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Neuroscience

Zebrafish लार्वा में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक दो-फोटॉन लेज़र और उसके मूल्यांकन का उपयोग करके एक न्यूरॉन जनसंख्या का पृथक

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57485
Automatic Translation
1, 1
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

Summary

यहां, हम Zebrafish लार्वा से एक दो फोटॉन लेजर द्वारा न्यूरॉन्स के एक आनुवंशिक रूप से लेबल उपजनसंख्या ablate करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

व्यवहार में न्यूरॉन्स की एक उपजनसंख्या की भूमिका की पहचान करने के लिए, यह जीवित पशुओं में अपनी गतिविधि को अवरुद्ध करने के परिणामों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है. लेजर न्यूरॉन्स के पृथक इस प्रयोजन के लिए एक प्रभावी तरीका है जब ंयूरॉंस चुनिंदा फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल कर रहे हैं । वर्तमान अध्ययन में, लेजर के लिए प्रोटोकॉल ablating एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर न्यूरॉन्स की एक उपजनसंख्या और उसके कार्यात्मक और व्यवहार परिणामों के परीक्षण वर्णित हैं. इस अध्ययन में, zebrafish लार्वा में उलझकर कब्जा व्यवहार एक अध्ययन मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । pretecto-हाइपोथैलेमस सर्किट इस नेत्रहीन संचालित शिकार आबाद व्यवहार को पकड़ने के लिए जाना जाता है । Zebrafish pretectum लेजर ablated थे, और hypothalamus के अवर पालि में न्यूरॉन गतिविधि (ILH; pretectal प्रोजेक्शन के लक्ष्य) की जांच की गई । शिकार कब्जा व्यवहार के बाद pretectal पृथक भी परीक्षण किया गया था ।

Introduction

समझने के लिए कैसे व्यवहार मस्तिष्क में न्यूरॉन गतिविधि से पैदा होता है, यह है कि व्यवहार की पीढ़ी में शामिल कर रहे हैं तंत्रिका सर्किट की पहचान करने के लिए आवश्यक है. लार्वा मंच पर, zebrafish व्यवहार के साथ जुड़े मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श पशु मॉडल प्रदान करता है क्योंकि उनके छोटे, पारदर्शी दिमाग के एक व्यापक क्षेत्र में एक सेलुलर संकल्प पर न्यूरॉन गतिविधि की जांच करने के लिए यह संभव बनाने मस्तिष्क जबकि व्यवहार1अवलोकन । विशिष्ट ंयूरॉंस में ंयूरॉन गतिविधि के इमेजिंग के आविष्कार के माध्यम से संभव हो गया है आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम (सीए) संकेतक (GECIs) जैसे GCaMP2। GCaMP ट्रांसजेनिक zebrafish व्यवहार के साथ कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट से संबद्ध करने के लिए उपयोगी साबित किया है पशु बर्ताव में सीए इमेजिंग3।

जबकि सीए इमेजिंग ंयूरॉंस गतिविधि और व्यवहार के बीच सहसंबंध प्रदर्शित कर सकते हैं, के लिए भिंन दिखाने के लिए, ंयूरॉन गतिविधि का दमन और उसके परिणाम (s) व्यवहार पर परीक्षण महत्वपूर्ण कदम हैं । वहां विभिंन तरीकों से इस लक्ष्य को प्राप्त कर रहे हैं: आनुवंशिक उत्परिवर्तन कि बदल विशिष्ट तंत्रिका सर्किट4, विशिष्ट ंयूरॉंस में neurotoxins की अभिव्यक्ति5,6, जैसे halorhodopsin7के रूप में optogenetic उपकरण का उपयोग करें, और लक्षित ंयूरॉंस की लेजर पृथक8,9। लेजर पृथक विशेष रूप से विशिष्ट ंयूरॉंस की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या में गतिविधि को नष्ट करने के लिए अनुकूल है । न्यूरॉन्स की हत्या द्वारा न्यूरॉन्स गतिविधि के अपरिवर्तनीय उन्मूलन व्यवहार परिणामों का आकलन करने की सुविधा.

एक दिलचस्प व्यवहार है कि zebrafish में लार्वा चरण में मनाया जा सकता है शिकार पर कब्जा (चित्रा 1ए) है । यह नेत्रहीन-निर्देशित, लक्ष्य निर्देशित व्यवहार दृश्य तीक्ष्णता10, visuomotor परिवर्तन11,12,13, दृश्य धारणा और मांयता के अध्ययन के लिए एक अनुकूल प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान करता है ऑब्जेक्ट्स14,15,16,17,18, और निर्णय लेने19। कैसे शिकार शिकारियों द्वारा मांयता प्राप्त है और कैसे शिकार का पता लगाने के लिए शिकार को पकड़ने के व्यवहार की ओर जाता है neuroethology20में एक केंद्रीय प्रश्न रहा है । इस पत्र में, हम pretecto की भूमिका पर ध्यान केंद्रित-हाइपोथैलेमस pretectum में एक नाभिक के अनुमानों द्वारा गठित सर्किट (नाभिक pretectalis superficialis पार्स magnocellularis, इसके बाद, बस pretectum के रूप में नोट) ILH । लेजर-pretectum के पृथक शिकार पर कब्जा गतिविधि को कम करने के लिए दिखाया गया था और ILH है कि दृश्य शिकार धारणा के साथ जुड़ा हुआ है में ंयूरॉन गतिविधि को समाप्त21। यहां, लेजर पृथक प्रदर्शन और इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग Ca2 + इमेजिंग और zebrafish लार्वा में व्यवहार रिकॉर्डिंग वर्णित हैं ।

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Protocol

1. एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर न्यूरॉन्स की एक उपआबादी का पृथक

नोट: यदि उपयोगकर्ता पृथक के बाद Ca इमेजिंग करने पर योजना बनाते हैं, तो UAShspzGCaMP6s लाइन21का उपयोग करें । यदि उपयोगकर्ता पृथक निंनलिखित व्यवहार रिकॉर्डिंग प्रदर्शन पर योजना, यूएएस का उपयोग करें: EGFP लाइन, EGFP के पृथक के रूप में सकारात्मक कोशिकाओं GCaMP6s-व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है ।

  1. एक Gal4 लाइन है कि विशिष्ट ंयूरॉंस लेबल का अध्ययन किया और यूएएस: EGFP या UAShspzGCaMP6s के सहवास की स्थापना से शुरू करते हैं । दोनों माता-पिता के लिए nacre पृष्ठभूमि का उपयोग करना सुनिश्चित करें ताकि nacre homozygotes प्राप्त की जा सके.
    नोट: Homozygotes nacre के शरीर की सतह (चित्रा 1बी) पर कोई melanophores होते हैं । वर्तमान अध्ययन में, एक Gal4 लाइन gSAIzGFFM119B (जो pretectum लेबल) और एक अंय Gal4 लाइन hspGFFDMC76A (जो लेबल ILH) का उपयोग कर रहे है21।
  2. संभोग सेटअप के अगले दिन पर, zebrafish अंडे इकट्ठा, और उंहें लार्वा मंच पर जो बिंदु ब्याज की न्यूरॉन्स फ्लोरोसेंट पत्रकारों को व्यक्त करेंगे बढ़ाने के लिए ।
  3. 2% कम पिघल बिंदु-agarose (चित्रा 1बी) में zebrafish लार्वा माउंट ।
    1. 2% agarose स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करके शुरू करें: १०० एमएल सिस्टम वॉटर में कम पिघलने वाली पॉइंट agarose पाउडर के 2 जी को भंग कर दीजिये (यानी, पानी को एक परिचालित पानी की व्यवस्था में वयस्क zebrafish बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाताहै)22 या E3 का पानी23, पानी लाकर एक माइक्रोवेव में उबलते बिंदु के लिए, और जोरदार मिश्रण ।
    2. माइक्रोवेव 2% कम पिघलने बिंदु agarose शेयर जब तक यह फोड़े । एक 6 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन पर agarose के 3.5-4.0 मिलीलीटर डालो । रुको जब तक agarose इतना ठंडा है कि यह छूने के लिए आगे बढ़ने से पहले गर्म है ।
    3. अगले, agarose में एक ही लार्वा (इस कदम पर anesthetized नहीं) जगह है । स्थिति और लार्वा के उन्मुखीकरण समायोजन रखें ताकि यह ईमानदार है, एक विदारक सुई (चित्रा 1सी) का उपयोग कर, जब तक agarose के लार्वा की उचित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए जम जाता है ।
      नोट: लार्वा चारों ओर तैरने के लिए जारी रहेगा जबकि agarose जम जाता है ।
    4. लार्वा तैनात होने के बाद, agarose को पूरी तरह से जमना के लिए 5 मिनट की अनुमति दें ।
    5. agarose पर tricaine समाधान (1x काम एकाग्रता में ०.४%) के 5 मिलीलीटर डालो ।
      नोट: लेजर पृथक के दौरान लार्वा द्वारा आंदोलनों से बचने के लिए, लार्वा को पृथक प्रक्रिया में anesthetized रखा जाना चाहिए ।
  4. एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोपी प्रणाली में ब्लीचिंग समारोह का उपयोग लार्वा Ablate ।
    1. एक दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत agarose-एम्बेडेड लार्वा प्लेस और माइक्रोस्कोपी प्रणाली शुरू करते हैं ।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू और लेजर पर बारी करने के लिए "लेजर" टैब पर "पर" बटन पर क्लिक करें (चित्रा 1डी). "स्थिति" लेजर के लिए "से व्यस्त" बदलने के लिए "मोड-अवरोधित" के लिए प्रतीक्षा करें ।
    3. "चैनल" टैब पर, लेजर की तरंग दैर्ध्य सेट पर ८८० एनएम (अधिकतम शक्ति: लगभग २,३०० मेगावाट) EGFP पृथक के लिए, या ८०० एनएम (अधिकतम शक्ति: लगभग २,६०० मेगावाट) GCaMP पृथक के लिए ।
    4. मैंयुअल रूप से लेंस रिवाल्वर चलती द्वारा 20X उद्देश्य लेंस का चयन करें । "पता लगाएँ" टैब पर क्लिक करें, ऑप्टिकल रास्ते बदलने के लिए "GFP" क्लिक करें, और सीधे आँख से प्रतिदीप्ति देखने.
    5. देखने के केंद्र में zebrafish लार्वा मस्तिष्क का पता लगाने; फिर दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी पर वापस जाने के लिए "अधिग्रहण" टैब पर क्लिक करें ।
    6. ' पृथक से पहले ' हालत का एक रिकॉर्ड के रूप में, तेजी से स्कैनिंग में 20X उद्देश्य लेंस के साथ एक z-स्टैक छवि ले लो-गति (गर्मी से बचने के लिए-क्षति) । बाद में पृथक प्रयोगों से पहले और बाद में लिया छवियों की तुलना (चित्रा 2ए). z-स्टैक को प्राप्त करने के लिए z-स्टैक विकल्प का चयन करें और टैब को विस्तृत करने के लिए "z-स्टैक" क्लिक करें । लार्वा मस्तिष्क के ventral अंत पर ध्यान केंद्रित करने के बाद कम सीमा सेट ("पहले सेट" बटन ") पर क्लिक करें, और ऊपरी सीमा सेट (" पिछले सेट "बटन पर ध्यान केंद्रित करने के बाद) मस्तिष्क की पृष्ठीय सबसे सतह । उसके बाद, z-स्टैक छवि प्राप्ति को चलाने के लिए "प्रारंभ प्रयोग" बटन क्लिक करें ।
    7. मैंयुअल रूप से लेंस रिवाल्वर चलती द्वारा 63X उद्देश्य लेंस का चयन करें ।
    8. "खोजें" टैब पर क्लिक करें महामारी-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी करने के लिए स्विच करने के लिए, कोशिकाओं को खोजने के लिए आंख से देखने के केंद्र में ablated हो, तो क्लिक करें "अधिग्रहण" टैब पर वापस जाने के लिए लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी.
  5. "अधिग्रहण मोड" टैब पर, २५६ x २५६ पर "फ़्रेम आकार" सेट करें । क्लिक करें "जियो" और ब्याज के ंयूरॉंस निरीक्षण ।
  6. पृष्ठीय सबसे ओर से शुरू, एक फोकल विमान में जो कोशिकाओं ablated होना करने के लिए ध्यान में हैं लगता है ।
  7. मार्क एक छोटे से एक तिहाई के बारे में परिपत्र क्षेत्र के व्यास में प्रत्येक ंयूरॉन पर ब्याज के एक क्षेत्र के रूप में सेल आकार (रॉय) "क्षेत्रों" समारोह का उपयोग कर ।
  8. १३.९३ s/256 x २५६ पिक्सेल (१३४.४२ µm x १३४.४२ µm) के लिए स्कैन गति सेट करें, जो लगभग २०० µs/पिक्सेल, या २०० µs/0.5 µm का एक लेज़र निवास समय के संगत होता है । इसके अलावा, सेट 4 पुनरावृत्ति (' चलना चक्र: 4 ') । वैकल्पिक रूप से, पुनरावृत्ति की संख्या का अनुकूलन और गति इतनी है कि पर्याप्त पृथक हासिल की है स्कैनिंग ।
  9. पृथक के लिए ' ब्लीचिंग ' समारोह प्रदर्शन, ' समय श्रृंखला (2 चक्र) ' के साथ संयोजन में छवि के लिए नमूना (पहले और बाद में पृथक) और ' क्षेत्रों ' (ROIs सेट करने के लिए) या उपयोग सॉफ्टवेयर में समकक्ष कार्य (चित्रा 1डी) ।
  10. पहली छवि (पृथक से पहले) और दूसरी छवि (पृथक के बाद) समय श्रृंखला चक्र में तुलना करके, सुनिश्चित करें कि ब्लीचिंग के बाद, लक्षित कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि स्तर (चित्रा 2बी) पर मनाया जाता है कि कम हो जाती है.
  11. यदि प्रतिदीप्ति अभी भी पृथक के बाद मौजूद है, पुनरावृत्तियों की संख्या बढ़ाएं ।
  12. अगले, फोकल विमान थोड़ा गहरा कदम (यानी, ventral पक्ष की ओर), और अगले फोकल विमान का चयन जहां संयुक्त राष्ट्र-ablated कोशिकाओं दिखाई देते हैं ।
  13. (चरण १.९) ऊपर वर्णित के रूप में ब्लीचिंग फ़ंक्शन निष्पादित करें । इन चरणों को दोहराएँ जब तक कि ब्याज की तंत्रिका संरचना में सभी कोशिकाओं ablated किया गया है.
  14. सभी फोकल तंत्रिका संरचनाओं को कवर विमानों के माध्यम से जाने के बाद ablated हो, समाप्त प्रतिदीप्ति के लिए कोशिकाओं की जांच करें । यदि कुछ कोशिकाओं को अभी भी अपर्याप्त पृथक के कारण फ्लोरोसेंट हो पाया जाता है, लेजर-उंहें फिर से विकीर्ण के रूप में ऊपर वर्णित है ।
  15. लार्वा लेजर विकिरण के बाद agarose से बरामद करने की जरूरत है, तो यह लार्वा नुकसान हो सकता है क्योंकि यह agarose से बाहर मजबूर करने की कोशिश नहीं करते । इसके बजाय, ध्यान से अपने शरीर की सतह के लिए सीधा लार्वा के आसपास agarose में छोटे कटौती करते हैं । फिर, लार्वा के लिए प्रतीक्षा करने के लिए अपने दम पर agarose से बाहर तैरने जब संवेदनाहारी पहनता है ।
  16. पृथक के लिए अगले लार्वा के लिए आगे बढ़ें या जांच के तहत व्यवहार में शामिल नहीं है कि न्यूरॉन्स की एक और आबादी का उपयोग कर नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन.
    नोट: यहां, एक नियंत्रण के रूप में, यूएएस में घ्राण बल्ब न्यूरॉन्स: EGFP; gSAIzGFFM119B लार्वा लेजर ablated के ऊपर वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे थे (चित्रा 2, सही) ।
  17. सीए इमेजिंग (खंड 2) या व्यवहार रिकॉर्डिंग (धारा 3) के लिए आगे बढ़ने से पहले वसूली के लिए कई घंटे या 1 दिन की अनुमति दें । इस वसूली समय के दौरान, लार्वा स्वास्थ्य की जांच (यानी, सामान्य सहज तैराकी, कोई स्पष्ट गर्मी-ablated क्षेत्र के आसपास नुकसान, आदि) और खराब स्वास्थ्य के किसी भी लक्षण दिखा लार्वा को हटा दें ।

2. कैल्शियम इमेजिंग शिकार रिकॉर्ड करने के लिए-Pretectum-ablated Zebrafish लार्वा में न्यूरॉन गतिविधि पैदा की

  1. एक रिकॉर्डिंग चैंबर तैयार करने के लिए, एक गिलास स्लाइड पर एक सुरक्षित सील संकरण चैंबर गैसकेट डाल, कांच पर चिपकने वाला पक्ष के साथ, और शीर्ष सील हटा दें ।
    नोट: यह एक छोटा सा रिकॉर्डिंग कक्ष है कि व्यास में 9 मिमी और गहराई में ०.८ mm (चित्रा 3ए) है बनाता है ।
  2. अगले, एक नायलॉन जाल (खोलने का आकार: ३२ µm) एक ५०-एमएल ट्यूब कि नीचे खुला काट दिया है पर जगह है । ट्यूब पर जाल संलग्न करने के लिए टोपी का उपयोग करें (चित्रा 3बी).
  3. तैयार करें paramecia (जो लार्वा के लिए दृश्य उत्तेजना के रूप में इस्तेमाल किया जाने वाला शिकार है) ।
    नोट: Paramecium संस्कृति (steps 2.3.1 and 2.3.2) को पहले से तैयार करें ।
    1. वाणिज्यिक स्रोतों या अकादमिक जैव संसाधन केन्द्रों से24 अग्रिम में paramecia बीज संस्कृति प्राप्त करें ।
    2. संस्कृति पानी में कई दिनों के लिए paramecium autoclaved चावल के भूसे और सूखी बियर की गोली से युक्त-खमीर22 (चित्रा 3सी) ।
    3. 2 छलनी क्रमिक के माध्यम से paramecium संस्कृति डालो (एक १५०-µm एपर्चर, एक ७५-µm एपर्चर के साथ एक दूसरे के बाद के साथ एक) से मलबे को हटाने के लिए संस्कृति ।
    4. एक नायलॉन जाल (13-µm एपर्चर) पर पिछले कदम से प्रवाह के माध्यम से paramecia लीजिए ।
    5. फिर से एक ग्लास चोंच में नायलॉन जाल पर paramecia प्रणाली पानी की एक निचोड़ बोतल (चित्रा 3डी) का उपयोग कर निलंबित ।
  4. प्रणाली पानी 2x में जाल (चित्रा 3बी) कुल्ला (चित्रा 3ई) ।
    नोट: इस कदम का उद्देश्य किसी भी संभव odorants और paramecium संस्कृति माध्यम में निहित tastants को दूर करने के लिए है, के रूप में वर्तमान अध्ययन के लक्ष्य के लिए नेत्रहीन संचालित न्यूरॉन गतिविधि का निरीक्षण है ।
  5. anesthetize के लिए tricaine समाधान में एक zebrafish लार्वा रखें ।
  6. 2% कम पिघलने बिंदु agarose में एक एकल लार्वा माउंट ।
    1. सबसे पहले, माइक्रोवेव 2% कम पिघलने बिंदु agarose और agarose के लिए 10x केंद्रित tricaine की मात्रा 1/10 जोड़ें ।
    2. रिकॉर्डिंग चैंबर पर tricaine युक्त agarose की एक बूंद प्लेस (चित्रा 3) ।
    3. agarose की पुष्टि करने के बाद भी गर्म नहीं है, anesthetized लार्वा (२.५ कदम से) agarose में जगह है, तुरंत किसी भी अतिरिक्त agarose को हटाने ताकि agarose की सतह थोड़ा उत्तल लग रहा है ।
    4. जल्दी से एक विदारक सुई (चित्रा 1सी) के साथ एक ईमानदार स्थिति में लार्वा ओरिएंट ।
      नोट: इन प्रक्रियाओं agarose जम से पहले कई सेकंड के भीतर पूरा किया जाना चाहिए ।
    5. लार्वा ठीक से स्थिति में होने पर, agarose को पूरी तरह से जमना के लिए 5 मिनट की अनुमति दें । फिर, agarose पर 1x tricaine समाधान की एक बूंद डालना ।
  7. zebrafish लार्वा के सिर के चारों ओर agarose निकालें और एक शल्य चाकू का उपयोग कर तैरने के लिए paramecium के लिए स्थान बनाएं । ऐसा करने के लिए, सबसे पहले, agarose (चित्रा 3एफ) में कुछ छोटे कटौती करते हैं । फिर, ध्यान से धीरे चैंबर पर प्रणाली पानी डालने से अतिरिक्त agarose हटा दें ।
    नोट: इस कदम पर, tricaine बाहर धोया जाएगा ।
  8. अगले, रिकॉर्डिंग चैंबर में एक paramecium डाल एक दृश्य उत्तेजना के रूप में सेवा करते हैं ।
    नोट: जब paramecium zebrafish लार्वा के सिर के पास तैरती है, तो यह एक ंयूरॉन प्रतिक्रिया (चित्रा 3जी) आह्वान करेंगे ।
  9. एक महामारी प्रतिदीप्ति एक वैज्ञानिक CMOS कैमरा (चित्रा 3एच) के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप के तहत रिकॉर्डिंग चैंबर प्लेस और एक 2.5 x उद्देश्य लेंस (चित्रा 3मैं) का चयन करें ।
  10. GCaMP प्रतिदीप्ति संकेतों के समय चूक रिकॉर्डिंग ले लीजिए ।
    1. सुसज्जित कैमरे के लिए छवि अधिग्रहण आवेदन शुरू करते हैं ।
    2. "अनुक्रम फलक" क्लिक करें और फलक पर "हार्ड डिस्क रिकॉर्ड" का चयन करे । स्कैन सेटिंग्स अनुभाग में, "फ़्रेम गणना" करने के लिए ९०० या किसी भी अन्य कुल फ़्रेम संख्या वांछित सेट करें ।
      नोट: यदि उपलब्ध है, एक मॉड्यूल के साथ समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (यहां, "हार्ड डिस्क रिकॉर्ड") है कि एक हार्ड ड्राइव पर डेटा की कुशल बचत सक्षम बनाता है ।
    3. "कैप्चर" फलक में, 30-ms (यानी, ३३.३ fps) पर एक्सपोज़र समय सेट करें, और 2 x 2 बिन्नी ।
    4. स्पर्श पैनल को नियंत्रित करने के लिए, एक फिल्टर GFP के लिए सेट का चयन, के रूप में GCaMP उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा GFP करने के लिए समान है ।
    5. कैमरा दृश्य में लार्वा का पता लगाने और फ़ोकस करने के लिए कैप्चर फलक पर "लाइव" क्लिक करें (आरेख 4A), और उसके बाद "लाइव रोकें" क्लिक करें और "प्रारंभ करें" बटन क्लिक करे । चलचित्र को. cxd या किसी अंय स्वरूप में सहेजें जो प्राप्ति शर्त के बारे में जानकारी रखता हो ।
  11. रिकॉर्डिंग के बाद, GCaMP6s फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण (सीए संकेतों) रॉय समय में एक मस्तिष्क संरचना पर सेट चूक के लिए मतलब पिक्सेल मूल्यों को प्राप्त करने से मुक्त सॉफ्टवेयर फिजी25का उपयोग कर फिल्म ।
    नोट: फिजी कई उपयोगी प्लग के साथ ImageJ का एक संस्करण है-में स्थापित है और जैव स्वरूपों प्लग-इन के साथ cxd प्रारूप छवि फ़ाइलों को पढ़ सकते हैं ।
  12. यदि लार्वा रिकॉर्डिंग के दौरान थोड़ा आगे बढ़ जाता है, तो TurboReg प्लग-इन को चलाकर26 फिजी में छवि पंजीकरण करें । मेनू से, ' प्लगइंस ', ' पंजीकरण ', और ' TurboReg ' का चयन करें ।
  13. विचार कैसे अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार डेटा का विश्लेषण करने के लिए । निंनलिखित एक उदाहरण है ।
    1. F/F0 (प्रत्येक समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता, शेष या किसी भी Ca क्षणिक होने से पहले प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभाजित) निम्नानुसार गणना:
    2. pretectum या रॉय प्रबंधक का उपयोग कर ILH पर ROIs सेट करें: मेनू में, "विश्लेषण," "उपकरण," "रॉय प्रबंधक", और "जोड़ें" ROIs (चित्रा 4) की सूची में चुनें ।
    3. रॉय प्रबंधक पैनल पर चयन करके ROIs (यानी, GCaMP6s के प्रतिदीप्ति तीव्रता) के लिए मतलब पिक्सेल मूल्यों की गणना: "अधिक," "बहु उपाय", और "ठीक है." परिणामों को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
    4. के रूप में संकेत शोर कर रहे हैं, औसत 11 समय के लिए संकेत अंक (चलती औसत) एक आवेदन है कि स्प्रेडशीट डेटा संभाल कर सकते है का उपयोग कर ।
    5. एफ विभाजित (समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता) F0 द्वारा (बेसल स्तर पर प्रतिदीप्ति गहनता) सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करने के लिए । डेटा विज़ुअलाइज़ेशन का एक उदाहरण के रूप में, pretectum और ILH में सामान्यीकृत GCaMP6s प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन रंग-कोडेड होते हैं और paramecium पथ (चित्रा 4बी-डी) पर मैप किए जाते हैं ।

3. लेजर पृथक के बाद व्यवहारिक परिणामों का मूल्यांकन

  1. एक व्यवहार रिकॉर्डिंग प्रणाली है कि एक वीडियो कैमरे से सुसज्जित stereoscope के होते है सेट करें । एक उपयुक्त छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, वाणिज्यिक या कस्टम (चित्रा 5ए) के साथ एक कैमरा का प्रयोग करें ।
  2. प्रकाश व्यवस्था की स्थिति का अनुकूलन ताकि paramecium छवि प्रसंस्करण द्वारा पता लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक स्पेसर (चित्रा 5बी) के साथ एक अंगूठी सफेद एलईडी प्रकाश का उपयोग करें ।
    नोट: से दूरी, और का कोण, एलईडी नमूना की उपस्थिति को प्रभावित करता है (यानी, उज्ज्वल पृष्ठभूमि में अंधेरे पृष्ठभूमि या अंधेरे में उज्ज्वल) और कर रहे हैं, इसलिए, सफल छवि प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण. स्पेसर (चित्रा 5सी) की सबसे अच्छी ऊंचाई का निर्धारण ।
  3. एक व्यवहार रिकॉर्डिंग चैंबर में (जो एक ग्लास स्लाइड से जुड़ा हुआ था) एक zebrafish लार्वा (खंड 1 में वर्णित लेजर-पृथक प्रयोग से बरामद) मूल शीर्ष सील हटाया (चित्रा 5डी) के साथ रखें ।
  4. एक micropipette का उपयोग कर संस्कृति (चरण -6) से ५० paramecia लीजिए और उन्हें रिकॉर्डिंग चैंबर में जगह.
  5. रिकॉर्डिंग चैंबर के शीर्ष पर एक कवर स्लिप रखें । चैंबर में हवा शुरू करने से बचने के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर के पानी की सतह पर रखने से पहले कवर पर्ची पर पानी की एक छोटी सी बूंद डाल दिया ।
    नोट: इस चरण में, paramecia के साथ कुछ पानी रिकॉर्डिंग चैंबर से ओवरफ्लो होगा । रिकॉर्डिंग कक्ष में paramecia की शेष संख्या लगभग 30-40 होगी ।
  6. (चित्रा 5डी) प्रकाश व्यवस्था में (एक लार्वा और parameciaयुक्त) रिकॉर्डिंग चैंबर रखें.
  7. 11 मिनट (६,६०० फ्रेम) के लिए 10 एफपीएस में समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करो ।
  8. वैकल्पिक प्रत्येक लार्वा कि व्यवहार के लिए परीक्षण किया गया था के लिए, लेजर के प्रतिदीप्ति-ablated क्षेत्रों का निरीक्षण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप लेजर की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए-पृथक (यानी, अनुपस्थिति, या की काफी कम संख्या, में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं लेजर-विकिरणित क्षेत्र) ।
    नोट: यहां तक कि विकिरण के बाद, कुछ फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को अभी भी Gal4 जीन अभिव्यक्ति की कोशिकाओं है कि27पृथक के बाद विभेदित में बाद में शुरुआत के कारण मनाया जा सकता ।
  9. लार्वा के व्यवहार को रिकॉर्ड करने के बाद, पृष्ठभूमि में एकरूपता की कमी के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, फिजी में एक औसत छवि द्वारा प्रत्येक फ्रेम के एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल विभाजन प्रदर्शन: क्लिक करें ' प्रक्रिया ', ' छवि कैलकुलेटर ', ' ऑपरेशन: डिवाइड ', ' ३२-bit (फ्लोट) परिणाम ', और ' ओके '. एक औसत छवि बनाने के लिए, ' इमेज ', ' स्टैक्स ', ' जेड-प्रोजेक्ट ', ' औसत तीव्रता ', और ' ओके ' (चित्रा 5ई, एफ) पर क्लिक करें ।
  10. ' विश्लेषण ', ' विश्लेषण कणों ', एक क्षेत्र रेंज है कि सभी parameciaकवर की स्थापना, ' शो: मास्क ' चेकबॉक्स, और क्लिक करके ' ठीक ' पर क्लिक करके चैंबर में छोड़ दिया paramecia की संख्या गिनती । ' शो: मास्क ' विकल्प एक निकाले paramecia छवि (चित्रा 5जी) प्रदान करेगा, प्रत्येक फ्रेम में कणों की संख्या (paramecia) की एक सूची के साथ ।
  11. समय के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर में छोड़ दिया paramecia की संख्या प्लाट. चूंकि paramecia की संख्या का अनुमान शोर मचाते हैं, इसलिए हम अनुशंसा करते है कि स्प्रेडशीट पर ६०० फ़्रेम (1 मिनट) की श्रेणी में प्रत्येक बिंदु पर एक चलायमान औसत प्रदर्शन किया जाए ।

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Representative Results

विशिष्ट ंयूरॉंस या तो EGFP या GCaMP6s, जिनकी अभिव्यक्ति Gal4 लाइनों में संचालित थे के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल थे । एक Gal4 लाइन gSAIzGFFM119B pretectal क्षेत्र (magnocellular सतही pretectal नाभिक), और घ्राण बल्ब न्यूरॉन्स की एक उपआबादी में एक नाभिक लेबल के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक और Gal4 लाइन, hspGFFDMC76A, ILH लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम लेजर-ablated pretectal न्यूरॉन्स द्विपक्षीय (चित्रा 2एक बाएँ पैनल) और भी ablated न्यूरॉन्स घ्राण बल्ब में द्विपक्षीय रूप से एक नियंत्रण के रूप में (चित्रा 2एक zebrafish लाइन Gal4 की gSAIzGFFM119B लार्वा मेंएक सही पैनल) है कि यूएएस: EGFP रिपोर्टर मछली के साथ साथी थे । परिणाम दिखाते है कि दो-फोटॉन लेज़र सन्निकट कक्षों या neurites अप्रभावित (आकृति 2B) को छोड़ते समय लक्षित कक्षों को ablate कर सकता है ।

pretectal न्यूरॉन्स ILH ipsilaterally की ओर अपने axons परियोजना. यहां, हम उनके कार्यात्मक सीए इमेजिंग का उपयोग कर कनेक्टिविटी की जांच की । इस क्षेत्र में न्यूरॉन गतिविधि एक सीए जांच GCaMP6s के साथ सीए संकेतों के रूप में देखा जा सकता है (चित्रा 4ए), जिसकी अभिव्यक्ति एक Gal4 लाइन gSAIzGFFM119B (चित्रा 4बी) या अन्य Gal4 लाइन hspGFFDMC76A द्वारा संचालित किया गया था (चित्रा 4 ग). रंग का ऐरोहेड (चित्रा 4) स्विमिंग दिशाओं और parameciumके पथ, साथ ही रंग कोडित सीए सिग्नल-निर्दिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र है, जो तैराकी paramecium की दृष्टि से पैदा हुए थे में परिवर्तन दिखा (चित्रा 4बी डी). दोनों pretectum (चित्रा 4बी) और ILH (चित्रा 4सी) शिकार के समीपस्थ उपस्थिति में ंयूरॉन गतिविधि दिखाया, सुझाव है कि दोनों ंयूरॉंस गतिविधियों नेत्रहीन संचालित कर रहे हैं ।

डबल Gal4 GCaMP6s लार्वा का उपयोग करके (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), हम ablated pretectal न्यूरॉन्स एकतरफा और आगे प्रदर्शन किया सीए इमेजिंग pretectum में और ILH लार्वा ablated में न्यूरॉन्स गतिविधि का पालन करने के लिए. छोड़ दिया pretectum कि लेजर ablated था कोई ंयूरॉंस गतिविधि के लिए अवशिष्ट दिखाया (चित्रा 4डी, ऊपर छोड़ दिया), सुझाव है कि लेजर-पृथक सफल रहा था । हालांकि, ipsilateral ILH नाटकीय रूप से कम दिखाया ंयूरॉंस गतिविधि (चित्रा 4नीचे छोड़ दिया), सुझाव है कि ILH के लिए प्रमुख इनपुट ipsilateral pretectum से आता है । इसके विपरीत, लेजर के दूसरी ओर ILH-ablated pretectum (चित्रा 4डी नीचे सही) ipsilateral pretectum (चित्रा 4डी, ऊपर सही) में न्यूरॉन गतिविधि के बराबर ंयूरॉंस गतिविधि दिखाया, जो पता चलता है कि सही ILH सही pretectum से आदानों प्राप्त कर रहा है ।

जो व्यवहार परख का एक प्रयोग में उपयोग करने के लिए चुनाव संभव भूमिका (ओं की जांच के तहत ंयूरॉंस की) पर निर्भर करता है । यहां, हम एक शिकार का एक उदाहरण दिखाने के एक pretectal नाभिक है कि एक शिकार के रूप में पहचान की थी पृथक के बाद परख पर कब्जा21। चित्रा 5ए-डीमें दिखाया प्रकाश व्यवस्था का उपयोग कर, रिकॉर्डिंग चैंबर में paramecium की संख्या छवि प्रसंस्करण (चित्रा 5ई-जी) द्वारा गिना जा सकता है. आंखों की स्वचालित निष्कर्षण, और आंख की स्थिति की गणना (यानी, आंखों के कोणों में परिवर्तन) भी संभव हो सकता है क्योंकि zebrafish लार्वा की आंखें इस प्रकाश व्यवस्था की स्थिति में पृष्ठभूमि की तुलना में गहरा दिखाई देती हैं (चित्रा 5एच ).

प्रयोग के परिणाम बताते है कि द्विपक्षीय-pretectum के पृथक शिकार पर कब्जा गतिविधि (अंजीर. 5I, पीटी), जबकि घ्राण बल्ब में न्यूरॉन्स के एक उपजनसंख्या के पृथक नहीं (चित्रा 5मैं, ओबी) समाप्त कर दिया । ये परिणाम, चित्रा 4में दिखाए गए प्रयोगों के साथ, सुझाव देते हैं कि pretecto-हाइपोथैलेमस सर्किट शिकार-कैप्चर व्यवहार में आवश्यक है ।

Figure 1
चित्र 1 . Zebrafish लार्वा । (क) पाँच दिन पुरानी (५ दिन पश्चात निषेचन (५-dpf)) zebrafish लार्वा और उसके शिकार, एक paramecium. (ख) 4-dpf nacre लार्वा 2% कम पिघलने बिंदु agarose में एंबेडेड । ध्यान दें कि रेटिना वर्णक उपकला बरकरार है, जबकि nacre तनाव शरीर पर काले pigments का अभाव है । स्केल बार: ०.५ mm. (C) agarose में zebrafish लार्वा को ओरिएंट करने के लिए प्रयुक्त विदारक सुई । स्केल बार: 1 सेमी. (D) दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी में प्रयुक्त सॉफ़्टवेयर का स्क्रीनशॉट, "ब्लीचिंग", "समय श्रृंखला", और "क्षेत्र" पैनल जो पृथक में उपयोग किए गए थे, दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर न्यूरॉन्स की एक उपजनसंख्या का पृथक. (क) EGFP फ्लोरोसेंट छवियों की 4-dpf zebrafish लार्वा से पहले और बाद में पृथक के न्यूरॉन्स. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर शीर्ष देखें और 3 डी की ओर देखें जेड-ढेर छवियों को खंगाला । z-स्टैक छवियाँ एक 20X उद्देश्य लेंस के साथ लिया गया था । ablated क्षेत्रों (या तो pretectum या घ्राण बल्ब) पीले रंग में घेरे हैं । स्केल बार: १०० µm. (ख) एक ही फोकल विमान "ब्लीचिंग" समारोह का उपयोग कर लेजर पृथक का उदाहरण । लेज़र-विकिरणित क्षेत्र (ROIs के रूप में सेट) प्रत्येक कक्ष पर रंगों में दिखाए जाते हैं. स्केल बार: 10 µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें. 

Figure 3
चित्र 3 . सीए इमेजिंग के लिए zebrafish लार्वा और paramecia तैयार करना । (A) रिकॉर्डिंग चैम्बर. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 9 मिमी व्यास x ०.८ मिमी गहराई संकरण पाल बांधने की रस्सी 8 मंडलों के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर के रूप में उपयोग किया गया था । गैसकेट एक गिलास स्लाइड पर रखा और पालन किया गया था । गैसकेट के ऊपर की सील बंद खुली थी । (ख) नायलॉन जाल (३२ µm) parameciaकुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया । जाल एक ५०-एमएल ट्यूब पर रखा गया था । (ग) चावल के भूसे और सूखी खमीर छर्रों से युक्त Paramecium संस्कृति । (घ) Paramecium स्टॉक समाधान सी में दिखाई गई संस्कृति से तैयार (ङ) Paramecium स्टॉक समाधान प्रणाली पानी से दो बार कुल्ला करने के लिए माध्यम में संभव घ्राण और gustatory cues को दूर किया गया । (च) Paramecium रिकॉर्डिंग कक्ष में एंबेडेड । agarose के एक हिस्से को हटाने के लिए, कई कटौती की गई । (छ) एक zebrafish लार्वा और एक parameciumके साथ रिकॉर्डिंग चैंबर । agarose के बहुमत के लिए paramecium को तैरने की अनुमति निकाली गई थी. zebrafish लार्वा का सिर सामने आ जाता है । (H) Ca इमेजिंग में प्रयुक्त ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप । माइक्रोस्कोप एक वैज्ञानिक CMOS कैमरे से सुसज्जित है । (I) Zebrafish पर उत्तेजना प्रकाश के साथ माइक्रोस्कोप के तहत रिकॉर्डिंग चैंबर में लार्वा । एक 2.5 x उद्देश्य लेंस के साथ, प्रबुद्ध क्षेत्र थोड़ा चैंबर के आकार से भी बड़ा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . प्रतिनिधि Ca इमेजिंग डेटा । (क) pretectum की स्थिति और hypothalamus (ILH) के अवर पालिक, पीले रंग में, एक दोहरे Gal4 hspGFFDMC76A में वृत्तित; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebrafish लार्वा आहेत. (B) pretectum Ca संकेत में परिवर्तन (द्विपक्षीय रूप से औसत), gSAIzGFFM119B में एक paramecium की गति पर रंग-मैप किया गया; UAShspzGCaMP6s लार्वा । स्केल बार: 1 मिमी. (ग) ILH Ca संकेत (द्विपक्षीय रूप से औसत रूप से) में परिवर्तन, hspGFFDMC76A में एक paramecium की गति पर रंग-मैप किया गया; UAShspzGCaMP6s लार्वा । स्केल पट्टी: 1 mm. (D) pretectum में परिवर्तन और ILH Ca संकेतों रंग-मैप की गई पथ पर एक hspGFFDMC76A में एक paramecium ; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s लार्वा जो दो-फोटॉन लेजर-पृथक बाईं pretectum के अधीन किया गया था । स्केल बार: 1 मिमी । इस छवि को पहले21प्रकाशित किए गए समान डेटा से पुनरुत्पादित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . लेजर में उलझकर कैद परख और प्रतिनिधि डाटा-ablated zebrafish लार्वा । (क) व्यवहार रिकॉर्डिंग प्रणाली. stereomicroscope एक CMOS कैमरे से सुसज्जित किया गया था । छवियां कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग करके अधिग्रहीत की गईं । (B) प्रकाश व्यवस्था के घटक । एक भूरे रंग का कागज, एक गिलास विसारक, सफेद एलईडी अंगूठी प्रकाश, विसारक, एक कस्टम-स्पेसर (गत्ता), और केंद्र में एक छेद के साथ विसारक बनाया । (ग) प्रकाश प्रणाली शिकार कब्जा परख के लिए बी (डी) रिकॉर्डिंग चैंबर में दिखाए गए भागों से इकट्ठे हुए. एक चैंबर (व्यास: 20 मिमी; गहराई: २.५ मिमी) एक गिलास स्लाइड पर रखा गया था । चैंबर के मूल शीर्ष सील बंद छील दिया गया था । एक ग्लास-कवर रिकॉर्डिंग चैंबर पर रखा गया था । (ई) रिकॉर्ड की गई फिल्म के एक फ्रेम से रॉ इमेज । (F) किसी चलचित्र में औसत छवि द्वारा विभाजित फ़्रेम (पिक्सेल-दर-पिक्सेल) । ध्यान दें कि प्रकाश व्यवस्था में गैर वर्दी पृष्ठभूमि इस छवि प्रसंस्करण द्वारा क्षतिपूर्ति किया जा सकता है । (छ) Paramecia फिजी में "कण विश्लेषण" समारोह का उपयोग कर एक फ्रेम से निकाले गए । (H) किसी लागू की गई थ्रेशोल्ड के साथ फिजी में छवि का उदाहरण । Paramecia उज्ज्वल दिखाई देते हैं, जबकि zebrafish लार्वा की आंखों में अंधेरा दिखाई देता है, और पृष्ठभूमि धूसर है । आंख की स्थिति में परिवर्तन (यानी, शरीर धुरी के संबंध में कोण) की गणना की जा सकती है, यदि आवश्यक हो । (I) एक घ्राण-बल्ब-ablated नियंत्रण लार्वा (ओबी) और एक pretectum-ablated लार्वा (PT) में paramecium उपभोग का प्रतिनिधि प्रायोगिक डेटा. Pretectum पृथक काफी कम शिकार शिकार की क्षमता है जबकि घ्राण बल्ब पृथक इसे प्रभावित नहीं किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि दो फोटॉन लेजर विशेष रूप से ablate व्यक्तिगत ंयूरॉंस के लिए एक उत्कृष्ट स्थानिक संकल्प किया है, महान सावधानी गर्मी के कारण मस्तिष्क ऊतक पर किसी भी अवांछित क्षति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । पृथक प्रयोग में सबसे महत्वपूर्ण कदम लेजर विकिरण के इष्टतम राशि का निर्धारण करने के लिए है । अपर्याप्त विकिरण ंयूरॉंस को मारने के लिए विफल रहता है । बहुत अधिक विकिरण गर्मी-आसपास के ऊतकों, जो अवांछित प्रभाव में परिणाम होगा नुकसान होगा । लेजर विकिरण की इष्टतम रेंज (ROIs के क्षेत्रों, पुनरावृत्तियों की संख्या, और गति स्कैनिंग) संकीर्ण प्रतीत होता है । कुछ कारकों पृथक की क्षमता को प्रभावित करते हैं ।

सबसे पहले, विभिंन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग करके, पृथक शर्तों प्रत्येक रिपोर्टर के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । GCaMP अभिव्यक्ति नाभिक के कोशिका द्रव्य विहीन में मनाया जाता है । इसके विपरीत, EGFP प्रतिदीप्ति कोशिका के अंदर भर में प्रकट होता है, जो लक्षित कोशिकाओं के कुशल और विशिष्ट पृथक के लिए लाभप्रद हो सकता है, GCaMP की तुलना में. GCaMP का उपयोग भी एक लेजर के रूप में वंचित है ablated GCaMP-व्यक्त सेल तत्काल बड़े पैमाने पर सीए आमद के कारण वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित कर सकते हैं, इसके विपरीत प्रतिदीप्ति तीव्रता जब EGFP पृथक के लिए इस्तेमाल किया गया था में कमी आई है । इस प्रकार प्रतिदीप्ति में परिवर्तन GCaMP के साथ पृथक की सीमा का विश्वसनीय संकेतक नहीं हो सकता । ऐसे मामलों में, यह एक विशिष्ट अवधि के बाद फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के नुकसान को देख कर पृथक मांय करने के लिए आवश्यक हो सकता है । ablated क्षेत्र में सीए संकेतों की अनुपस्थिति या महत्वपूर्ण कमी GCaMP के साथ सफल पृथक के लिए एक और कसौटी हो सकती है ।

दूसरा, राशि (अर्थात्, स्कैन गति, स्कैन की पुनरावृत्ति संख्या) सफल पृथक के लिए आवश्यक लेजर विकिरण के स्थान की गहराई के आधार पर भिंन हो सकते है मस्तिष्क की सतह से ंयूरॉंस । सतह के पास स्थित कोशिकाओं के साथ तुलना में, मस्तिष्क के अंदर गहरे स्थित उन अधिक लेजर विकिरण की आवश्यकता होती है, इस प्रकार, इसे और अधिक कठिन बनाने के लिए उन्हें ablate. लेजर विकिरण की मात्रा के लिए अनुकूलन विशेष रूप से न्यूरॉन्स के प्रत्येक लक्षित उपजनसंख्या के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.

तीसरा, यह empirically था कि एक छोटे से क्षेत्र में ROIs की एक संख्या की स्थापना अक्सर स्कैन में गर्मी-कोशिकाओं के आसपास के ऊतकों को क्षतिग्रस्त के रूप में अच्छी तरह से (लेजर-विकिरणित क्षेत्र में बुलबुले की उपस्थिति से ंयाय), जबकि एक अकेले सेल लक्ष्यीकरण, या विरल एक ही शर्त के तहत एक स्कैन में वितरित ROIs हानिकारक प्रभाव नहीं था । वर्तमान अध्ययन में, ब्लीचिंग केवल एक छोटे क्षेत्र (कोशिका शरीर के आकार के लगभग एक तिहाई) पर लक्षित कोशिकाओं के बाहर ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए लागू किया गया था । आमतौर पर, 5-10 कोशिकाओं को प्रत्येक फोकल विमान पर लक्षित (4-8 विमानों को पूरे pretectal क्षेत्र को कवर किया गया) ।

लेजर विकिरण की मात्रा को अनुकूलित करने के अलावा, नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा लेजर पृथक के व्यापक सत्यापन महत्वपूर्ण है । एक नियंत्रण प्रयोग में उन कक्षों की अन्य उपजनसंख्या का लेज़र पृथक शामिल हो सकता है, जिनका अध्ययन किए जाने वाले व्यवहार में शामिल होने की संभावना नहीं है. घ्राण बल्ब न्यूरॉन्स एक ही Gal4 लाइन में लेबल वर्तमान अध्ययन में नियंत्रण के रूप में कार्य किया (चित्रा 2एक, ठीक है, और चित्रा 5मैं). हालांकि, ऊपर वर्णित कारण के लिए, न्यूरॉन्स का कोई समूह एक आदर्श नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं. ंयूरॉंस की प्रत्येक उपजनसंख्या मस्तिष्क, कोशिका घनत्व, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर transgene अभिव्यक्ति स्तर, प्रसार दर, और रिपोर्टर transgene अभिव्यक्ति के समय में अपनी स्थिति के संबंध में दूसरों से अलग है । इन मतभेदों को नियंत्रण प्रयोगों में पृथक (' ब्लीचिंग ' समारोह) के लिए सटीक एक ही सेटिंग का उपयोग करने के लिए असंभव बना. इस प्रकार, नियंत्रण प्रयोगों के विभिंन प्रकार भी विचार किया जाना चाहिए, जैसे optokinetic प्रतिक्रिया की माप, दृश्य व्यवहार28, और गतिवान21 में बेसल गतिविधि पृथक के विशिष्ट प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए ।

हमारे अनुभव में, pretectal कोशिकाओं के दर्जनों के पृथक द्विपक्षीय, लगभग 1 ज लेता है (agarose में embedding से, एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, agarose के बाद पृथक से पुन प्राप्त करने के लिए) । एक दिन में 8 लार्वा (उदा., प्रायोगिक के लिए 4 लार्वा और नियंत्रण के लिए 4) ablated जा सकते हैं; इसलिए, प्रयोगों के एक जोड़े को यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता हो सकती है कि एक प्रायोगिक समूह के लिए पर्याप्त लार्वा (उदा., n = 12) और एक नियंत्रण समूह के लिए (उदा., n = 12) । इसके अतिरिक्त, लार्वा के लिए आधे दिन या एक दिन में पृथक से उबरने की अनुमति देना वांछनीय है (उदा., 4-dpf पर लेजर पृथक 5-dpf में एक व्यवहार रिकॉर्डिंग द्वारा पीछा किया जाता है, या सुबह सीए इमेजिंग के बाद दोपहर में पृथक) । इस वसूली समय के दौरान, किसी भी बीमार लग लार्वा अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए ।

प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल अध्ययन के उद्देश्य पर पूरी तरह से निर्भर करता है । वर्तमान अध्ययन दृश्य क्षेत्र में paramecium के स्थान और pretectum और ILH में न्यूरॉन गतिविधि के बीच संबंधों पर ध्यान केंद्रित किया । धीमी गति से क्षय को ध्यान में रखते हुए (GCaMP6s के ~ सेकंड)29संकेतों, केवल वृद्धि के समय, लेकिन नहीं कमी, GCaMP6s संकेतों के parameciumके स्थान के साथ संबद्ध । paramecium चले जाने पर भी सीए सिग्नल हाई हो सकते हैं । इसलिए, हम केवल डेटा प्रस्तुति में GCaMP6s की वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता शामिल हैं । इस प्रकार के विश्लेषण में प्रायः विशिष्ट प्रोग्रामिंग भाषाओं या मैक्रो भाषाओं के साथ लिखे गए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट की आवश्यकता होती है । इस पत्र में प्रयुक्त लिपियों अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।

निरोधी हालत (यानी, agarose-एंबेडेड) कुछ हद तक zebrafish लार्वा के लिए तनावपूर्ण हो सकता है; हालांकि, हम इस हालत में स्पष्ट तनाव प्रेरित ंयूरॉंस गतिविधि या व्यवहार का निरीक्षण नहीं किया, जब मुक्त तरण हालत21,22के साथ तुलना में । Agarose-एंबेडेड zebrafish लार्वा किसी स्पष्ट समस्या के बिना, (संभवत: अधिक) 24 घंटे से कम बच सकते हैं । Parameciumचालित सीए संकेतों में pretectum और विवश हालत में ILH मुक्त तैराकी लार्वा21में मनाया जाता है कि इसी तरह के थे । Zebrafish दृश्य व्यवहार circadian लय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है । इसलिए, हम जल्दी से देर शाम तक व्यवहार प्रयोगों का आयोजन किया । जंगली प्रकार और नियंत्रण लार्वा इस रिकॉर्डिंग समय के दौरान paramecia की एक महत्वपूर्ण संख्या का उपभोग किया ।

कार्यात्मक और व्यवहार परख यहां वर्णित सबसे अधिक उपलब्ध उपकरणों का उपयोग है कि कई प्रयोगशालाओं में पाया जा सकता है या आसानी से स्थापित किया जा सकता है, और इस प्रकार यह व्यवहार विज्ञान के विभिंन क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोगों होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट के लिए ब्याज का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इन अध्ययनों से MEXT, JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP25290009, JP25650120, JP17K07494, और JP17H05984 से प्राप्त अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NuSieve GTG Agarose Lonza Cat.#50080 low-melting temperature agarose
6 cm petri dish FALCON Product#:351007
dissecting needle AS ONE Corporation Cat. No. 2-013-01 https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP Carl Zeiss two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0 Carl Zeiss 63X objective lens
Imager.Z1 Carl Zeiss an epi-fluorescence microscope
ZEN Carl Zeiss Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 Used as a behavioral recording chamber
surgical knife MANI Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics model:C11440-22CU a scientific CMOS camera
HCImage Hamamatsu Photonics image acuisition software
Hard Disk Recording module Hamamatsu Photonics An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7 Olympus stereoscope
DF PL 0.5X Olympus objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio FLIR Systems, Inc. Product No. GS3-U3-41C6NIR-C CMOS camera
XIMEA xiQ camera XIMEA Product No. MQ042RG-CM CMOS camera
a ring LED light CCS Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Nylon mesh 32µm Tokyo Screen N-No.380T http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm Tokyo Screen N-No. 508T-K http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. dry beer yeast
LabVIEW National Instruments an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP Spectra Physics  two-photon laser 

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Zebrafish लार्वा में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक दो-फोटॉन लेज़र और उसके मूल्यांकन का उपयोग करके एक न्यूरॉन जनसंख्या का पृथक
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Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57485, doi:10.3791/57485 (2018).

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