が選択的に蛍光プローブ付けこの目的のための効果的な方法です。現在の研究では、2 光子励起顕微鏡を使用して、その機能と行動の結果のテストは神経細胞の亜集団をアブレーション レーザーのプロトコルを説明します。本研究ではゼブラフィッシュ幼虫で獲物のキャプチャ動作は研究モデルとして使用されます。Pretecto 視床下部の回路動作をキャッチこの視覚的に駆動される獲物の根底に知られています。ゼブラフィッシュ pretectum レーザー蒸散、視床下部 (または喘鳴症; pretectal 投影のターゲット) の下の葉の神経活動を調べた。Pretectal アブレーション後獲物キャプチャ動作もテストされました。
Introduction
動作が脳の神経細胞の活動から発生する方法を理解するには、行動の生成に関与している神経回路を識別するために必要です。幼虫の段階で、ゼブラフィッシュは、理想的な動物モデル小さく、透明な脳の広範な領域での携帯電話の解像度で神経細胞の活動を調査することが可能になるため、動作に関連付けられている脳機能を勉強して、1の動作を観察しながら脳。特定のニューロンの神経活動のイメージングは、GCaMP2など遺伝的コード化カルシウム (Ca) 指標 (GECIs) の発明によって可能にしました。GCaMP トランスジェニックゼブラフィッシュ行動動物3Ca イメージングを行うことにより、機能的な神経回路動作を関連付けるために有用であると証明しました。
Ca イメージングは、神経活動と行動間の相関関係を示すことが、一方の抑制神経細胞の活動と行動にその consequence(s) をテストは、因果関係を示す、重要な手順です。これを達成するためにさまざまな方法があります: 特定の神経回路4、特定のニューロン5,6ハロロドプシン7などの光遺伝学的ツールの使用で神経毒の発現を変化させる遺伝子の突然変異の使用と対象となるニューロン8,9のレーザーアブレーションします。レーザーアブレーションは比較的少数の特定のニューロンの活動を排除することに特に適しています。神経細胞を殺すことによって神経細胞の活動の不可逆的な除去を促進する行動の結果を評価します。
ゼブラフィッシュの幼虫の段階で観察することができます 1 つの興味深い現象は、獲物のキャプチャ (図 1A) です。この視覚誘導、目的指向行動視力10、視覚運動変換11,12,13視知覚と認識の研究のため有利な実験システムを提供します。オブジェクト14,15,16,17,18, および意思決定19。どのように獲物は神経行動学20の中心的な質問をされている行動をキャッチ捕食者と獲物の検出が獲物につながる方法によって認識されます。本稿で我々 は、pretectum の核の投射によって形成される pretecto 視床下部の回路の役割に焦点を当てる (核 pretectalis 浅パルス大、以下、単に、pretectum として有名)、または喘鳴症に。獲物捕獲活動を減らす visual 獲物知覚21に関連付けられているまたは喘鳴症で神経活動を廃止し、pretectum のレーザー ・ アブレーションを示した。ここでは、実行するプロトコル レーザー アブレーションと幼虫のとおりゼブラフィッシュの Ca2 +イメージングと行動記録を使用してその効果をテストします。
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Protocol
1。 2 光子レーザー顕微鏡を用いたニューロンの亜種のアブレーション
注:Ca イメージング次アブレーションを実行する場合は、UAShspzGCaMP6s ライン21を使用します。アブレーションに続く行動の記録を実行する場合は、EGFP 陽性細胞の切除は GCaMP6s 発現細胞のよりも簡単に UAS:EGFP 線を使用します。
- 調査される特定のニューロン、UAS:EGFP または UAShspzGCaMP6s のラベル Gal4 ラインの交配の設定から始めます。必ず真珠についての得ることができるように、両方の親の真珠の背景を使用してください。
注:真珠については黒色素胞の体表面 (図 1B) を含まない。現在の研究、Gal4 ライン gSAIzGFFM119B (これは、pretectum のラベル) と別 Gal4 線 hspGFFDMC76A (これは、または喘鳴症のラベル) に使用される21。 - 交尾のセットアップの次の日、ゼブラフィッシュ卵を収集し、その時点で興味のニューロンが蛍光レポーターを表現する幼虫の段階にそれらを上げます。
- 2% 低融点アガロース (図 1B) のゼブラフィッシュ幼虫をマウントします。
- 2% アガロース ストック溶液を準備することによって開始: 2 g を溶解低融点アガロース粉末 100 mL システム水 (すなわち、循環水系の大人のゼブラフィッシュを維持するために使用される水) の22または E3 水23水を持って来ることによって電子レンジ、沸点と精力的に混合します。
- 沸騰するまで 2% 低融点アガロース株式は電子レンジします。6 cm のシャーレの蓋に agarose の 3.5 4.0 mL を注ぐ。Agarose 冷却してそれが続行する前に触ると暖かくなるまで待ちます。
- 次に、agarose の (この段階では麻酔しない) 単一の幼虫を配置します。つまり解離針 (図 1C) を使用して、直立位置と幼虫の向きの調整を保つ幼虫の適切な配置を確保するために agarose が固化するまで。
注:幼虫は agarose が固化しながら泳ぐ続けます。 - 幼虫を配置すると、完全に固めるための agarose のため 5 分を許可します。
- Agarose の上 tricaine 溶液 (1 作業濃度 × 0.4%) 5 mL を注ぐ。
注:レーザー焼灼時に幼虫の動きを避けるため、幼虫はアブレーションの手順で麻酔が保たれなければなりません。
- 2 光子レーザー顕微鏡システムで漂白の関数を使用して幼虫を切除します。
- 2 光子レーザー顕微鏡下でアガロース埋め込まれた幼虫を置き、顕微鏡システムを起動します。
- 画像集録ソフトウェアを起動し、レーザー (図 1D) をオンにする「レーザー」タブの"On"ボタンをクリックします。「取り込み中」から「モード ロック」に変更するレーザー「ステータス」を待つ
- 「チャンネル」タブの設定レーザーの波長 880 nm (最大電力: 約 2,300 mW) EGFP アブレーションまたは 800 nm (最大電力: 約 2,600 mW) GCaMP アブレーションの。
- 20 X 対物レンズを選択するには、レンズのリボルバーを手動で移動します。"GFP"を「検索」タブをクリックし、[光の経路を変更し、直接目で蛍光を見る。
- ビューの中心にゼブラフィッシュ仔脳を検索します。2 光子顕微鏡に戻るを取得する」タブをクリックします。
- '前にアブレーション' 条件のレコードとして (熱による損傷を避けるため) に高速スキャン速度で 20 X 対物レンズと z スタックのイメージを取る。アブレーションの実験 (図 2A) の前後に撮影した画像を後で比較します。Z スタックを取得するには、ピントを合わせた後 z スタック オプションを選択し、幼虫の脳の腹側の端に焦点を後の下限値 (「設定 1」ボタン"をクリックします) を設定し、上限値 (「過去の設定」ボタンをクリックします) を設定タブを展開する「Z スタック」をクリックして、脳の背側ほとんど表面。Z スタック画像集録を実行する「実験開始」ボタンをクリックします。
- 63 X 対物レンズを選択するには、レンズのリボルバーを手動で移動します。
- エピ蛍光顕微鏡に切り替える、目、ビューの中心に蒸散するのにセルを検索し、レーザー走査蛍光顕微鏡に戻るを取得する」タブをクリックして「検索」タブをクリックします。
- 「アクイジション ・ モード」タブで 256 x 256 で「フレーム サイズ」を設定します。「ライブ」をクリックし、目的の神経細胞を観察します。
- ほとんど背側から始まって、フォーカル プレーンのアブレーション過程のセルが、フォーカスを見つけます。
- 小型で円形の領域に「地域」関数を使用して利益 (率 ROI) の領域として各ニューロンの直径の約 3 分の 1 セルのサイズをマークします。
- 約 200 μ s/ピクセル、または 200 μ s/0.5 μ m のレーザー ドウェル時間に対応する x 256 ピクセル (134.42 μ m x 134.42 μ m)、13.93 s/256 にスキャン速度を設定します。また、セット 4 の繰り返し (' イテレーション サイクル: 4')。代わりに、イテレーションとスキャン速度の数を最適化十分な切除を達成しました。
- サンプル (アブレーション前後) や '領域 (Roi を設定) するには (図 1D) 使用するソフトウェアで同等の機能のイメージを「時間シリーズ (2 サイクル)」との組み合わせで、アブレーションの '漂白剤' 関数を実行します。
- (アブレーション) の前に最初のイメージと時系列 (アブレーション) 後 2 番目のイメージを比較することによってサイクル、漂白した後、バック グラウンド レベル (図 2B) で観察する標的細胞減少の蛍光を確認します。
- 蛍光がアブレーション後まだ存在する場合は、イテレーションの数を増やします。
- 次に、焦点面少し深い (すなわち、腹側に向かって)、移動し、非蒸散のセルが表示される次の焦点面を選択します。
- (ステップ 1.9) 上記のように漂白の関数を実行します。これらの手順を繰り返して、興味の神経構造のすべてのセルが蒸散されてください。
- 切断する神経構造を覆うすべての焦点面を通過した後廃止蛍光セルを確認します。まだ不十分なアブレーションにより蛍光するいくつかのセルがある場合レーザー-照射して再び前述のよう。
- 幼虫はレーザー照射後の agarose から回復する必要がある場合、幼虫に損傷を与える可能性がありますこのために agarose のそれを強制しようとしないでください。代わりに、慎重に削減するため小さな幼虫の周り agarose の垂直にその体の表面。麻酔が切れるとき、独自に泳ぐ agarose から幼虫を待ちます。
- アブレーションのため次の幼虫に進むか、調査中の動作に関与している神経細胞の別の人口を用いた制御実験を行います。
注:ここでは、コントロール、UAS:EGFP; の嗅球のニューロンとしてgSAIzGFFM119B の幼虫は、レーザー蒸散 (図 2A右) 上記と同じプロトコルを使用していた。 - 数時間または 1 日 Ca イメージング (セクション 2) または行動記録 (セクション 3) に続行する前にリカバリを許可します。この回復時間の間に (すなわち、通常自発的なスイミング、蒸散面積等周辺ない明らかな熱破損) の幼虫の状態をチェックし、体調不良の兆候を見せて幼虫を削除します。
2. カルシウム イメージング Pretectum アブレーション ゼブラフィッシュ幼虫の捕食誘発神経活動を記録するには
- 録音室の準備、接着面をガラス上にしてスライド ガラスに保護シール交配チャンバーのガスケットを入れて、上部のシールを削除します。
注:これは 9 mm 径、深さ (図 3A) 0.8 mm 小さな記録室を作成します。 - 次に、ナイロン メッシュを配置 (開口部のサイズ: 32 μ m) を切り拓いた底部を持っています 50 mL チューブに。キャップを使用して、チューブ (図 3B) にメッシュをアタッチします。
- ゾウリムシ(ある幼虫の視覚刺激として使用される獲物) を準備します。
注:ゾウリムシ培養 (手順 2.3.1 と 2.3.2) を準備事前。- 事前に、市販または学術のバイオ リソース センター24からゾウリムシ種子培養を取得します。
- オートクレーブ処理した稲わら、乾燥ビール酵母22 (図 3C) のペレットを含む水で数日間ゾウリムシの文化。
- 引き続いて 2 ふるいを通してゾウリムシ文化を注ぐ (150 μ m の開口部を持つ 1 つ 75 μ m の開口部を持つ別の後に続く)、文化からの残骸を削除します。
- ナイロン メッシュ (絞り値 13 μ m) に前の手順からフローでゾウリムシを収集します。
- 再使用水システム (図 3D) のスクイズ ボトル ガラス ビーカーにナイロン メッシュにゾウリムシを中断します。
- システム水 2 (図 3E) x メッシュ (図 3B) をすすいでください。
注:この手順の目的は、神経活動を視覚的に駆動を観察する本研究の目標は、すべての可能な匂いやゾウリムシ培養培地に含まれる呈を取り除くことです。 - 麻酔する場所 tricaine ソリューションのゼブラフィッシュの幼虫。
- 2% 低融点アガロースで単一の幼虫をマウントします。
- まず、2% 低融点アガロースを電子レンジ、agarose を集中 tricaine x 10 の 1/10 ボリュームを追加します。
- 記録室 (図 3A) に tricaine を含む agarose の一滴を配置します。
- 確認後 agarose があまりにもホットではない、アガロース、agarose の表面がわずかに凸状に見えるので、すぐに任意の余分な agarose の取り外しに (ステップ 2.5) から麻酔の幼虫を配置します。
- すぐに解離針 (図 1C) 直立位置に幼虫に合わせます。
注:これらの手順は、数秒間 agarose が固化する前に完了する必要があります。 - 幼虫を正しく配置すると、完全に固めるための agarose のため 5 分を許可します。その後、agarose の 1 の x tricaine 溶液の一滴を注ぐ。
- ゼブラフィッシュ幼虫の頭の周りアガロースを削除し、手術用のナイフを使用して泳ぐゾウリムシのスペースを確保します。これを行うには、まず、アガロース (図 3F) でいくつかの小さな切り傷を作る。その後、優しく室に関するシステム水を注ぐことによって余分な agarose を慎重に取り外します。
注:この段階で、tricaine が洗い流されます。 - 次に、1 つゾウリムシを視覚刺激として機能する記録室に入れてください。
注:ゾウリムシはゼブラフィッシュの幼虫の頭の近くに泳ぐ、それはニューロンの応答 (図 3G) を呼び起こすでしょう。 - エピ蛍光顕微鏡下で記録室の場所は科学的な CMOS カメラ (図 3H) が装備し、(図 3私) 2.5 X 対物レンズを選択します。
- GCaMP 蛍光信号の時間経過の録音を収集します。
- 装備のカメラ用画像集録アプリケーションを起動します。
- 「シーケンス ウィンドウ」をクリックしてしウィンドウの「ハード ディスク記録」を選択します。[スキャンの設定] セクションで、「フレーム カウント」900 または任意他の合計フレーム数希望を設定します。
注:利用可能な場合は、モジュールでコマ撮り録画ソフトウェアを使用 (ここでは、「ハード ディスク記録」) ハード ドライブにデータの効率的な保存を可能にします。 - 「キャプチャ」ウィンドウで 2 倍 (すなわち、33.3 fps)、30 ms とビニング 2 露出時間を設定します。
- タッチパネルを制御する顕微鏡、GCaMP あり GFP 励起/蛍光スペクトルと同様、GFP の設定フィルターを選択します。
- カメラ ビューとフォーカス (図 4A) で幼虫を検索に、「ライブを停止」をクリックして「スタート」ボタンをクリックして [キャプチャ] ウィンドウには、「ライブ」をクリックします。.Cxd または買収条件についての情報を保持しているその他の形式でムービーを保存します。
- 録音後フィジー25フリーソフトを使ってコマ撮り映画の脳構造に設定 ROI の平均のピクセル値を取得することによって GCaMP6s の蛍光シグナル (Ca シグナル) を分析します。
注:フィジーは多く便利なプラグで ImageJ のバージョンのプレインストールし、バイオ形式が .cxd 形式の画像ファイルを読むことができますプラグイン。 - 幼虫が録画中に少し移動する場合、フィジーで TurboReg プラグイン26によって画像の登録を実行します。メニューから 'プラグイン'、'登録'、および 'TurboReg' を選択します。
- 研究の目的に合わせてデータを分析する方法を検討してください。以下は、例です。
- F/F0 (蛍光強度各時、安静時、または任意の Ca トランジェントが発生しました前に蛍光強度で割った値) を次のように計算します。
- Pretectum または ROI マネージャーを使用してまたは喘鳴症に Roi を設定: メニューで、「分析」、「ツール」「ROI マネージャー」を選択・ ・ ロワ (図 4A) の一覧に"追加"。
- Roi の平均のピクセル値を計算 (すなわち、GCaMP6s の蛍光強度) ROI マネージャー パネルを選択する:"より、"「マルチ メジャー"と"OK"。スプレッドシート ファイルとして結果を保存します。
- 信号はノイズの多いは平均 11 時間-(移動平均) を使用してポイント スプレッドシート データを処理するアプリケーションのための信号です。
- F0 F (時間の経過と共に蛍光強度) を分割 (基底レベルで蛍光強度) 正規化された蛍光強度を計算します。データの可視化の例はの変更し、pretectum と、または喘鳴症で正規化された GCaMP6s の蛍光強度は色分けされゾウリムシ軌道 (図 4B - D) にマップされます。
3. 次のレーザーアブレーション行動の結果の評価
- 万国実体写真ビデオ カメラ装備で構成される行動記録システムを設定します。カメラを使用して、適切な画像取得ソフトウェアの商業またはカスタムメイド (図 5A)。
- ゾウリムシは画像処理で検出できるので、照明条件を最適化します。たとえば、スペーサー (図 5B) とリング ホワイト LED ライトを使用します。
注:距離と角度、LED サンプル (すなわち、暗い背景に明るいまたは明るい背景に暗い) とされ、したがって、成功した画像処理にとって重要の外観に影響します。スペーサー (図 5C) の最高の高さを決定します。 - (スライド ガラスに添付してあった)、行動記録室に元トップ シール削除 (図 5D) (セクション 1 で説明したレーザー ・ アブレーションの実験から復元) ゼブラフィッシュ幼虫を配置します。
- 文化 (ステップ 2.3.5) から 50ゾウリムシを収集マイクロ ピペットを使用して、記録室に置いています。
- 録音室の上にカバー スリップを置きます。カバー スリップでチャンバー内の空気を導入することを避けるために記録室の水表面に置く前に水の小滴を置きます。
注:このステップで、ゾウリムシといくつかの水が録音室からオーバーフローします。録音室でゾウリムシの残り数は、約 30-40 になります。 - 照明システム (図 5D) で (幼虫とゾウリムシを含む) 録音室を配置します。
- 11 分 (6,600 フレーム) の 10 fps でコマ撮りの録画を開始します。
- (省略可能)動作のテストされたそれぞれの幼虫のレーザーアブレーション (すなわち不在、または大幅に削減数、蛍光セルでの有効性を確認するための蛍光顕微鏡によるレーザー生成領域の蛍光を観察します。レーザー照射領域)。
注:照射後も、いくつかの蛍光セルまだ以降 Gal4 アブレーション27後区別細胞遺伝子発現の発症により観察できます。 - 背景には、均一性の不足を補うために、幼虫の行動を記録した後フィジーで平均画像の各フレームのピクセル単位で除算を実行します: 'のプロセス'、' イメージ電卓 'をクリック' 操作: 分割 '、32 ビット (float) 結果 '、および '。[Ok] '。平均のイメージをするためには、'イメージ'、'スタック'、' Z プロジェクト '、'平均強度'、'[ok]' (図 5E, F) をクリックします。
- すべてゾウリムシをカバーする区域の範囲を設定、粒子 '分析' '分析' をクリックして商工会議所の左にゾウリムシの数カウント' ショー: マスク ' チェック ボックスをチェックし、「OK」をクリックするとします。'ショー: マスク' オプションは、各フレームでパーティクル (ゾウリムシ) の数のリストを抽出したゾウリムシイメージ (図 5G) が提供されます。
- 時間をかけてレコーディング室に残っているゾウリムシの番号をプロットします。ゾウリムシの数の見積もりはぶれがあるために、スプレッドシート上の 600 のフレーム (1 分) の範囲の各ポイントで移動平均を実行することをお勧めします。
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Representative Results
特定のニューロンは EGFP と式は Gal4 行で運転された GCaMP6s 遺伝子標識しました。Gal4 ライン gSAIzGFFM119B は、pretectal エリア (大浅 pretectal 核)、および嗅球神経細胞の亜集団の核をラベルに使用されました。別の Gal4 ライン、hspGFFDMC76A、だった、または喘鳴症に使用されます。私たちレーザーアブレーション pretectal ニューロン両側 (図 2左) もゼブラフィッシュ幼生 Gal4 ライン gSAIzGFFM119B のコントロール (図 2右パネル) として両側嗅球のニューロンをアブレーションとします。UAS:EGFP レポーター魚と交配されました。結果は、2 光子レーザーは、隣接する細胞や神経突起の影響 (図 2B) を残しながら標的細胞を切除できることを示す.
Pretectal ニューロンは同側、または喘鳴症に向かって軸索をプロジェクトします。ここでは、Ca イメージングを使用して、機能の接続を調べた。Ca 信号として Ca プローブ GCaMP6s (図 4A) 式は、Gal4 ライン gSAIzGFFM119B によって駆動されたこの地域の神経活動を観察できる (図 4B) または別の Gal4 ライン hspGFFDMC76A (図 4C). 色付き矢印 (図 4) ショーは水泳の方向と色分けされた Ca 信号変更と同様、ゾウリムシ、軌道指定された脳の領域にスイミングの光景によって誘発したゾウリムシ(図 4B ~ D)。Pretectum (図 4B) と両方の神経の活動、視覚的に駆動されることを示唆して、獲物の近位の存在または喘鳴症 (図 4C), ニューロン活動の両方。
ダブル Gal4 GCaMP6s 幼虫 (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; を使用してUAShspzGCaMP6s)、我々 は、pretectum の神経活動と蒸散の幼虫または喘鳴症を観察する一方的とさらに行う pretectal ニューロンの Ca イメージングを蒸散しました。レーザー蒸散は左 pretectum を示したそのレーザー ・ アブレーションが成功したことを示唆しない神経活動 (図 4Dの左上) に残留。しかし、同側または喘鳴症は劇的に減らされた神経 (図 4D左下) を示した、または喘鳴症への主要な入力が同側の pretectum から来ることを示唆しています。対照的に、レーザー蒸散 pretectum (右下図 4D ) の反対側または喘鳴症を示した神経神経活動に匹敵する同側 pretectum (図 4D、右上) で、右または喘鳴症は右の pretectum からの入力を受信していることを示唆しています。
実験で使用する、行動分析の選択調査の下でニューロンの可能な役割に依存します。ここでは、次の獲物探知機21として同定された pretectal 核のアブレーション獲物捕獲の試金の例を紹介します。図 5A Dに示す照明システムを使用して、画像処理 (図 5E G) による録音室でゾウリムシの数を数えることができます。目の自動抽出と目の位置 (すなわち目の角度の変化) の計算も可能となりますゼブラフィッシュ幼虫の目がこの照明条件 (図 5H でバック グラウンドよりも暗く表示されるので).
実験の結果 (図 5I, PT) pretectum 廃止獲物捕獲活動の二国間アブレーションを表示は、嗅球の神経細胞の亜集団のアブレーションはしませんでしたが (図 5私 OB)。図 4に示す実験とともに、これらの結果は、pretecto 視床下部の回路が捕食行動に不可欠な示唆されました。
図 1.ゼブラフィッシュ幼虫。(A) 生後 5 日 (5 日後受精 5 dpf) ゼブラフィッシュ幼虫とその獲物、ゾウリムシ。(B) 4 dpf真珠幼虫は 2% 低融点アガロースに埋め込まれています。網膜色素上皮細胞がそのまま真珠層のひずみが体に黒の顔料を欠いていることに注意してください。スケール バー: 0.5 mm。 (C) 解剖針 agarose のゼブラフィッシュ幼虫の方向付けのために使用します。スケール バー: 1 cm。 (D) スクリーン ショット ソフトウェアの使用 2 光子顕微鏡のアブレーションで使用された「漂白」、「時系列」と「地域」のパネルを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.2 光子レーザー顕微鏡を用いたニューロンの亜種のアブレーションします。(A) ニューロンのアブレーション前後 4 dpf ゼブラフィッシュ幼虫の EGFP 蛍光画像。上から見るとイメージ処理ソフトウェアを使用して画像を 3 D 再構成 z-スタックの側面図。Z スタック画像は 20 X 対物レンズで撮影されました。0.49 (pretectum または嗅球) は黄色で囲んでいます。スケール バー: 100 μ m. (B)「漂白」関数を使用して 1 つの焦点面でのレーザーアブレーションの例。レーザー照射領域 (Roi として設定されます) は、各セルの色で表示されます。スケール バー: 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.Ca イメージングのゼブラフィッシュ幼虫とゾウリムシの準備。(A) 記録室。市販の 9 mm 直径 0.8 mm 深さ 8 室交配ガスケット × 録音室として利用されました。ガスケットはスライド ガラスに置いて、付着しました。ガスケットの上にシールを剥がしてみました。(B)ゾウリムシを洗浄して使用されるナイロン メッシュ (32 μ m)。メッシュは、50 mL の管に置かれました。(C)ゾウリムシ含む稲わらを培養酵母ペレットを乾燥し、なさい。(D)ゾウリムシC. (E)ゾウリムシ原液に示す文化から調製した原液 2 回培地で可能な嗅覚と味覚のキューを削除するシステム水で洗浄。(F)ゾウリムシは、記録室に埋め込まれます。アガロースの部分を削除するには、いくつかのカットが行われました。(G) 記録は、ゼブラフィッシュの幼虫とゾウリムシ商工会議所します。Agarose の大半は、泳ぐゾウリムシを許可するように削除されました。ゼブラフィッシュの幼虫の頭が公開されます。(H) 正立蛍光顕微鏡における Ca イメージング。顕微鏡は、科学的な CMOS カメラ搭載します。(私) ゼブラフィッシュの光励起による顕微鏡下で記録室の幼虫。2.5 X 対物レンズ照射領域はチャンバーのサイズより少し大きめです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.画像データ代表 Ca 。(A) 位置、pretectum と二重 Gal4 hspGFFDMC76A; に黄色で囲まれて (または喘鳴症)、視床下部の下葉のgSAIzGFFM119B;UAShspzGCaMP6s ゼブラフィッシュの幼虫。(B) 信号の変化 pretectum Ca (二国間の平均)、カラー マップ、gSAIzGFFM119B; でゾウリムシの軌道にUAShspzGCaMP6s の幼虫。スケール バー: 1 mm (C)、hspGFFDMC76A; でゾウリムシの軌跡にマップされた色、(平均二国間) または喘鳴症 Ca 信号の変化。UAShspzGCaMP6s の幼虫。スケール バー: 1 mm (D) の変更、pretectum および、hspGFFDMC76A; でゾウリムシの軌跡にマップされた色または喘鳴症 Ca シグナルgSAIzGFFM119B;左の pretectum の 2 光子レーザー ・ アブレーションを受けた UAShspzGCaMP6s の幼虫。スケール バー: 1 mm。このイメージは、同じから再現されたデータは以前21を公開します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.キャプチャ アッセイおよび代表データ レーザー蒸散ゼブラフィッシュ幼虫を捕食します。(A) 行動記録システム。個人差は、CMOS カメラが装備されていた。カスタム スクリプトを使用して画像を取得しました。(B) 照明システムのコンポーネントグレー色の紙、ガラスのディフューザー、白色 LED リング照明、ディフューザー、特注スペーサー (段ボール)、中心孔を持つディフューザー。(C) 照明システムは、獲物捕獲の試金に B. (D) 記録室の中示されている部品から組み立てられます。商工会議所 (径: 20 mm; 深さ: 2.5 mm) スライド ガラス上に置かれました。商工会議所の元トップのシールを剥がしてみました。ガラス カバーは、記録室に置かれました。(E) 記録されたムービーのフレームから Raw 画像。(F) A フレームは、映画で平均画像 (ピクセル単位で) を分割します。この画像処理による照明の不均一背景を償うことができることに注意してください。(G)ゾウリムシフィジーで「粒子分析」機能を使用してフレームから抽出します。(H) 適用されるしきい値とフィジーのイメージの例です。ゼブラフィッシュ幼虫の目が暗く、背景がグレイに対し、ゾウリムシは明るく、表示されます。必要に応じて、目の位置 (すなわち体軸角) の変化を計算できます。(私)ゾウリムシ消費嗅球蒸散コントロール幼虫 (OB) と pretectum アブレーション幼虫 (PT) の代表的な実験データ。Pretectum アブレーションは、嗅球のアブレーションは影響がなかったしながら獲物の狩猟能力を大幅削減。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
2 光子レーザーには、具体的には個々 のニューロンをアブレーションする優れた空間分解能がありますが、偉大な用心は、暑さで脳組織上の任意の不要な損傷を避けるために取られるべき。アブレーションの実験で最も重要なステップは、レーザー照射の最適な量を決定することです。不十分な照射は、ニューロンを殺すために失敗します。あまりにも多くの照射、熱損傷周囲の組織は、望ましくない効果になります。レーザー照射 (ROIs、イテレーション、およびスキャン速度の数の領域) の最適の範囲が狭いようです。アブレーションの効率に影響を与えるいくつかの要因。
最初に、異なる蛍光レポーター蛋白質を使用することによりアブレーション条件は各記者の最適化が必要です。GCaMP 式は、核を欠いて細胞で観察されます。対照的に、GCaMP と比較して、標的細胞の効率的かつ特定のアブレーションのために有利かもしれない細胞内で蛍光が表示されます。GCaMP の使用は、レーザー蒸散 GCaMP を表現する細胞は減少蛍光強度 EGFP を用いてアブレーションのときとは対照的に、即時の大規模な Ca 流入により増加した蛍光強度を表わすことができるにも不利。したがって、蛍光の変化は、GCaMP との範囲の信頼できる指標をすることはできません。このような場合は、特定期間の後蛍光細胞の損失を観察してアブレーションを検証する必要があります。不在または蒸散エリアの Ca 信号の大幅な削減は、GCaMP アブレーション成功した他の条件を指定できます。
第二に、成功したアブレーションに必要なレーザー照射量 (すなわち、スキャン速度、スキャンの回数) は、脳の表面から神経細胞の場所の深さによって異なります。表面近くに位置する細胞と比較して、脳の奥深くにあるものはよりレーザー照射、したがって、それらをアブレーションすることが難しく必要があります。ニューロンの各対象個体のため具体的にはレーザー照射量最適化決定してください。
第三に、それはその設定・ ロワの数 1 つのスキャンの小さな領域にしばしば熱損傷細胞だけでなく周囲の組織が観察された経験的 (レーザー照射領域における気泡の出現によって判断)、単独で、またはまばらに 1 つのセルを対象とするのに対し同じ条件下でスキャンで分散・ ロワは、有害な影響を持っていなかった。本研究では標的細胞以外の組織への損傷を避けるために漂白された適用だけの小領域 (約 3 分の 1 の細胞体のサイズ)。通常、5-10 のセルは、各焦点面 (pretectal 領域全体をカバーする 4-8 面) に目標とされました。
レーザー照射量を最適化することに加えて制御実験を行いレーザーアブレーションの広範な検証が重要です。1 つのコントロール実験は研究されている動作に関与する可能性があるセルの別の亜種のレーザーアブレーションを含めることができます。嗅球神経細胞同じ Gal4 行のラベル (図 2A、右、および図 5私) 本研究でコントロールとして提供しています。ただし、上記理由により、ニューロンのグループとして使用できるない理想的なコントロール。ニューロンの各亜種は脳、細胞密度、蛍光レポーター遺伝子発現レベル、増殖率と、レポーター遺伝子発現のタイミングの位置に関して他と異なります。これらの違いは、制御実験でアブレーション ('漂白剤' 関数) の正確な同じ設定を使用することは不可能。したがって、制御実験の種類も考慮されなければなりません、動視反応、視覚的な動作の28、および歩行21基底活性の測定など、アブレーションの特定の効果を確保するため。
私たちの経験では pretectal の細胞の数十のアブレーションは二国間、(アガロース、アブレーション後の agarose から取得する 2 光子顕微鏡を用いたアブレーションに埋め込む) から約 1 時間を取る。一日最大 8 幼虫 (例えば、実験的に 4 4 幼虫コントロール) 蒸散することができます。したがって、実験のセットのカップルは実験グループの十分な幼虫があることを確認する必要があります (例えば、n = 12) および制御グループ (例えば、n = 12)。さらに、日または幼虫アブレーション (例えば5-dpf や Ca イメージング午後に続く朝のアブレーションでの行動記録が続く 4 dpf でレーザーアブレーション) から回復するのに 1 日半を許可することをお勧めします。この回復時間の間にどんな病気に見える幼虫は研究から除外すべき。
得られたデータを分析に使用するプロトコルは、研究の目的に完全に依存します。本研究は、ゾウリムシ視野内の場所と、pretectum と、または喘鳴症で神経活動との関係に焦点を当てた。低速の減衰を考慮した (~ 秒) GCaMP6s 信号の29増加が減少ではなくタイミングだけ、GCaMP6s の信号と相関するゾウリムシの場所。Ca 信号は、ゾウリムシを動かすときにも高することができます。したがって、我々 はのみデータのプレゼンテーションの GCaMP6s の増加の蛍光強度を含まれて。このタイプの分析には、特定のプログラミング言語やマクロ言語で書かれたカスタム スクリプトしばしば必要があります。このペーパーで使用されるスクリプトのリクエストも承ります。
拘束条件 (すなわち、アガロース埋め込み) 可能性があります; ある程度ゼブラフィッシュ幼虫にストレスになります。ただし、我々 を観察しなかった明らかストレス誘発性の神経活動や動作がこの条件に自由遊泳条件21,22と比較した場合。ゼブラフィッシュの Agarose 埋め込まれた幼虫は、少なくとも 24 時間、(おそらくより多く) 見かけ上問題なくを生き残ることができます。ゾウリムシの pretectum に信号を駆動 Ca と拘束された状態でまたは喘鳴症で泳いで幼虫21観察に類似していた。概日リズムによるゼブラフィッシュ視覚的な動作を制御できます。したがって、後半に夕方から行動実験を行った。野生型の制御の幼虫は、このレコーディング期間中にゾウリムシのかなりの数を消費しました。
ここで説明した機能や動作の試金は多くの実験室の見つけることができるかを簡単に設定することができる最も一般的な機器を利用し、行動科学のさまざまな分野で幅広い用途があるはず従って。
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Disclosures
著者はレポートに利害の対立があります。
Acknowledgments
これらの研究は、文部科学省、日本学術振興会科研費助成番号 JP25290009、JP25650120、JP17K07494、および JP17H05984 から受け取った補助金によって賄われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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