Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.
Abstract
Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L'ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l'attività neuronale nel lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.
Introduction
Per capire come comportamento nasce dall'attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l'attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento1. La formazione immagine dell'attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l'invenzione di indicatori codificato geneticamente calcio (Ca) (GECIs) come GCaMP2. Zebrafish transgenici GCaMP hanno dimostrato di essere utile per l'associazione funzionale circuito neurale con comportamento conducendo imaging Ca a comportarsi animali3.
Mentre la formazione immagine Ca può dimostrare correlazioni tra attività neuronale e comportamento, per mostrare la causalità, soppressione dell'attività neuronale e prova la sua consequence(s) il comportamento sono passi importanti. Ci sono vari modi per raggiungere questo obiettivo: utilizzare di mutazione genetica che altera i circuiti neurali specifici4, espressione delle neurotossine in neuroni specifici5,6, uso di strumenti di optogenetica come halorhodopsin7, e ablazione di neuroni mirate8,9laser. L'ablazione laser è particolarmente adatta per l'eliminazione di attività in un numero relativamente piccolo di neuroni specifici. Eliminazione irreversibile dell'attività neuronale uccidendo i neuroni facilita la valutazione comportamentale conseguenze.
Un comportamento interessante che può essere osservato nella fase larvale in zebrafish è la cattura di prede (Figura 1A). Questo comportamento visivamente guidato, obiettivo-diretto fornisce un favorevole sistema sperimentale per lo studio della acuità visiva10, trasformazione visuomotoria11,12,13, percezione visiva e riconoscimento della oggetti14,15,16,17,18e il processo decisionale19. Come preda è riconosciuto dai predatori e come preda rilevamento conduce alla preda cattura comportamento è stato una questione centrale in neuroethology20. In questa carta, ci concentriamo sul ruolo del circuito pretecto-ipotalamica formato da proiezioni di un nucleo nel pretetto (nucleo pretectalis superficialis pars magnicellulare, d'ora in avanti, semplicemente notato come il pretetto) per il ILH. Ablazione laser del Pretetto è stato indicato per ridurre l'attività di cattura di prede e abolire l'attività neuronale in ILH che è associato con la percezione visiva preda21. Qui, protocolli per l'esecuzione di laser ablazione e prova il suo effetto utilizzando Ca2 + imaging e registrazione del comportamento in zebrafish larve sono descritti.
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Protocol
1. ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni Laser
Nota: Se gli utenti intenzione di eseguire l'ablazione seguente imaging Ca, utilizzare il UAShspzGCaMP6s linea21. Se gli utenti intenzione di eseguire la registrazione del comportamento dopo ablazione, utilizzare la riga di UAS:EGFP, come l'ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto delle cellule che esprimono GCaMP6s.
- Iniziare impostando l'accoppiamento di una linea di Gal4 che etichette neuroni specifici per essere studiato e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurarsi di utilizzare lo sfondo di nacre per entrambi i genitori affinché nacre omozigoti possono essere ottenuti.
Nota: Gli omozigoti di nacre non contengono nessun melanofori sulla superficie del corpo (Figura 1B). Nel presente studio, un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 (che etichette il pretetto) e un altro Gal4 linea hspGFFDMC76A (che etichette il ILH) sono usate21. - Il giorno seguente dell'installazione degli amori, raccogliere le uova di pesce zebra e farli crescere fino allo stadio larvale, al punto che i neuroni di interesse esprimerà reporter fluorescenti.
- Montare la larva di pesce zebra in basso punto di fusione-agarosio al 2% (Figura 1B).
- Iniziare col preparare la soluzione di riserva di agarosio 2%: sciogliere 2 g di polvere a basso punto di fusione dell'agarosi in 100 mL di acqua di sistema (cioè, l'acqua utilizzata per mantenere zebrafish adulto in un sistema di ricircolo dell'acqua)22 o E3 acqua23, portando l'acqua a ebollizione in un forno a microonde e mescolando energicamente.
- Forno a microonde lo stock di basso punto di fusione agarosio 2% fino a ebollizione. Versare 3,5-4,0 mL di agarosio sul coperchio di una scatola di Petri 6 cm. Attendere che l'agarosio si raffredda in modo che sia caldo al tatto prima di procedere.
- Successivamente, inserire una singola larva (non anestetizzata in questa fase) in agarosio. Tenere regolando la posizione e l'orientamento della larva in modo che sia in posizione verticale, utilizzando un ago per dissezione (Figura 1C), fino a quando l'agarosio si solidifica per garantire il corretto posizionamento della larva.
Nota: La larva continuerà a nuotare intorno mentre l'agarosio si solidifica. - Una volta posizionata la larva, consentire 5 min per l'agarosio a solidificare completamente.
- Versare 5 mL di soluzione di tricaina (0,4% 1x concentrazione di lavoro) sopra l'agarosio.
Nota: Per evitare movimenti dalle larve durante l'ablazione laser, le larve devono essere tenute anestetizzate durante tutta la procedura di ablazione.
- L'ablazione della larva utilizzando la funzione sbianca in un sistema di microscopia del due-fotone laser.
- Posizionare la larva dell'agarosi-incastonato sotto un microscopio di scansione laser di due fotoni e avviare il sistema di microscopia.
- Avviare il software di acquisizione immagine e fare clic sul pulsante "On" nella scheda "Laser" per accendere il laser (Figura 1D). Attendere che lo "stato" del laser per cambiare da "Occupato" a "Mode-locking."
- Nella scheda "Canali", impostare la lunghezza d'onda del laser a 880 nm (potenza massima: circa 2.300 mW) per ablazione di EGFP, o a 800 nm (potenza massima: circa 2.600 mW) per GCaMP l'ablazione.
- Selezionare la lente dell'obiettivo X 20 spostando manualmente il revolver lente. Fare clic sulla scheda "Locate", fare clic su "GFP" per cambiare le vie ottiche e visualizzare direttamente la fluorescenza dall'occhio.
- Individuare il cervello larvale di zebrafish al centro della vista; quindi fare clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla microscopia del due-fotone.
- Come un record della condizione 'prima ablazione', prendere un immagine dello stack z con la lente dell'obiettivo X 20 ad alta velocità di scansione (per evitare danni dovuti al calore). Poi confrontare le immagini scattate prima e dopo l'ablazione esperimenti (Figura 2A). Per ottenere una z-pila, fare clic su "Z-Stack" per selezionare l'opzione z-stack ed espandere la scheda impostare il limite inferiore (clicca il "primo Set" pulsante") dopo la focalizzazione sul lato ventrale del cervello larvale e impostare il limite superiore (clicca sul pulsante"Imposta ultimo") dopo la messa a fuoco sul la maggior parte-superficie dorsale del cervello. Quindi, fare clic sul pulsante "Avvia esperimento" per eseguire l'acquisizione di immagini di z-stack.
- Selezionare l'obiettivo obiettivo 63X spostando manualmente il revolver lente.
- Fare clic sulla scheda "Locate" per passare alla microscopia epi-fluorescente, individuare le cellule per essere rimosso al centro della vista dall'occhio, quindi fare clic sulla scheda "Acquisizione" per tornare alla scansione microscopia laser.
- Nella scheda "Modalità di acquisizione", è possibile impostare la "grandezza" a 256 x 256. Fare clic su "Live" e osservare i neuroni di interesse.
- A partire dal lato dorsale più, trovare un piano focale in cui le cellule per essere rimosso sono a fuoco.
- Contrassegnare una piccola zona circolare di dimensioni di circa un terzo della cella di diametro su ogni neurone come una regione di interesse (ROI) utilizzando la funzione di "Regioni".
- Impostare la velocità di scansione di 13.93 s/256 x 256 pixel (134.42 µm x 134.42 µm), che corrisponde ad un tempo di permanenza del laser di circa 200 µs/pixel, o 200 µs/0,5 µm. Inoltre, impostare 4 ripetizioni (' ciclo di iterazione: 4'). In alternativa, di ottimizzare il numero di iterazioni e velocità di scansione in modo che sufficiente ablazione è raggiunto.
- Eseguire la funzione 'Sbianca' per ablazione, in combinazione con il 'Time series (2 cicli)' per realizzare l'immagine campione (prima e dopo ablazione) e «Regioni» (per impostare il ROIs) o funzioni equivalenti nel software utilizzato (Figura 1D).
- Confrontando la prima immagine (prima di ablazione) e la seconda immagine (dopo ablazione) della serie di tempo ciclo, garantire che dopo lo sbiancamento, la fluorescenza della diminuisce le cellule mirate a quella osservata a livello di sfondo (Figura 2B).
- Se fluorescenza è ancora presente dopo ablazione, aumentare il numero di iterazioni.
- Successivamente, spostare il piano focale leggermente più profondo (cioè, verso il lato ventrale) e scegliere il prossimo piano focale dove appaiono le cellule non-ablate.
- Eseguire la funzione sbianca come descritto in precedenza (punto 1.9). Ripetere questi passaggi fino a quando tutte le celle nella struttura neurale di interesse sono stato rimosso.
- Dopo aver attraversato tutti i piani focali che coprono le strutture neurali per essere rimossa, controllare le cellule per fluorescenza abolita. Se alcune celle si trovano ad per essere ancora fluorescente a causa di insufficiente ablazione, laser-irradiare li nuovamente come descritto sopra.
- Se la larva deve essere recuperato da agarosio dopo irradiazione del laser, non tentare di forzarlo fuori l'agarosio, perché questo potrebbe danneggiare la larva. Invece, attentamente fare piccoli tagli in agarosio intorno la larva perpendicolarmente alla superficie del suo corpo. Quindi, attendere che la larva di nuotare fuori di agarosio su proprio quando l'anestetico svanisce.
- Procedere alla prossima larva per ablazione o eseguire esperimenti di controllo utilizzando un'altra popolazione di neuroni che sono non coinvolto nel comportamento sotto inchiesta.
Nota: Qui, come un controllo, i neuroni del bulbo olfattivo in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larve erano ablazione laser usando lo stesso protocollo descritto in precedenza (Figura 2A, destra). - Consentire diverse ore o 1 giorno per il recupero prima di procedere a Ca imaging (sezione 2) o registrazione del comportamento (sezione 3). Durante questo tempo di recupero, verifica la salute larvale (cioè, nuoto spontanea normale, nessun danno apparente di calore intorno alla zona ablato, ecc.) e rimuovere le larve mostrando segni di cattiva salute.
2. calcio Imaging per registrare l'attività neuronale preda-evocato nelle larve di Zebrafish pretetto-ablazione
- Per preparare una camera di registrazione, mettere un giunto di alloggiamento di ibridazione del garantire-seal su un vetrino, con il lato adesivo rivolto verso il vetro e rimuovere la guarnizione superiore.
Nota: Questo crea una camera di registrazione piccolo che è di 9 mm di diametro e 0,8 mm di profondità (Figura 3A). - Successivamente, inserire una rete di nylon (dimensioni di apertura: 32 µm) su un tubo da 50 mL che ha fondo taglio aperto. Utilizzare il tappo per collegare la mesh sul tubo (Figura 3B).
- Preparare i Paramisha (che è la preda per essere utilizzato come stimolo visivo per larva).
Nota: La cultura di Paramecium (punti 2.3.1 e 2.3.2) di preparare in anticipo.- Ottenere la coltura di sementi Paramisha da fonti commerciali o24 centri accademiche bio-risorse in anticipo.
- Cultura il paramecio per diversi giorni in acqua contenente un pellet di lievito di birra secco22 (Figura 3C) e paglia di riso in autoclave.
- Versare successivamente la cultura di paramecio attraverso 2 setacci (una con apertura da 150 µm, seguita da un'altra con un'apertura di 75 µm) per rimuovere i detriti dalla cultura.
- Raccogliere Paramisha a scorrere-attraverso il passaggio precedente su una rete di nylon (apertura 13-µm).
- Risospendere i Paramisha sulla rete di nylon in un becher di vetro utilizzando una bottiglia squeeze dell'acqua impianto (Figura 3D).
- Sciacquare la mesh (Figura 3B) nel sistema acqua 2 x (Figura 3E).
Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di rimuovere qualsiasi possibile odoranti e tastants contenute nel terreno di coltura di paramecio , come l'obiettivo del presente studio è quello di osservare visivamente guidato attività neuronale. - Posto una larva di pesce zebra nella soluzione tricaina per anestetizzare.
- Montare una singola larva a basso punto di fusione agarosio al 2%.
- In primo luogo, a microonde di agarosio al 2% basso punto di fusione e aggiungere 1/10 di volume di 10x tricaina concentrato l'agarosio.
- Mettere una goccia di agarosio contenente tricaina sulla camera di registrazione (Figura 3A).
- Dopo aver confermato l'agarosio non è troppo caldo, inserire la larva anestetizzata (dal punto 2.5) l'agarosio, rimuovere immediatamente qualsiasi eccesso dell'agarosi affinché la superficie di agarosio sembra leggermente convessa.
- Orientare rapidamente la larva in una posizione eretta con un ago per dissezione (Figura 1C).
Nota: Queste procedure devono essere completate entro alcuni secondi prima che l'agarosio si solidifica. - Una volta la larva è posizionata correttamente, permettono di 5 min per l'agarosio a solidificare completamente. Quindi, versare una goccia di 1 x tricaine soluzione su agarosio.
- Rimuovere l'agarosio intorno alla testa della larva zebrafish e fare spazio per il paramecio a nuotare usando un bisturi. Per effettuare questa operazione, in primo luogo, fare alcuni piccoli tagli in agarosio (Figura 3F). Quindi, rimuovere delicatamente l'eccesso agarosio versando delicatamente sistema acqua sulla camera.
Nota: A questo punto, sarà lavato la tricaina. - Successivamente, mettere un paramecio nella camera di registrazione a servire come uno stimolo visivo.
Nota: Quando il paramecio nuota vicino alla testa della larva zebrafish, evocherà una risposta neuronale (Figura 3G). - Posto la camera di registrazione sotto un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CMOS scientifica (Figura 3H) e selezionare un 2,5 X lente dell'obiettivo (Figura 3io).
- Raccogliere le registrazioni time-lapse dei segnali di fluorescenza di GCaMP.
- Avviare l'applicazione di acquisizione di immagini per la fotocamera attrezzata.
- Fare clic su "Sequenza riquadro" e selezionare "Record di disco rigido" nel riquadro. Nella sezione impostazioni di scansione, impostare il "conteggio dei fotogrammi" per 900 o qualsiasi altro numero di telaio totale desiderato.
Nota: Se disponibile, utilizzare il software di registrazione time-lapse con un modulo (qui, "disco rigido Record") che consente l'efficiente salvataggio dei dati su un disco rigido. - Nel riquadro "Cattura", è necessario impostare il tempo di esposizione a 30-ms (cioè, 33,3 fps) e Binning 2 x 2.
- Il microscopio controllo pannello a sfioramento, scegliere un filtro impostato per GFP, come il GCaMP ha simili spettri di eccitazione/emissione di GFP.
- Fare clic su "Live" nel riquadro acquisizione per individuare la larva nella vista telecamera e messa a fuoco (Figura 4A) e quindi fare clic su "Stop Live" e fare clic sul pulsante "Start". Salvare il filmato in. cxd o qualsiasi altro formato che contiene informazioni relative alla condizione di acquisizione.
- Dopo le registrazioni, è possibile analizzare i segnali fluorescenti di GCaMP6s (Ca segnali) ottenendo i valori dei pixel medi per il ROI impostato su una struttura cerebrale nel filmato time-lapse utilizzando il software gratuito Fiji25.
Nota: Fiji è una versione di ImageJ con molti utili plug-in di preinstallato e può leggere file in formato. cxd con i Bio-formati plug-in. - Se la larva si sposta leggermente durante la registrazione, è possibile eseguire registratura delle immagini tramite il plug-in TurboReg26 in Fiji. Selezionare il menu 'Plugins', 'Registrazione' e 'TurboReg'.
- Considerare come analizzare i dati secondo l'obiettivo dello studio. Di seguito è riportato un esempio.
- Calcolare la F/F0 (intensità di fluorescenza in ogni momento, diviso per l'intensità della fluorescenza a riposo o prima che si è verificato eventuali transitori di Ca) come segue:
- Impostare ROIs il pretetto o ILH utilizzando il gestore di ROI: nel menu, selezionare "Analizzare", "Strumenti", "Manager di ROI" e "Aggiungi" per l'elenco dei ROIs (Figura 4A).
- Calcolare i valori dei pixel medi per il ROIs (cioè., intensità di fluorescenza di GCaMP6s) selezionando il pannello Gestione ROI: "More", "Multi-misura" e "OK". Salvare i risultati come un file di foglio di calcolo.
- Come i segnali sono rumorosi, media i segnali per 11 tempo-punti (media mobile) utilizzando un'applicazione in grado di gestire dati di foglio di calcolo.
- Dividere F (intensità di fluorescenza nel corso del tempo) da F0 (intensità di fluorescenza a livello basale) per calcolare l'intensità di fluorescenza normalizzata. Come un esempio di visualizzazione dei dati, cambia intensità di fluorescenza GCaMP6s normalizzato nel pretetto e il ILH sono color-coded e mappati sulle traiettorie paramecio (Figura 4B - D).
3. valutazione delle conseguenze comportamentali dopo ablazione Laser
- Impostare un sistema di registrazione del comportamento che consiste di uno stereoscopio dotato di una videocamera. Utilizzare una fotocamera con un'immagine appropriata acquisizione software, commerciale o su misura (Figura 5A).
- Ottimizzare le condizioni di illuminazione in modo che il paramecio può essere rilevato da elaborazione delle immagini. Ad esempio, utilizzare un'anello bianco LED luce con un distanziale (Figura 5B).
Nota: La distanza da e l'angolo di, il LED influisce sull'aspetto del campione (cioè, brillante sfondo scuro o scuro in fondo luminoso) e sono, pertanto, fondamentale per l'elaborazione di immagine di successo. Determinare la migliore altezza del distanziale (Figura 5C). - Posizionare una larva di pesce zebra (recuperata dall'esperimento di ablazione laser descritto nella sezione 1) in una camera di registrazione del comportamento (che è stato fissato a una lastra di vetro) con la guarnizione superiore originale rimossa(Figura 5).
- Raccogliere 50 Paramisha dalla coltura (passaggio 2.3.5) utilizzando una micropipetta e metterli nella camera di registrazione.
- Collocare un vetrino coprioggetto sopra la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di acqua su vetrini coprioggetto prima di mettere sulla superficie dell'acqua della camera per evitare l'introduzione di aria nella camera di registrazione.
Nota: In questo passaggio, un po' acqua con Paramisha traboccherà dalla camera di registrazione. Il numero rimanente di Paramisha nella camera di registrazione sarà circa 30-40. - Posizionare la camera di registrazione (contenente una larva e Paramisha) nel sistema di illuminazione(Figura 5).
- Avviare la registrazione time-lapse a 10 fps per 11 min (6.600 fotogrammi).
- (Opzionale) Per ogni larva è stato testato per comportamento, osservare la fluorescenza delle zone ablazione laser di microscopia fluorescente per confermare l'efficacia dell'ablazione laser (cioè, assenza o significativamente ridotte numero di cellule fluorescenti in l'area di laser-irradiati).
Nota: Anche dopo irradiazione, alcune cellule fluorescenti possono ancora essere osservati a causa della successiva insorgenza di Gal4 l'espressione genica in cellule differenziate dopo ablazione27. - Dopo aver registrato il comportamento di larva, per compensare la mancanza di uniformità in background, eseguire una divisione di pixel-per-pixel di ogni frame di un'immagine media in Fiji: fare clic su 'Processo', 'Immagine Calculator', ' operazione: dividere ', 32-bit (float) risultato ', e ' OK'. Per rendere un'immagine media, fare clic su 'Immagine', 'Pile', 'Z-Project', 'Media intensità' e 'OK' (Figura 5E, F).
- Una gamma di zona che copre tutti i Paramisha, l'impostazione del numero di numero di Paramisha lasciato nella camera cliccando 'Analizzare', 'Analizzare particelle', 'Visualizza: maschere' casella di controllo e facendo clic su 'OK'. L'opzione 'Visualizza: maschere' fornirà un'immagine estratta Paramisha (Figura 5G), con un elenco del numero di particelle (Paramisha) in ogni fotogramma.
- Tracciare il numero di sinistra Paramisha nella camera di registrazione nel tempo. Perché le stime del numero di Paramisha sono rumorose, si consiglia di eseguire una media mobile su ogni punto in una gamma di 600 fotogrammi (1 min) nel foglio di calcolo.
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Representative Results
Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un'altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura 2A pannello di sinistra) ed anche rimosso i neuroni nel bulbo olfattivo bilateralmente come controllo (pannello di destra diFigura 2A ) nelle larve di zebrafish di un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 che sono stati accoppiati con pesce reporter UAS:EGFP. I risultati mostrano che due fotoni laser può ablazione le cellule mirate, lasciando le cellule adiacenti o neurites inalterato (Figura 2B).
I neuroni pretectal proiettano loro assoni verso il ILH ipsilaterally. Qui, abbiamo studiato la loro connettività funzionale usando la formazione immagine di Ca. Attività di un neurone in questa regione può essere osservato come segnali di Ca con una sonda di Ca GCaMP6s (Figura 4A), cui l'espressione è stata guidata da un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 (Figura 4B) o un altro Gal4 linea hspGFFDMC76A (Figura 4 C). le punte delle frecce colorate (Figura 4) Visualizza indicazioni stradali nuoto e traiettorie di paramecio, come pure color-coded Ca-cambiamenti del segnale nell'area specificata del cervello, che sono stati evocati dalla vista di nuoto paramecio (Figura 4B-D). Sia il pretetto (Figura 4B) e l'attività neuronale ILH (Figura 4C) ha mostrato la presenza prossimale della preda, suggerendo che entrambe le attività neuronali sono visivamente guidate.
Utilizzando le larve Gal4 GCaMP6s doppie (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), abbiamo rimosso i neuroni pretectal unilateralmente e ulteriormente eseguiti Ca imaging per osservare l'attività neuronale nel pretetto e ILH nelle larve ablate. Il pretetto sinistra che era ablazione laser ha mostrato residua per nessuna attività neuronale (Figura 4D, in alto a sinistra), suggerendo che ablazione laser è stata eseguita correttamente. Tuttavia, il ipsilateral ILH ha mostrato drammaticamente ridotta attività neuronale (Figura 4D basso a sinistra), suggerendo che l'input principale per il ILH proviene il pretetto ipsilateral. Al contrario, il ILH su altro lato del pretetto ablazione laser (Figura 4D in basso a destra) hanno mostrato attività neuronale paragonabile all'attività neuronale nel pretetto ipsilateral (Figura 4D, in alto a destra), che suggerisce che la destra ILH è ricevendo l'input dal pretetto giusto.
La scelta di quale test comportamentali da utilizzare in un esperimento dipende i possibili ruoli dei neuroni sotto inchiesta. Qui, vi mostriamo un esempio di un'analisi di preda-cattura dopo ablazione di un nucleo pretectal che è stato identificato come un rivelatore di preda21. Utilizzando il sistema di illuminazione, mostrato nella Figura 5A-D, il numero di paramecio nella camera di registrazione può essere contato da image processing (Figura 5E-G). Automatizzato di estrazione degli occhi e calcolo delle posizioni dell'occhio (cioè, cambiamenti negli angoli degli occhi) può anche essere possibile, perché gli occhi della larva zebrafish appaiono più scuri rispetto allo sfondo in questa condizione di illuminazione (Figura 5H ).
Risultati dell'esperimento indicano che bilaterale-ablazione dell'attività pretectum abolita preda-cattura (fig. 5I, PT) mentre l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni nel bulbo olfattivo non ha fatto (Figura 5I, OB). Questi risultati, insieme a esperimenti illustrati nella Figura 4, indicano che il circuito pretecto-ipotalamico è essenziale nel comportamento di preda-acquisizione.
Figura 1 . Larve di zebrafish. (A) cinque - giorno-vecchio (5 giorni post-fertilizzazione (5-dpf)) zebrafish della larva e la sua preda, un paramecio. (B) 4-dpf nacre larva incorporato in agarosio al 2% basso punto di fusione. Si noti che il ceppo di nacre priva di pigmenti neri sul corpo mentre l'epitelio pigmentato retinico è intatto. Barra della scala: 0,5 mm. (C) dissecante ago usato per orientare le larve di zebrafish in agarosio. Barra della scala: 1 cm. (D) Screenshot del software usato in microscopia del due-fotone, mostrando pannelli "Sbianca", "Time Series" e "Regioni" che sono stati utilizzati in ablazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni laser. (A) immagini fluorescente EGFP delle larve di zebrafish 4-dpf prima e dopo l'ablazione dei neuroni. Vista dall'alto e vista laterale delle immagini 3D ricostruito z-stack utilizzando software di elaborazione immagine. Le immagini dello stack z sono state scattate con un obiettivo X 20. Le aree ablate (pretetto o bulbo olfattivo) sono cerchiate in giallo. Barra della scala: 100 µm. (B) esempio di ablazione laser in un unico piano focale utilizzando la funzione "Sbianca". Zone irradiate laser (impostato come ROIs) sono mostrati in colori su ciascuna cella. Barra della scala: 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Preparazione di larve di zebrafish e Paramisha per l'imaging di Ca. Camera di registrazione (A). Un diametro di commercialmente disponibile 9 mm x 0,8 mm profondità ibridazione guarnizione con 8 alloggiamenti è stato utilizzato come camera di registrazione. La guarnizione è stato messo su un vetrino e aderita. Il sigillo sulla parte superiore della guarnizione è stato sbucciato fuori. (B) la rete di nylon (32 µm) usata per risciacquare i Paramisha. La mesh è stato disposto su un tubo da 50 mL. (C) Paramecium cultura contenenti paglia di riso e lievito secco. (D) Paramecium soluzione madre preparata dalla cultura mostrato nella soluzione di riserva di C. (E) Paramecium è stato risciacquato con acqua sistema due volte per rimuovere possibili segnali olfattivi e gustativi in mezzo. (F) Paramecium incorporato nella camera di registrazione. Per rimuovere una porzione di agarosio, sono stati effettuati diversi tagli. (G) registrazione dell'alloggiamento con una larva di pesce zebra e un paramecio. La maggior parte dell'agarosio è stato rimosso per consentire il paramecio a nuotare. La testa della larva zebrafish è esposta. Microscopio fluorescente dritto (H) utilizzato nell'imaging di Ca. Il microscopio è dotato di una fotocamera CMOS scientifica. (io) Zebrafish larva nella camera di registrazione sotto il microscopio con la luce di eccitazione. Con un obiettivo X 2,5, l'area illuminata è leggermente più grande rispetto alle dimensioni della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Rappresentante Ca dati di imaging. (A) posizione del pretetto e il lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH), cerchiato in giallo, in una doppia Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; Larva di pesce zebra UAShspzGCaMP6s. (B) cambiamenti del pretectum segnale di Ca (una media di bilateralmente), colore-mappato sulle traiettorie di un paramecio in un gSAIzGFFM119B; Larva di UAShspzGCaMP6s. Barra della scala: 1 mm. (C) cambiamenti nel segnale ILH Ca (una media di bilateralmente), colore-mappati sulle traiettorie di un paramecio in un hspGFFDMC76A; Larva di UAShspzGCaMP6s. Barra della scala: 1 mm. (D) cambiamenti il pretetto e i segnali di ILH Ca colore-mappati sulle traiettorie di un paramecio in un hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; Larva di UAShspzGCaMP6s che è stato sottoposto ad ablazione laser di due fotoni del pretetto sinistra. Barra della scala: 1 mm. Questa immagine è stata riprodotta dallo stesso i dati precedentemente pubblicati21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Acquisizione dati di dosaggio e rappresentante nelle larve di zebrafish ablazione laser in preda. Sistema di registrazione del comportamento (A). Lo stereomicroscopio è stato dotato di una fotocamera CMOS. Immagini sono state acquisite utilizzando uno script su misura. (B) componenti dell'impianto di illuminazione. Una carta grigio-colorata, un diffusore di vetro, anello LED bianco luce, diffusore, un distanziale su misura (cartone) e diffusore con un buco al centro. (C) il sistema di illuminazione montato dalle parti nella camera di registrazione B. (D) per il dosaggio di cattura della preda. Una camera (diametro: 20 mm; profondità: 2,5 mm) è stato posto su un vetrino. La guarnizione superiore originale della camera è stata sbucciata fuori. Un coperchio di vetro è stato messo sopra la camera di registrazione. (E) immagine Raw da un fotogramma del filmato registrato. (F), un telaio diviso (pixel-per-pixel) per un'immagine media in un film. Si noti che lo sfondo non uniforme nell'illuminazione può essere compensato da questa elaborazione di immagine. (G) Paramisha estratte da un frame utilizzando la funzione "Analisi delle particelle" in Fiji. (H) esempio di immagine in Fiji con una soglia applicata. Paramisha appaiono più luminosi, mentre gli occhi della larva zebrafish appaiono scuri, e lo sfondo è grigio. Cambiamenti nelle posizioni dell'occhio (cioè, angoli rispetto all'asse del corpo) possono essere calcolati, se necessario. (I) dati sperimentali rappresentativi del consumo di paramecio in una larva di controllo olfattivo-lampadina-ablazione (OB) e una larva pretetto-ablazione (PT). Pretectum ablazione ridotto significativamente capacità venatorie preda mentre bulbo olfattivo ablazione non ha fatto effetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se il laser del due-fotone ha un'ottima risoluzione spaziale per specificamente l'ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell'esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di irradiazione del laser (aree di ROIs, numero di iterazioni e velocità di scansione) sembra essere strette. Alcuni fattori influenzano l'efficacia dell'ablazione.
In primo luogo, utilizzando proteine reporter fluorescenti differenti, le condizioni di ablazione bisogno di essere ottimizzato per ogni reporter. L'espressione GCaMP è osservata nel citoplasma privo di nuclei. Al contrario, fluorescenza EGFP appare in tutto l'interno della cellula, che può essere vantaggiosa per ablazione efficiente e specifico delle cellule mirate, rispetto al GCaMP. L'uso di GCaMP è anche svantaggioso come una cella di GCaMP-esprimendo la ablazione laser possa esibire aumento della fluorescenza intensità a causa immediata massiccio afflusso di Ca, in contrasto con l'intensità di fluorescenza in diminuzione quando EGFP è stato usato per ablazione. Così, il cambiamento di fluorescenza non può essere un indicatore affidabile della misura dell'ablazione con GCaMP. In tali casi, può essere necessario convalidare l'ablazione osservando la perdita di cellule fluorescenti dopo un periodo specifico. Assenza o riduzione significativa dei segnali Ca in zona ablato può essere un altro criterio per riuscita ablazione con GCaMP.
In secondo luogo, la quantità (cioè, velocità di scansione, numero di iterazione di scansioni) di irradiazione del laser necessaria per la riuscita ablazione può variare a seconda della profondità della posizione dei neuroni dalla superficie del cervello. Rispetto alle cellule situate vicino alla superficie, quelli che si trovano dentro il cervello richiedono più irradiazione laser, così, rendendo più difficile per loro l'ablazione. Ottimizzazione per la quantità di irradiazione del laser deve essere determinata specificamente per ogni sottopopolazione mirata dei neuroni.
In terzo luogo, è stato osservato empiricamente che l'impostazione di un numero di ROIs in una piccola area in un'unica scansione spesso danneggiata dal calore il tessuto intorno alle cellule pure (giudicati dalla comparsa di bolle nella zona laser-irradiati), considerando che il targeting una cella da solo, o scarsamente ROIs distribuita in una scansione nella stessa circostanza non ha avuto effetti nocivi. Nello studio presente, lo sbiancamento è stato applicato solo su una piccola regione (circa un terzo della dimensione del corpo cellulare) per evitare danni ai tessuti fuori le cellule mirate. In genere, 5-10 celle erano mirate su ogni piano focale (4-8 aerei per coprire l'intera area pretectal).
Oltre a ottimizzare la quantità di irradiazione del laser, la convalida estesa dell'ablazione laser effettuando esperimenti di controllo è fondamentale. Un esperimento di controllo possono includere l'ablazione laser di un'altra sottopopolazione delle cellule che è improbabile che siano coinvolte nel comportamento in fase di studio. Neuroni del bulbo olfattivo etichettati nella stessa linea Gal4 servito da controllo nello studio presente (Figura 2A, giusto e Figura 5io). Tuttavia, per il motivo descritto sopra, non gruppi di neuroni possono servire come un controllo ideale. Ciascuna delle sottopopolazioni di neuroni differisce dagli altri rispetto alla loro posizione nel cervello, la densità delle cellule, livello di espressione del transgene reporter fluorescente, il tasso di proliferazione e la tempistica dell'espressione del transgene reporter. Queste differenze rendono impossibile utilizzare l'impostazione stessa esatta per ablazione (la funzione di 'Sbianca') in esperimenti di controllo. Così, diversi tipi di esperimenti di controllo dovrebbero essere anche considerati, quali la misura della risposta optokinetic, comportamento visivo28e attività basale nella locomozione21 per garantire l'effetto specifico dell'ablazione.
Nella nostra esperienza, l'ablazione delle dozzine delle cellule pretectal bilateralmente, prende circa 1 h (da incorporare in agarosio, ablazione utilizzando un microscopio a due fotoni, a recuperare dall'agarosio dopo ablazione). Larve fino a 8 al giorno (per esempio, 4 larve per 4 e sperimentali per il controllo) può essere rimossa; da qui, un paio di set di esperimenti potrebbe essere necessario garantire che vi siano abbastanza larve per un gruppo sperimentale (ad esempio, n = 12) e per un gruppo di controllo (ad esempio, n = 12). Inoltre, è opportuno consentire di mezza giornata o un giorno per le larve di recuperare dall'ablazione (ad es., ablazione laser a 4-dpf seguita da una registrazione del comportamento alle 5-dpf o ablazione al mattino seguita da formazione immagine di Ca nel pomeriggio). Durante questo tempo di recupero, eventuali larve dall'aspetto malato dovrebbero essere esclusi dallo studio.
Il protocollo utilizzato per analizzare i dati ottenuti dipende completamente l'obiettivo dello studio. Il presente studio incentrato sui rapporti tra la posizione di paramecio nel campo visivo e l'attività neuronale nel pretetto e il ILH. Considerando il lento declino (~ secondi) del GCaMP6s segnali29, solo i tempi di aumento, ma non la diminuzione, della GCaMP6s segnali correla con la posizione di paramecio. I segnali di Ca possono essere elevati anche quando il paramecio si allontanano. Quindi, abbiamo incluso solo aumento della fluorescenza intensità di GCaMP6s nella presentazione dei dati. Questo tipo di analisi richiede spesso su misura script scritti con linguaggi di programmazione specifici o linguaggi macro. Gli script utilizzati in questo documento sono disponibili su richiesta.
La condizione contenuta (vale a dire, incorporato agarosio) potrebbe essere stressante per le larve di zebrafish in una certa misura; Tuttavia, non abbiamo osservato le attività neuronale indotta da stress apparente o comportamento in questa condizione, se confrontato con la condizione liberamente natante21,22. Larve di zebrafish incorporato dell'agarosi possono sopravvivere almeno 24 h, (probabilmente più) senza alcun problema apparente. Paramecium-guidato Ca segnali nel pretetto e ILH nella condizione vincolata erano simili a quello osservato nelle larve liberamente natante21. Zebrafish comportamento visivo può essere controllato dal ritmo circadiano. Quindi, abbiamo condotto esperimenti comportamentali da presto fino a tarda sera. Wild type e controllo larve consumato un numero significativo di Paramisha durante questo tempo di registrazione.
Le analisi funzionali e comportamentali descritte qui utilizzano le attrezzature più comunemente disponibile che possono essere trovato in molti laboratori o potrebbero essere facilmente impostato, e così dovrebbe avere vaste applicazioni in diversi campi della scienza del comportamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse al rapporto.
Acknowledgments
Questi studi sono stati finanziati da contributi ricevuti dal MEXT, JSPS KAKENHI Grant numeri JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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