Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att avlägsna en genetiskt märkt subpopulation av nervceller av en två-photon laser från zebrafisk larver.
Abstract
För att identifiera rollen av en subpopulation av nervceller i beteende, är det viktigt att testa konsekvenserna av blockerar dess aktivitet i levande djur. Laser ablation av nervceller är en effektiv metod för detta ändamål när nervceller är selektivt märkta med fluorescerande sonder. I den aktuella studien beskrivs protokoll för laser ablating en subpopulation av nervceller med två-foton Mikroskop och testning av dess funktionella och beteendemässiga konsekvenser. I denna studie används byte fånga beteende hos zebrafiskar larver som studien modell. Pretecto-hypotalamus kretsen är känt att ligger bakom denna visuellt-driven prey fånga beteendet. Zebrafiskar Pretetto var laser-avlägsnades och neuronal aktivitet i den underlägsna LOB i hypothalamus (Simones; målet pretectal projektionen) undersöktes. Prey fånga beteendet efter pretectal ablation testades också.
Introduction
För att förstå hur beteende uppstår från neuronal aktivitet i hjärnan, är det nödvändigt att identifiera de neurala kretsar som är involverade i framtagningen av detta beteende. På larvstadium, Zebrafiskar ger en idealisk djurmodell för studera hjärnfunktionen associerade med beteendet eftersom deras små, genomskinliga hjärnor gör det möjligt att undersöka neuronal aktivitet på en cellulär resolution inom ett brett område av den hjärnan medan du observerar den beteende1. Avbildning av neuronal aktivitet i specifika nervceller har blivit möjligt genom uppfinningen av genetiskt kodade kalcium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgena zebrafisk har visat sig vara användbar för att associera den funktionella neural kretsen med beteende genom att genomföra Ca imaging i beter sig djur3.
Medan Ca imaging kan påvisa korrelationer mellan neuronal aktivitet och beteende, för att Visa kausalitet, undertryckande av neuronal aktivitet och testa dess consequence(s) på beteende är viktiga steg. Det finns olika sätt att uppnå detta: användning av genetisk mutation som förändrar specifika neurala kretsar4, uttryck av nervgifter i specifika nervceller5,6, använda optogenetic verktyg såsom halorhodopsin7, och laser ablation av riktade nervceller8,9. Laser ablation är särskilt lämpad för att eliminera aktivitet i ett relativt litet antal specifika nervceller. Irreversibel eliminering av neuronal aktivitet genom att döda nervceller underlättar att bedöma beteendemässiga konsekvenser.
En intressant beteende som kan observeras vid larvstadium i zebrafisk är bytesdjur fånga (figur 1A). Denna visuellt-guidad, målinriktat beteende ger ett gynnsamt experimentella system för studier av synskärpa10, visuomotor transformation11,12,13, visuell perception och erkännande av objekt14,15,16,17,18, och beslutsfattande19. Hur bytesdjur är erkänd av rovdjur och hur byte upptäckt leder till offer att fånga beteendet har varit en central fråga i neuroethology20. I detta papper, vi fokuserar på rollen av pretecto-hypotalamus kretsen bildas av projektioner av en kärna i Pretetto (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hädanefter helt enkelt noteras som Pretetto) till PASIS. Laser-ablation av Pretetto visades att minska prey fånga verksamhet och avskaffa neuronal aktivitet i den PASIS som associeras med den visuella prey perception21. Här, laser protokoll för att utföra ablation och testa dess effekt med Ca2 + imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ablation av en Subpopulation av nervceller med två-photon Laser Mikroskop
Obs: Om användarna planerar utför Ca imaging följande ablation, Använd den UAShspzGCaMP6s linje21. Om användarna planerar utföra beteendemässiga inspelning efter ablation, använda den UAS:EGFP linjen, som ablation av andra-positiva celler är enklare att utföra än GCaMP6s-uttryckande celler.
- Börja med att ställa in parningen av en Gal4 linje som etiketter specifika nervceller studeras och UAS:EGFP eller UAShspzGCaMP6s. Var noga med att använda pärlemor bakgrunden för båda föräldrarna så att pärlemor homozygoter kan erhållas.
Obs: Homozygoter av pärlemor innehåller inga melanophores på kroppsytan (figur 1B). I förevarande studie, en Gal4 linje gSAIzGFFM119B (som etiketter i Pretetto) och en annan Gal4 linje hspGFFDMC76A (som etiketter i PASIS) är begagnade21. - På den följande dagen i inställningen för parning, samla zebrafiskar ägg och höja dem till den larvstadium varvid nervceller i intresse kommer att uttrycka fluorescerande reportrar.
- Montera zebrafiskar larven i 2% låg smältpunkt-agaros (figur 1B).
- Börja med att förbereda 2% agaros stamlösning: Lös upp 2 g låg smältpunkt agaros pulver i 100 mL system vatten (dvs, det vatten som används för att upprätthålla vuxen zebrafiskar i ett cirkulerande vattensystem)22 eller E3 vatten23, genom att föra vattnet till kokpunkt i mikrovågsugn, och blanda med kraft.
- Mikrovågsugn 2% låg smältpunkt agaros beståndet tills det kokar. Häll 3,5-4,0 mL Agarens på locket av en 6-cm petriskål. Vänta tills Agarens svalnar så att den är varm innan du fortsätter.
- Placera en enda larv (inte bedövas vid detta steg) i Agarens. Hålla justera position och orientering för larven så att det är upprätt, dissekera Barr (figur 1C), tills Agarens stelnar för att säkerställa korrekt placering av larven.
Obs: Larven fortsätter att simma runt medan Agarens stelnar. - När larven är placerad, Tillåt 5 min för Agarens att stelna helt.
- Häll 5 mL tricaine lösning (0,4% på 1 x arbetar koncentration) över Agarens.
Obs: För att undvika rörelser av larver under laser ablation, måste larverna hållas sövda under hela ablation förfarandet.
- Ablatera larven med funktionen blekning i ett två-foton mikroskopi lasersystem.
- Placera agaros-embedded larven under en två-photon laser skanning Mikroskop och starta systemet för mikroskopi.
- Starta programvaran bild förvärv och klicka på knappen ”On” på fliken ”Laser” aktivera lasern (figur 1D). Vänta tills ”Status” av laser ändra från ”upptaget” till ”-läge-låst”.
- På fliken ”kanaler” anger laserns våglängd på 880 nm (maximal effekt: cirka 2 300 mW) för andra ablation eller 800 nm (maximal effekt: ungefärligt 2.600 mW) för GCaMP ablation.
- Välj det 20 X objektivet genom att manuellt flytta linsen revolvern. Klicka på fliken ”hitta”, ”god Jordbrukarsed” att ändra de optiska vägarna och direkt Visa fluorescensen av ögat.
- Leta upp zebrafiskar larval hjärnan i mitten av Visa; Klicka på fliken ”förvärv” att gå tillbaka till de två-foton mikroskopi.
- Som en post av villkoret 'innan ablation', ta en z-stack bilden med de 20 X-objektivet med snabb skanning-fart (för att undvika värmeskador). Senare jämföra bilder tagna före och efter ablation experiment (figur 2A). För att få en z-stack, klicka på ”Z-Stack” för att markera alternativet z-stack och expandera fliken ange den nedre gränsen (Klicka ”Ange först” knapp ”) efter fokusering på den ventrala änden av larval hjärnan och ange den övre gränsen (klicka på knappen” Ställ in sista ”) efter fokusering på de dorsala mest-ytan av hjärnan. Klicka på ”Starta Experiment” knappen för att köra z-stack bild förvärv.
- Välj det 63 X objektivet genom att manuellt flytta linsen revolvern.
- Klicka på fliken ”hitta” för att växla till den epi-fluorescerande mikroskopi, hitta cellerna att vara avlägsnades i mitten av vy genom ögat, klicka på fliken ”förvärv” att gå tillbaka till laser scanning mikroskopi.
- Ställa in storleken ”ram” på 256 x 256 på fliken ”förvärv Mode”. Klicka på ”Live” och iaktta nervcellerna av intresse.
- Start från den dorsala-mest sidan, hitta ett fokalplan där cellerna att vara avlägsnades är i fokus.
- Markera en små, cirkulära området cirka en tredjedel cellens storlek i diameter på varje neuron som en region av intresse (ROI) med funktionen ”regioner”.
- Ange spolningshastighet 13.93 s/256 x 256 pixlar (134.42 µm x 134.42 µm), vilket motsvarar en laser uppehållstid på cirka 200 µs/pixel eller 200 µs/0,5 µm. Ange dessutom 4 repetitioner (' iterationsomgången: 4'). Alternativt kan du optimera antalet iterationer och avsökningen fart så att tillräcklig ablation uppnås.
- Utföra funktionen 'Blekning' för ablation, i kombination med 'tidsserierna (2 cyklar)' för att bild det provet (före och efter ablation) och 'Regioner' (ställa ROIs) eller motsvarande funktioner i den programvara som används (figur 1D).
- Genom att jämföra den första bilden (innan ablation) och den andra bilden (efter ablation) i tidsserien cykel, säkerställa att efter blekning, fluorescensen i riktade celler minskar som observerats på bakgrundsnivån (figur 2B).
- Om fluorescens är kvar efter ablation, öka antalet iterationer.
- Nästa, flytta fokalplanet något djupare (dvs.mot den ventrala sidan), och välja nästa fokalplanet där un-avlägsnad celler visas.
- Utföra blekning funktion som beskrivs ovan (steg 1,9). Upprepa dessa steg tills alla celler i neurala strukturen av intresse har varit avlägsnades.
- Efter att ha gått igenom alla de fokala plan som täcker de neurala strukturerna att vara avlägsnades, kontrollera cellerna för avskaffade fluorescens. Om vissa celler finns fortfarande vara fluorescerande på grund av otillräcklig ablation, laser-bestråla dem igen som beskrivs ovan.
- Om larven måste återkrävas från agaros efter laser irradiation, försök inte att tvinga det ur Agarens eftersom detta kan skada larven. Istället noggrant göra små nedskärningar i Agarens runt larven vinkelrätt ytan på dess kropp. Vänta sedan larven att simma av agaros på egen hand när bedövningsmedlet avtar.
- Gå vidare till nästa larven för ablation eller utföra kontroll experiment med en annan befolkning av nervceller som är oengagerade i beteende under utredning.
Obs: Här, som en kontroll, luktbulben nervceller i UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larver var laser-uppföljningsstudien använder samma protokoll som beskrivs ovan (figur 2A, höger). - Tillåt flera timmar eller 1 dag för återhämtning innan du fortsätter till Ca imaging (avsnitt 2) eller beteendemässiga inspelning (avsnitt 3). Under denna återhämtningstid, kontrollera larval hälsa (dvs, normala spontana simning, inga synliga värme-skador runt området avlägsnad, etc.) och ta bort larver som visar tecken på dålig hälsa.
2. kalcium Imaging att registrera bytesdjur-framkallat Neuronal aktivitet i larvaena Pretetto-uppföljningsstudien zebrafiskar
- Att förbereda en inspelning kammare, sätta en secure-seal hybridisering kammare packning på en glasskiva, med självhäftande vänd på glaset och avlägsna den övre tätningen.
Obs: Detta skapar en liten inspelning kammare som är 9 mm i diameter och 0,8 mm i djup (figur 3A). - Placera en nylon mesh (storleken på öppningen: 32 µm) på en 50 mL tub som har längst uppskuren. Använd den gemensamma jordbrukspolitiken för att fästa mesh på tuben (figur 3B).
- Förbereda den paramecia (som är bytet som ska användas som en visuell stimulans för larv).
Obs: Förbereda Paramecium kulturen (steg 2.3.1 och 2.3.2) i förväg.- Få paramecia utsäde kultur från kommersiella källor eller akademiska bio-resurs centra24 i förväg.
- Kultur den paramecium i flera dagar i vatten som innehåller Ånghärdad ris halm och en pellet av öl-torrjäst22 (figur 3C).
- Häll paramecium kulturen genom 2 siktar successivt (ett med en 150 µm bländare, följt av en annan med en bländare på 75 µm) att avlägsna skräp från kulturen.
- Samla paramecia i genomströmmande från föregående steg på en nylon mesh (13 µm bländare).
- Återsuspendering den paramecia på nylon mesh i en glasbägare med en squeeze flaska system vatten (figur 3D).
- Skölj mesh (figur 3B) i systemet vatten 2 x (figur 3E).
Obs: Syftet med detta steg är att ta bort eventuella möjliga odoranter och tastants som ingår i paramecium odlingssubstrat, som målet med föreliggande studie är att observera visuellt driven neuronal aktivitet. - Placera en zebrafiskar larv i tricaine lösningen att söva.
- Montera en enda larv i 2% låg smältpunkt agaros.
- Först, mikrovågsugn 2% låg smältpunkt agaros och Lägg till 1/10 volym 10 x koncentrerad tricaine Agarens.
- Placera en droppe tricaine-innehållande Agarens på inspelning kammaren (figur 3A).
- Efter att ha bekräftat Agarens är inte för varm, placera sövda larven (från steg 2.5) i Agarens, omedelbart ta bort någon överflödig agaros så att ytan Agarens ser något konvexa.
- Snabbt orientera larven till upprätt läge med en dissekera nål (figur 1C).
Obs: Dessa förfaranden måste slutföras inom flera sekunder innan Agarens stelnar. - När larven är korrekt placerad, Tillåt 5 min för Agarens att stelna helt. Därefter, häll en droppe 1 x tricaine lösning på Agarens.
- Ta bort Agarens runt huvudet på zebrafiskar larven och göra plats för den paramecium att simma med en kirurgisk kniv. För att göra detta, se först några små nedskärningar i Agarens (figur 3F). Sedan, ta försiktigt bort överflödigt Agarens genom att försiktigt hälla system vatten på kammaren.
Obs: I detta steg, kommer tricaine tvättas. - Nästa, lägga en paramecium i inspelning kammaren att fungera som en visuell stimulans.
Obs: När den paramecium simmar nära huvudet av zebrafisk larven, kommer att det framkalla en neuronal svar (figur 3G). - Plats inspelning kammaren under ett mikroskop för påljusfluorescens utrustad med en vetenskaplig CMOS kamera (figur 3H) och välj en 2,5 X objektiv (figur 3jag).
- Samla time-lapse inspelningar av GCaMP fluorescens signalerna.
- Starta programmet bild förvärv för utrustat kameran.
- Klicka ”sekvens” och välj ”Hard Disk Record” i fönstret. I avsnittet skanningsinställningar ange ”Frame räkningen” till 900 eller några andra totala bildrutenummer önskas.
Obs: Om tillgängligt, använda time-lapse inspelningsprogramvara med en modul (här, ”hårddisk Record”) som möjliggör effektiv lagring av data på en hårddisk. - I fönstret ”fånga” in exponeringstiden vid 30-ms (dvs, 33,3 fps) och Binning 2 x 2.
- På mikroskopet styra beröring panel, Välj ett filter för GFP, som GCaMP har liknande excitation/utsläpp spectra att GFP.
- Klicka på ”Live” på fönstret Capture att lokalisera larven i kameravyn och fokus (figur 4A), och sedan klicka på ”sluta leva” och klicka på ”Start”-knappen. Spara filmen i .cxd eller något annat format som innehar information om förvärvet skick.
- Efter inspelningarna, analysera GCaMP6s fluorescerande signalerna (Ca signaler) genom att erhålla medelvärdet pixelvärden för ROI på en hjärnstruktur i time-lapse film med hjälp av fri programvara Fiji25.
Obs: Fiji är en version av ImageJ med många användbara plug-i är förinstallerat och kan läsa .cxd format bildfiler med Bio-format plug-in. - Om larven flyttar något under inspelningen, utföra bildregistrering genom att köra den TurboReg plug-in26 i Fiji. Från menyn Välj 'Plugins', 'Registrering' och 'TurboReg'.
- Överväga hur man kan analysera data enligt syftet med studien. Följande är ett exempel.
- Beräkna den F/F0 (fluorescensintensiteten på varje gång, dividerat med fluorescensintensiteten i vila eller innan någon Ca övergående har uppstått) enligt följande:
- Ange ROIs för Pretetto eller den PASIS med ROI Manager: i menyn, Välj ”analysera”, ”verktyg”, ”ROI Manager”, och ”Lägg till” i listan över ROIs (figur 4A).
- Beräkna genomsnittlig pixelvärdena för ROIs (dvs., fluorescens intensiteter av GCaMP6s) genom att välja på panelen ROI Manager: ”mer” ”multi mäter”, och ”OK”. Spara resultaten som en kalkylbladsfil.
- Signalerna är bullriga, genomsnittlig signaler för 11 tidpunkter (glidande medelvärde) använder ett program som kan hantera kalkylbladsdata.
- Dividera F (fluorescens intensitet över tid) med F0 (fluorescensintensiteten på basal nivå) att beräkna normaliserade fluorescensintensiteten. Som ett exempel på datavisualisering, förändringar i normaliserade GCaMP6s fluorescensintensiteten i Pretetto och PASIS är färgkodade och mappas på paramecium trajectoriesen (figur 4B - D).
3. bedömning av beteendemässiga konsekvenser efter Laser Ablation
- Ställa in en beteendevetenskaplig inspelningssystem som består av ett stereoskop utrustad med en videokamera. Använda en kamera med en lämplig bild förvärv programvara, kommersiella eller skräddarsydda (figur 5A).
- Optimera villkoret belysning så att den paramecium kan upptäckas av bildbehandling. Till exempel använda en ring vit LED-ljus med en spacer (figur 5B).
Obs: Avståndet från, och vinkel, LED påverkar uppkomsten av provet (dvsljusa i mörk bakgrund eller mörka i ljus bakgrund) och är därför avgörande för framgångsrik bildbehandling. Bestämma bästa höjden av mellanlägget (bild 5C). - Placera en zebrafiskar larv (återhämtat sig från laser-ablation experimentet beskrivs i avsnitt 1) i en beteendevetenskaplig inspelning kammare (vilket var anslutet till en glasskiva) med den ursprungliga top seal bort (figur 5D).
- Samla 50 paramecia från kulturen (steg 2.3.5) med hjälp av en mikropipett och placera dem i inspelning kammaren.
- Placera ett täckglas ovanpå inspelning kammaren. Sätta en liten droppe vatten på täckglaset före utsläppande på vattenytan av inspelning kammaren för att undvika att införa luft i kammaren.
Obs: I det här steget kommer lite vatten med paramecia svämma över från inspelningen kammaren. Det återstående antalet paramecia i inspelning kammaren kommer att vara cirka 30-40. - Placera inspelning kammaren (innehållande en larv och paramecia) i belysningssystemet (figur 5D).
- Starta time-lapse inspelningen på 10 fps för 11 min (6.600 frames).
- (Valfritt) För varje larv som testades för beteende, iaktta fluorescensen av laser-uppföljningsstudien områden av fluorescerande mikroskopi bekräftar effektiviteten av laser-ablation (dvs, frånvaro eller avsevärt minskat antal, fluorescerande celler i laser-bestrålade området).
Obs: Även efter bestrålning, kan vissa fluorescerande celler fortfarande observeras på grund av senare insättande Gal4 genuttryck i celler som differentieras efter ablation27. - Efter inspelningen Larvens beteende, att kompensera för bristen på enhetlighet i bakgrunden, utföra en pixel-till-pixel-uppdelning av varje bildruta med en genomsnittlig bild i Fiji: Klicka på 'Bearbeta', 'Bilden kalkylator', ' drift: dela upp ', ' 32-bitars (float) resultat ', och ' OK'. En genomsnittlig bild, klicka på 'Bild', 'Travar', 'Z-projekt', 'Genomsnittliga intensitet' och 'OK' (figur 5E, F).
- Räkna antalet paramecia kvar i kammaren genom att klicka på 'Analysera', 'Analysera partiklar', inställningsområde ett område som täcker alla de paramecia, att 'Visa: masker' Markera kryssrutan och klicka på 'OK'. Alternativet 'Visa: masker' kommer att ge en extraherade paramecia bild (figur 5G), med en lista över antalet partiklar (paramecia) i varje ram.
- Rita antalet paramecia kvar i kammaren inspelning över tid. Eftersom uppskattningarna av antalet paramecia är bullriga, rekommenderar vi att utföra en glidande medelvärde på varje punkt i ett utbud av 600 ramar (1 min) på kalkylbladet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Specifika nervceller var genetiskt märkt med andra eller GCaMP6s, vars uttryck var drivande i Gal4 linjer. En Gal4 linje gSAIzGFFM119B användes för att namnge en kärna i det pretectal området (magnocellular ytliga pretectal nucleus), och en subpopulation av luktbulben nervceller. En annan Gal4 linje, hspGFFDMC76A, användes för att märka PASIS. Vi laser-avlägsnades pretectal nervceller bilateralt (figur 2A vänstra panelen) och också uppföljningsstudien nervceller i luktbulben bilateralt som en kontroll (figur 2A högra panelen) i zebrafiskar larver av en Gal4 linje gSAIzGFFM119B som parades med UAS:EGFP reporter fisk. Resultaten visar att två-photon-laser kan ablatera riktade celler medan angränsande celler eller neuriter opåverkad (figur 2B).
Pretectal nervceller projekt deras axoner mot PASIS ipsilaterally. Här, undersökt vi deras funktionella anslutning med Ca imaging. Neuronal aktivitet i denna region kan observeras som Ca signaler med en Ca sond GCaMP6s (figur 4A), vars uttryck drevs av en Gal4 linje gSAIzGFFM119B (figur 4B) eller en annan Gal4 line hspGFFDMC76A (figur 4 C). färgade pilspetsar (figur 4) visar simning riktningar och banor av den parameciumsom färgkodade Ca-signalförändringar i angivna hjärnan området, som var framkallat av åsynen av simning paramecium (Figur 4B-D). Både Pretetto (figur 4B) och PASIS (figur 4C) visade neuronala aktiviteten i proximala närvaro av bytesdjur, vilket tyder på att båda neuronala aktiviteter drivs visuellt.
Med hjälp av larvaena dubbel Gal4 GCaMP6s (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), vi avlägsnades den pretectal nervceller ensidigt och ytterligare utförs Ca imaging att iaktta neuronal aktivitet i Pretetto och PASIS i avlägsnad larverna. Den vänstra Pretetto som var laser-uppföljningsstudien visade kvarstående att ingen neuronal aktivitet (figur 4D, överst till vänster), vilket tyder på att laser-ablation var framgångsrik. Den ipsilaterala PASIS visade dock dramatiskt minskad neuronal aktivitet (figur 4D längst ner till vänster), vilket tyder på att stora ingången till PASIS kommer från den ipsilaterala Pretetto. Däremot PASIS på andra sidan av den laser-uppföljningsstudien Pretetto (figur 4D nederst till höger) visade neuronal aktivitet jämförbar med neuronala aktiviteten i den ipsilaterala Pretetto (figur 4D, överst till höger), som tyder att den rätt PASIS tar emot indata från den rätt Pretetto.
Valet av vilka beteendevetenskaplig analys att använda i ett experiment beror på den möjliga roller av nervceller under utredning. Här visar vi ett exempel på en byte-capture test efter ablation av en pretectal kärna som identifierades som ett bytesdjur detektor21. Med hjälp av belysningssystemet visas i figur 5A-D, kan antalet paramecium i inspelning kammaren räknas av bildbehandling (figur 5E-G). Automatisk extrahering av ögon och beräkning av eye positioner (dvs.förändringar i vinklarna för ögonen) kan också vara möjligt eftersom ögonen på zebrafiskar larven blir mörkare än bakgrunden i denna belysning villkor (figur 5H ).
Resultaten av experimentet visar att bilaterala-ablation av aktiviteten pretectum avskaffade prey-capture (Fig. 5I, PT) medan ablation av en subpopulation av nervceller i luktbulben inte gjorde (figur 5I, OB). Dessa resultat, tillsammans med experiment som visas i figur 4, tyder på att pretecto-hypotalamus kretsen är väsentliga i prey-capture beteende.
Figur 1 . Zebrafiskar larver. (A) fem - dag gammal (5-dagars efter fertilisering (5-dpf)) zebrafiskar larv och sitt byte, en paramecium. (B) 4-dpf pärlemor larv inbäddad i 2% låg smältpunkt agaros. Observera att de nacre stammen saknar svart pigment på kroppen medan retinal pigmentepitel är intakt. Skalstapeln: 0,5 mm. (C) Dissecting nål används för att orientera zebrafiskar larver i agaros. Skalstapeln: 1 cm. (D) skärmdump av programvaran används i de två-foton mikroskopi, visar ”tandblekning”, ”Time Series” och ”regioner” paneler som användes i ablation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Ablation av en subpopulation av nervceller med två-photon laser Mikroskop. (A) andra fluorescerande bilder av 4-dpf zebrafiskar larver före och efter ablation av nervceller. Ovanifrån och sidoutsikt över 3D rekonstruerade z-stack bilder med hjälp av programvara bildbehandling. Z-stack bilder var tagna med en 20 X objektiv. Avlägsnad områdena (antingen Pretetto eller luktbulben) är inringat i gult. Skalstapeln: 100 µm. ()B) exempel på laser ablation på en enda fokalplan med funktionen ”tandblekning”. Laser-bestrålade områden (ange som ROIs) visas med färger på varje cell. Skalstapeln: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . Beredning av zebrafisk larver och paramecia för Ca imaging. (A) inspelning kammare. En kommersiellt tillgänglig 9 mm diameter x 0,8 mm djup hybridisering packning med 8 avdelningar utnyttjades som inspelning kammaren. Packningen var sätta på en glasskiva och följs. Tätningen på toppen av packningen var skalade bort. ()B) nylon mesh (32 µm) brukade skölja den paramecia. Mesh placerades på en 50 mL tub. (C) Paramecium kultur som innehåller ris halm och torr jäst pellets. (D) Paramecium stamlösning beredd från kulturen visas i C. (E) Paramecium stamlösning var sköljas med system vatten två gånger för att ta bort eventuella lukt och luktintrycket ledtrådar på medellång. (F) Paramecium inbäddade i inspelning kammaren. Ta bort en del av agaros, gjordes flera nedskärningar. (G) inspelning kammare med en zebrafiskar larv och en paramecium. Flesta Agarens togs bort för att tillåta den paramecium att simma. Chef för zebrafiskar larven är utsatt. (H) upprätt fluorescerande Mikroskop används i Ca imaging. Mikroskopet är utrustad med en vetenskaplig CMOS-kamera. (jag) zebrafiskar larva i inspelning kammaren under lupp med excitation ljus på. Med en 2,5 X objektiv är det belysta området något större än storleken på kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Representant Ca imaging data. (A) positionen för Pretetto och den underlägsna LOB i hypothalamus (Elisabets), inringat i gult, i en dubbel Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebrafiskar larv. (B) ändringar i pretectum Ca-signalen (i genomsnitt bilateralt), färg-mappade till trajectoriesen av en paramecium i en gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larv. Skalstapeln: 1 mm. (C) ändringar i PASIS Ca signalen (i genomsnitt bilateralt), färg-mappade på trajectoriesen av en paramecium i en hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s larv. Skalstapeln: 1 mm. (D) ändringar i Pretetto och PASIS Ca signaler färg-mappade på trajectoriesen av en paramecium i en hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larv som utsattes för två-photon laser-ablation av den vänstra Pretetto. Skalstapeln: 1 mm. Denna bild var reproduceras från samma data tidigare publicerats21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Prey fånga assay och representativa data i laser-uppföljningsstudien zebrafiskar larver. (A) beteendemässiga inspelningssystem. Stereomikroskopet var utrustad med en CMOS kamera. Bilder förvärvades med hjälp av skräddarsydda skript. (B) komponenter av belysningssystem. En grå-färgade papper, en glas diffusor, vit LED-ring ljus, diffusor, en skräddarsydd spacer (papp) och diffusor med ett hål i mitten. (C) belysningssystemet samlat från de delar som visas i B. (D) inspelning kammare för byte fånga analysen. En kammare (diameter: 20 mm, djup: 2,5 mm) placerades på en glasskiva. Den ursprungliga toppa tätningen på avdelningen var skalade bort. En glas-cover sattes på inspelning kammaren. (E) Raw-bild från en bildruta på den inspelade filmen. (F), A frame dividerat (pixel-till-pixel) med en genomsnittlig bild i en film. Observera att icke-enhetlig bakgrund i belysning kan kompenseras genom denna bildbehandling. (G) Paramecia utvinns ur en ram med funktionen ”Partikelanalys” i Fiji. (H) exempel på bild i Fiji med en tillämpad tröskel. Paramecia visas ljusa, medan ögonen på zebrafiskar larven visas mörka och bakgrunden är grå. Förändringar i ögat positioner (dvs, vinklar med avseende på den kropp axeln) kan beräknas, om det behövs. (jag) representativa experimentella data paramecium konsumtion i ett lukt-glödlampa-uppföljningsstudien kontroll larv (OB) och en Pretetto-uppföljningsstudien larv (PT). Pretectum ablation betydligt byte jaktförmåga medan luktbulben ablation inte påverkade det. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om två-photon lasern har en utmärkt rumslig upplösning till specifikt ablatera enskilda nervceller, bör stor försiktighet iakttas att undvika oönskad skada på hjärnans vävnad på grund av värmen. Det viktigaste steget i ablation experimentet är att bestämma den optimala mängden laser irradiation. Otillräcklig bestrålning misslyckas att döda nervceller. För mycket bestrålning kommer värme-skada den omgivande vävnaden, vilket kommer att resultera i oönskade effekter. Den optimala rad laser irradiation (områden av ROIs, antal iterationer och avsökningen fart) verkar vara smala. Några faktorer som påverkar effektiviteten av ablation.
Först, genom att använda olika fluorescerande reporter proteiner, ablation villkoren behöver optimeras för varje reporter. GCaMP uttryck observeras i cytoplasman saknar kärnor. Däremot visas andra fluorescens hela insidan av cellen, som kan vara fördelaktiga för effektiv och specifika ablation av de riktade celler, jämfört med GCaMP. Användning av GCaMP är också ofördelaktiga som en laser-avlägsnades GCaMP-uttryckande cell kan uppvisar ökad fluorescensintensiteten på grund av omedelbara massiv Ca tillströmning, i motsats till minskad fluorescensintensiteten när andra användes för ablation. Förändringen i fluorescens inte kan således vara en tillförlitlig indikator på omfattningen av ablation med GCaMP. I sådana fall kan det vara nödvändigt att validera ablation genom att observera förlusten av fluorescerande celler efter en viss period. Frånvaro eller betydande minskning av de Ca signalerna i området avlägsnad kan vara ett annat kriterium för framgångsrik ablation med GCaMP.
Det andra kan (dvsscan hastighet, iteration antal skanningar) laser irradiation krävs för framgångsrik ablation variera beroende på djupet av placeringen av nervceller från ytan av hjärnan. Jämfört med celler ligger nära ytan, kräver de som ligger djupt inne i hjärnan mer laser irradiation, således, vilket gör det svårare att avlägsna dem. Optimering för laser irradiation bör fastställas särskilt för varje riktade subpopulation av nervceller.
Tredje, empiriskt konstaterades att fastställandet av ett antal ROIs i ett litet område i en scan ofta värme-skadade vävnaden runt cellerna samt (bedömt av uppkomsten av bubblor i området laser-bestrålade), medan inriktning en cell ensam eller glest distribuerade ROIs i en scan på samma villkor har inte skadliga effekter. I den aktuella studien tillämpades blekning endast på en liten region (cirka en tredjedel av storleken cellkroppen) för att undvika skador på vävnader utanför riktade cellerna. Normalt var 5-10 celler inriktade på varje fokalplan (4-8 plan att täcka hela pretectal området).
Förutom optimering av laser irradiation, är omfattande validering av laser ablation genom att utföra kontroll experiment kritisk. En kontroll experiment kan inkludera laser ablation av en annan subpopulation av celler som är osannolikt att vara inblandade i beteende studeras. Luktbulben nervceller märkt i samma Gal4 linje tjänstgjorde som kontroll i den aktuella studien (figur 2A, rätt, och figur 5jag). Dock av skäl som beskrivs ovan, kan inga grupper av nervceller fungera som en perfekt kontroll. Varje delpopulation av nervceller skiljer sig från de andra med avseende på deras position i hjärnan, cell densiteten, fluorescerande reporter transgenens uttryck nivå, andelen spridning och tidpunkten för reporter transgenens uttryck. Dessa skillnader gör det omöjligt att använda exakt samma inställning för ablation (funktionen 'Blekning') i kontroll experiment. Således bör olika typer av kontroll experiment också övervägas, såsom mätningar av optokinetic svar, visuella beteende28och basal aktivitet i locomotion21 att säkerställa effekten av ablation.
I vår erfarenhet tar ablation av dussintals pretectal cellerna bilateralt, ca 1 h (från inbäddning i agaros, ablation med två-foton Mikroskop, att hämta från Agarens efter ablation). Upp till 8 larver om dagen (t.ex., 4 larver för experimentella och 4 för kontroll) kan vara avlägsnades; därför ett par uppsättningar av experiment kan krävas för att säkerställa att det finns tillräckligt många larver för en experimentell grupp (t.ex., n = 12) och en kontrollgrupp (t.ex., n = 12). Dessutom är det önskvärt att tillåta hälften en dag eller en dag för larverna att återhämta sig från ablation (t.ex., laser ablation på 4-dpf följt av en beteendevetenskaplig inspelning på 5-dpf eller ablation på morgonen följt av Ca imaging på eftermiddagen). Under denna återhämtningstid exkluderas någon ful larver från studien.
Protokollet som används för att analysera de erhållna uppgifterna beror helt på syftet med studien. Föreliggande studie fokuserar på relationer mellan platsen för paramecium i synfältet och neuronal aktivitet i Pretetto och PASIS. Med tanke på det långsamma sönderfallet (~ sekunder) av GCaMP6s signaler29, endast tidpunkten för ökningen, men inte minskningen, av GCaMP6s signaler korrelerar med placeringen av den paramecium. Ca signalerna kan vara hög även om den paramecium flyttar bort. Därför ingår vi endast ökad fluorescensintensiteten hos GCaMP6s i datapresentationen. Denna typ av analys kräver ofta skräddarsydda skript skrivna med specifika programmeringsspråk eller makrospråk. De skript som används i detta dokument finns tillgängliga på begäran.
Återhållen villkoret (dvsagaros-embedded) kan vara stressande att larvaena zebrafiskar till viss del; dock vi inte konstatera uppenbara stressinducerade neuronal aktivitet eller beteende i detta tillstånd, jämfört med de frisimmande skick21,22. Agaros-embedded zebrafiskar larver kan överleva minst 24 h, (förmodligen mer) utan uppenbara problem. Paramecium-driven Ca signaler i Pretetto och PASIS i begränsad skick var liknande den som observerats i frisimmande yngel21. Zebrafiskar visuella beteende kan styras av dygnsrytmen. Därför genomförde vi beteende experiment från tidigt till sent på kvällen. Vildtyp och kontroll larver förbrukas ett betydande antal paramecia under denna inspelningstid.
Funktionella och beteendemässiga analyserna beskrivs här utnyttja den mest allmänt tillgänglig utrustning som kan hittas i många laboratorier eller kan vara lätt att ställa in, och det bör därför ha breda tillämpningar inom olika områden av beteendevetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter till rapport.
Acknowledgments
Dessa studier har finansierats genom bidrag från den MEXT, JSPS KAKENHI Grant nummer JP25290009, JP25650120, JP17K07494 och JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
- National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
- Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
