Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

देशी की पीढ़ी, untagged Huntingtin Exon1 मोनोमर और तंतुओं एक सूमो संलयन रणनीति का उपयोग

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

यहां, हम देशी की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक मजबूत और अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्तमान, टैग मुक्त मोनोमर और तंतुओं के exon1 के Huntingtin प्रोटीन (Httex1) छोटे ubiquitin संबंधित संशोधक (सुमो) के क्षणिक संलयन पर आधारित है ।

Abstract

Huntington की बीमारी (एचडी) एक विरासत में मिली घातक neurodegenerative रोग है जो कि एचडी जीन के पहले एक्सॉन में सीएजी विस्तार (≥ ३६) के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप Huntingtin प्रोटीन (Htt) या एन-टर्मिनल अंशों की अभिव्यक्ति में विस्तारित polyglutamine ( polyQ) खिंचाव.

Huntingtin प्रोटीन (Httex1) का exon1 सबसे छोटा Htt अंश है जो सेलुलर और एनिमल मॉडल में एचडी की कई सुविधाओं को recapitulates है और Htt के सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किये गए अंशों में से एक है । Httex1 के छोटे आकार के लिए यह प्रयोगात्मक अधिक लंबे समय तक टुकड़े या पूर्ण लंबाई Htt की तुलना में मानक और उच्च संकल्प तकनीक का उपयोग कर भौतिक विशेषताओं के लिए उत्तरदायी बनाता है. हालांकि, वृद्धि हुई polyQ सामग्री के साथ उत्परिवर्ती Httex1 (mHttex1) के उच्च एकत्रीकरण प्रवृत्ति (≥ ४२) यह मुश्किल कुशल अभिव्यक्ति और शोधन प्रणालियों के विकास के लिए पर्याप्त मात्रा में इन प्रोटीन का उत्पादन और उंहें सुलभ बनाने के लिए बना दिया है फ्यूजन प्रोटीन या अन्य रणनीतियों है कि प्रोटीन के देशी अनुक्रम में परिवर्तन के उपयोग के बिना विभिन्न विषयों से वैज्ञानिकों. हम यहां मौजूद मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक मजबूत और अनुकूलित विधि देशी, टैग मुक्त Httex1 छोटे ubiquitin संबंधित संशोधक (सुमो) के परिवर्तनीय संलयन पर आधारित है । सादगी और रणनीति की दक्षता Httex1 के गैर-देशी दृश्यों का उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म करने, इस प्रकार इस प्रोटीन और शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने और विभिन्न प्रयोगशालाओं में प्रयोगों के reproducibility में सुधार होगा. हमें विश्वास है कि इन अग्रिमों भी Htt के संरचना समारोह संबंध elucidating के साथ ही उपंयास नैदानिक उपकरणों और उपचार या HD की प्रगति धीमी गति से विकसित करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी ।

Introduction

Htt एक ३४८ केडीए प्रोटीन है और कई शारीरिक कार्यों में फंसाया गया है1. जब Htt अपने N-टर्मिनस में ३६ से अधिक अवशेषों का एक विस्तारित polyQ क्षेत्र होता है, यह HD2,3का कारण बनता है । HD विकृति striatum और प्रांतस्था में सेलुलर शामिल किए जाने की विशेषता है, जो न्यूरॉन्स की मौत और प्रभावित ऊतकों के शोष की ओर जाता है4,5. कई एन टर्मिनल Htt टुकड़े कि polyQ दोहराने पथ होते है HD रोगियों से पोस्ट-मार्टम दिमाग में पता लगाया गया है और huntingtin प्रोटीन6के proteolytic प्रोसेसिंग द्वारा उत्पंन किया जा करने के लिए लगा रहे हैं । हाल के अध्ययनों से सुझाव है कि Httex1 भी ंयायपालिका mRNA ब्याह के कारण गठन किया जा सकता है । Httex1 रोग polyQ उत्परिवर्तन और पशुओं में अपनी व्यक्ती शामिल एचडी7की प्रमुख विशेषताओं के कई दोहराऊंगा कर सकते हैं, इस प्रकार एचडी पैथोलॉजी और रोग प्रगति 6 में इस टुकड़े की एक संभावित केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला, 8,9.

विस्तारित polyQ पथ के साथ उत्परिवर्ती Httex1 (mHttex1) के उच्च एकत्रीकरण प्रवृत्ति के कारण, मौजूदा अभिव्यक्ति प्रणालियों के बहुमत प्रोटीन के लिए Httex1 के क्षणिक संलयन पर आधारित हैं (जैसे glutathione-S-ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी), thioredoxin (TRX) या माल्टोज़-binding-प्रोटीन (MBP) और/या पेप्टाइड्स (पाली-histidine) जो अपनी अभिव्यक्ति में सुधार, स्थिरता, शुद्धि और/या घुलनशीलता10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28। फ्यूजन साथी ऐसे trypsin, tabacco खोदना वायरस (टेव) के रूप में छेड़ने के लिए एक दरार साइट युक्त एक छोटी अनुक्रम के साथ Httex1 करने के लिए जुड़ा हुआ है या PreScission के दरार और Httex1 की रिहाई के लिए अनुमति देने के लिए एकत्रीकरण की दीक्षा से पहले या शोधन. इन तरीकों की कमियों के कारण अतिरिक्त अवशेषों छोड़ने की संभावना गैर-स्ट्रेस्ड दरार और Httex1 के अनुक्रम के भीतर दरार के कारण कटा हुआ टुकड़े के निर्माण, अपूर्ण दरार के कारण विविधता के अलावा ( देखें Vieweg एट अल. अधिक के लिए लाभ और इस दृष्टिकोण की सीमाओं पर गहन चर्चा के लिए)10। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने हाल ही में एक अभिव्यक्ति रणनीति Synechocystis सपा के एक क्षणिक एन टर्मिनल संलयन का उपयोग करके पहली बार के लिए टैग मुक्त देशी Httex1 की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए विकसित की है । (Ssp) DnaB intein को Httex110. जबकि intein दरार पता लगाया है और विशिष्ट और पैदावार प्रोटीन की मात्रा मिलीग्राम, यह अभी भी दो कमियां है कि उपज को कम कर सकता है: अर्थात्, intein जो अभिव्यक्ति के दौरान हो सकता है की समय से पहले दरार, और तथ्य यह है कि दरार पर होता है कई घंटे, जो एकत्रीकरण के कारण प्रोटीन के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विशेष रूप से विस्तारित polyQ दोहराने के साथ Httex1 के लिए ।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए और देशी, टैग मुक्त Httex1 के उत्पादन के लिए हमारी रणनीति को परिष्कृत करने के लिए, हम सूमो के क्षणिक संलयन पर आधारित एक नई अभिव्यक्ति प्रणाली विकसित की है, और वास्तव में खमीर homolog Smt3 Httex1 करने के लिए । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए सूमो प्रणाली के आवेदन पहले २००४29में प्रकाशित किया गया था, जहां अभिव्यक्ति और सूमो फ्यूजन प्रोटीन के घुलनशीलता की वृद्धि की दर का प्रदर्शन किया गया । सूमो टैग प्रोटीन की तरह ubiquitin से सट किया जा सकता है विशिष्ट 1 (ULP1), जो एक मांयता साइट की आवश्यकता नहीं है, लेकिन सूमो के तृतीयक संरचना पहचानता है और व्यावहारिक रूप से30दरार की संभावना समाप्त । इसके अलावा, ULP1-मध्यस्थता दरार तेजी से और पता लगाया है और पीछे अतिरिक्त अवशेषों को छोड़ नहीं करता है । फ्यूजन टैग के समय से पहले दरार, के रूप में उत्प्रेरक intein10के साथ मनाया, पूरी तरह से एक बाहरी छेड़ने की आवश्यकता से बचा है । जबकि सूमो रणनीति आजकल व्यापक रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन31,३२,३३के लिए प्रयोग किया जाता है, हम इस पत्र में प्रदर्शित करता है कि यह एक आंतरिक रूप से परिक्रमा की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, एकत्रीकरण-प्रवण, amyloidogenic प्रोटीन जैसे Httex1. हमें विश्वास है कि सादगी, दक्षता और हमारे सूमो-फ्यूजन आधारित विधि की मजबूती देशी, टैग मुक्त Httex1 और अधिक विभिंन विषयों से शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के लिए और इन विट्रो में Httex1 के गैर देशी दृश्यों का उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म कर देगा . यह एक महत्वपूर्ण अग्रिम है कि भविष्य के अध्ययन की सुविधा के लिए संरचना-Httex1 के समारोह के संबंध स्पष्ट होगा ।

प्रोटोकॉल बैक्टीरियल संस्कृति के 12 एल से Httex1 की शुद्धि का वर्णन है, लेकिन प्रोटोकॉल आसानी से छोटे या बड़े पैमाने पर प्रस्तुतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल (Httex1) रोगजनक दहलीज (mHttex1) के ऊपर एक polyQ दोहराने की लंबाई (23Q) और उत्परिवर्ती 43Q (36Q) के नीचे एक polyQ दोहराने की लंबाई के साथ जंगली प्रकार Httex1 (wtHttex1) के उत्पादन का वर्णन करता है ।

Protocol

1. रिकॉमबिनेंट Httex1 23Q और 43Q की अभिव्यक्ति

  1. आवश्यक बफ़र्स और समाधान तैयार करें । 1000x एम्पीसिलीन (AMP, १०० मिलीग्राम/एमएल) स्टॉक समाधान, फ़िल्टर (०.२ µm), aliquot और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार करें । lysogeny शोरबा (lb) मध्यम (25 g LB मिलर प्रति 1 L H2O), आटोक्लेव तैयार करें । 1 M Isopropyl ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) स्टॉक समाधान, फ़िल्टर (०.२ µm), aliquot और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें ।
  2. एक pTWIN1 वेक्टर के साथ रासायनिक सक्षम ई. कोलाई बी एर २५६६ रूपांतरण, मानव Httex1 युक्त एक N-टर्मिनल His6-गर्मी सदमे विधि३४के साथ सूमो टैग से जुड़े ।
    नोट: ई. कोलाई BL21 DE3 तनाव भी इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इस मामले में एक बढ़ी हुई मात्रा में जनचेतना मनाया गया ।
  3. Inoculate २०० मिलीलीटर की एमएल-मध्यम के साथ एक 1 एल शंकु कुप्पी में 1x AMP के साथ एक बाँझ पिपेट टिप के साथ आगर प्लेट से एक ही कॉलोनी जोड़कर । 30 डिग्री सेल्सियस और एक बैक्टीरियल मशीन में 20 घंटे (रात) के लिए १८० rpm पर संस्कृति की मशीन ।
  4. एक बाँझ पिपेट के साथ संस्कृति का एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो । एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक cuvette और एक फोटोमीटर के साथ नमूना के ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने (०.१ और 1 के बीच माप रेंज का सम्मान, यदि आवश्यक हो तो पौंड-मध्यम के साथ पतला) । एक 3 एल संस्कृति में ०.०५ की एक प्रारंभिक आयुध डिपो६०० में परिणाम होगा कि संस्कृति की मात्रा की गणना (आयुध डिपो६०० की एक संस्कृति के साथ = 3 कि ५० मिलीलीटर मतलब होगा) ।
  5. Inoculate चार संस्कृतियों (पौंड के प्रत्येक 3 एल-एक 5 एल कुप्पी में 1x AMP के साथ मध्यम), एक बाँझ पिपेट के साथ संस्कृति की गणना की राशि जोड़कर । एक बैक्टीरियल मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और १८० rpm पर संस्कृतियों की मशीन ।
  6. हर 30 मिनट, एक बाँझ पिपेट के साथ संस्कृति का एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो । एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक cuvette और एक फोटोमीटर के साथ नमूने के आयुध डिपो६०० को मापने । जब६०० आयुध डिपो ०.१ तक पहुंच गया है (आम तौर पर 1-2 एच के बाद), 14 डिग्री सेल्सियस के लिए बैक्टीरियल मशीन का तापमान सेट और ठंडा जबकि मशीन जारी है । हर 30 मिनट, एक बाँझ पिपेट के साथ संस्कृति का एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो । एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक cuvette और एक फोटोमीटर के साथ नमूने के आयुध डिपो६०० को मापने ।
    नोट: समय संस्कृतियों ठंडा करने के लिए इस्तेमाल किया मशीन के साथ भिंन हो सकते हैं, तो समय ठंडा शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया मशीन के प्रकार के आधार पर अनुकूलित हो सकता है । हालांकि, तापमान ढाल बदलने केवल उपज पर एक छोटे से प्रभाव के रूप में सूमो फ्यूजन प्रोटीन के लिए काफी स्थिर प्रतीत होता है चाहिए ।
  7. जब आयुध डिपो६०० 0.3-0.4 तक पहुंच गया है (आमतौर पर 1-2 घंटे के बाद), एसडीएस के लिए संस्कृति के एक पूर्व प्रेरण नमूना ले-व्यक्त की पृष्ठ विश्लेषण । नमूना आकार है कि कोशिकाओं की तुलनीय राशि और Coomassie सना हुआ एसडीएस-पृष्ठ पर एक अच्छा संकेत देता है की गणना: एक 10 अच्छी तरह से जेल के लिए: मात्रा= ०.२ एमएल/ एक 15 अच्छी तरह से जेल के लिए आधा ले लो ।
    1. एक बैक्टीरियल संस्कृति के लिए एक आयुध डिपो के साथ६००= ०.४, ले ५०० µ एल एक बाँझ पिपेट के साथ बैक्टीरियल संस्कृति की गणना की मात्रा ले लो. नमूना नीचे स्पिन (१८००० एक्स जी, 4 ° c, 2 मिनट) और supernatant त्यागें । पर गोली रखें-20 ° c विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए तैयार जब तक (चरण १.११) ।
  8. प्रत्येक 3 एल संस्कृति समाधान (अंतिम एकाग्रता ०.४ मिमी) के लिए एक 1 मीटर IPTG स्टॉक समाधान के pipetting १.२ मिलीलीटर द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित । 16 घंटे के लिए 14 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति की मशीन जारी रखें (रात) ।
    नोट: तापमान आम तौर पर पहुंच जाएगा ~ 20 ° c समय IPTG द्वारा जोड़ा जाता है, मशीन के प्रदर्शन पर निर्भर करता है ।
  9. एसडीएस के लिए संस्कृति के एक के बाद प्रेरण नमूना ले-व्यक्त की पृष्ठ विश्लेषण, चरण १.७ में वर्णित प्रक्रिया का पालन ।
  10. फसल 1 एल ट्यूबों में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं (३९९३ x g, 4 ° c, 10 मिनट) । supernatant को त्यागें, बर्फ पर सेल गोली रखें और शुद्धि के लिए सीधे आगे बढ़ें ।
  11. एसडीएस द्वारा प्रतिव्यक्ती विश्लेषण-पृष्ठ३५,३६। पूर्व और पोस्ट के 20 µ एल में प्रेरण नमूने चल बफर और 20 2x लोडिंग डाई के µ एल के reसस्पेंड । एक गर्मी ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूनों गर्मी और एक 15% जेल पर 20 µ एल लोड जबकि अभी भी गर्म । ९० मिनट के लिए जेल में चलाने के लिए १८० V. दाग Coomassie डाई के साथ जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार । चित्र 1Cमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, सेल गोली जमे हुए और कई हफ्तों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । इष्टतम परिणामों के लिए, यह ताजा जीवाणु गोली का उपयोग करें और ठंड से बचने के लिए सिफारिश की है । फ्रीज-गल lysis कोशिकाओं और Httex1 के क्षरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह उपज और प्रोटीन की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं ।

2. सेल Lysis और उसकी शुद्धि6-सूमो Httex1 फ्यूजन प्रोटीन द्वारा मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC)

  1. एक गिलास बोतल में एक बफर के 2 एल तैयार (५० mm Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), ५०० मिमी NaCl, 15 मिमी imidazole) । एक गिलास बोतल में बफर बी (५० मिमी Tris, ५०० मिमी NaCl, ५०० मिमी imidazole पीएच ७.४) के 1 एल तैयार करें । लवण भंग करने के बाद, 10 एन एचसीएल के साथ पीएच समायोजित करें और एक बोतल शीर्ष फिल्टर (०.६५ µm) के साथ ताजा बोतलों में समाधान फिल्टर । एक 1000x phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF, ०.३ मीटर) स्टॉक समाधान, aliquot करने के लिए १०० µ एल और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल से सभी चरणों को पूरा करने के लिए सक्षम बनाया गया है lysis जीवाणु छर्रों औंधा करने के लिए चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (RP-HPLC) शुद्धि और lyophilization के भीतर 8-9 ज. समुच्चय और प्रोटियोलिसिस को सीमित करने के लिए, इसे बिना रुके और 4 ° c या बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करने के लिए तेजी से काम करने की सिफारिश की है ।
  2. PMSF स्टॉक समाधान और पांच गोलियां के १०० µ एल जोड़ें (अंतिम मात्रा के 30 मिलीलीटर प्रति 1)-पूर्व ठंडा बफर ए के १०० मिलीलीटर को छेड़ने अवरोधक । बफर के लिए बैक्टीरियल गोली जोड़ें और एक चुंबकीय हलचल बार के साथ सरगर्मी से और ऊपर और नीचे wi pipetting द्वारा निलंबन homogenize गु a बाँझो 10 मिलि पिपेट (~ 30 min).
  3. बैक्टीरिया सस्पेंशन को aliquots में ४० एमएल के ५० एमएल डिस्पोजेबल प्लास्टिक ट्यूब में बांट लें । Sonicate प्रत्येक aliquot में एक पानी/बर्फ बैच के लिए सेल lysis (७०% आयाम, कुल sonication समय 5 मिनट, 30 एस sonication के अंतराल, 30 एस ठहराव) ।
    नोट: यह नमूना sonication चरण के दौरान गर्मी नहीं है कि महत्वपूर्ण है । यह बर्फ स्नान करने के लिए कुछ पानी जोड़ने के लिए sonication के दौरान गर्मी अपव्यय में सुधार की सिफारिश की है । sonication प्रक्रिया एक अलग साधन का उपयोग किया जाता है, तो अनुकूलित करने के लिए हो सकता है । एक फ्रेंच प्रेस या एक microfluidizer की तरह अंय lysis तरीकों के रूप में अच्छी तरह से काम करना चाहिए और नमूना और प्रोटीन एकत्रीकरण के हीटिंग से बचने के लिए फायदेमंद हो सकता है । इन उपकरणों हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं थे और हम हमारे sonication प्रोटोकॉल के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त किया ।
  4. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) विश्लेषण के लिए lysate के ५० µ एल का एक नमूना लें । नमूना (१८००० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट) और एक नया परीक्षण ट्यूब में घुलनशील अंश पिपेट । एक पिपेट के साथ बफर एक के ५० µ एल में अघुलनशील अंश reसस्पेंड । एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण (चरण २.६) तक बर्फ पर नमूने रखें ।
  5. (३९१९१ एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस, ६० मिनट) द्वारा lysate स्पष्ट ।
  6. केंद्रापसारक कदम के दौरान, एसडीएस द्वारा सेल lysis कदम का विश्लेषण-पृष्ठ । क्रमशः lysate के घुलनशील और अघुलनशील अंश को 2x लोडिंग डाई के ५० µ एल जोड़ें । ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए हीट और एक 15% जेल पर 2 µ एल लोड जबकि अभी भी गर्म । ९० मिनट के लिए जेल में चलाने के लिए १८० V. दाग Coomassie डाई के साथ जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार । चित्र 1Cमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
  7. supernatant (०.४५ µm, सिरिंज फ़िल्टर) को फ़िल्टर करें. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए फ़िल्टर किए गए supernatant के 20 µ l का नमूना लें (चरण २.११).
    नोट: सामान्यतया, स्पष्ट और फ़िल्टर किए गए supernatant के ९० से १०० मिलीलीटर की मात्रा प्राप्त की है । आमतौर पर, 3 सिरिंज फिल्टर पर्याप्त हैं । निस्पंदन बोझिल है, तो गति को बढ़ाने के लिए प्रयास करें और/
  8. 4 डिग्री सेल्सियस३७पर एक तेजी से प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली पर मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा स्पष्ट बैक्टीरियल lysate से His6-सूमो Httex1 फ्यूजन प्रोटीन को अलग ।
    1. एक superloop और Ni-ंत् स्तंभ पर लोड में स्पष्ट lysate भरें (छीन लिया, साफ और रीलोडेड निर्माता के मैनुअल के अनुसार, एक पिछले खाली चलाने की सिफारिश की है) पर 2 मिलीलीटर/दर्रा 10 कॉलम खंड (CV, २०० एमएल) बफर एक पर 10 मिलीलीटर/ असीम प्रोटीन बाहर ।
    2. Elute के साथ फ्यूजन प्रोटीन २.५ CV (५० एमएल) के १००% के बफर बी में 2 मिलीलीटर/लोड हो रहा है और कपड़े धोने और रेफरेंस के लिए 5 मिलीलीटर के लिए ५० मिलीलीटर के एक अंश आकार का उपयोग करें । चित्र 1Dमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
  9. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (20 µ एल) और पूल IMAC वर्णलेख के शिखर के अनुसार फ्यूजन प्रोटीन युक्त अंशों के लिए प्रत्येक अंश का एक नमूना ले लो । जोड़ें (2S, 3S)-1, 4-बीआईएस (sulfanyl) ब्यूटेन-2, 3-दिओल (डीटीटी) और एल cysteine (अंतिम एकाग्रता १०० मिमी प्रत्येक) एक पाउडर के रूप में और धीरे ट्यूब पलटने से भंग.
    नोट: हमारे अनुभव में विभिन्न अंशों में फ्यूजन प्रोटीन की शुद्धता तुलनीय है. एक एहतियात के रूप में, शुद्ध फ्यूजन प्रोटीन के अंशों के बाद जल्दी से जमा किया जाना चाहिए IMAC अत्यधिक केंद्रित भागों के एकत्रीकरण को रोकने के लिए । इसके अलावा, यह सूमो टैग और HPLC शुद्धि की दरार करने के लिए सीधे आगे बढ़ने की सिफारिश की है । यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । फ्यूजन प्रोटीन के पतला समाधान तरल नाइट्रोजन में जम गया था, पर संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस और उपज में एक महत्वपूर्ण कमी के बिना गल के बाद शुद्ध । 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्यूजन प्रोटीन के पतला समाधान का भंडारण भी इसी तरह के परिणाम देता है ।
  10. एसडीएस द्वारा IMAC का विश्लेषण-पृष्ठ । प्रत्येक नमूने के लिए लोड हो रहा डाई के 20 µ एल जोड़ें । लोड 2 µ l कच्चे माल की (२.७), असीम अंश, वाश अंश और रेफरेंस पीक के प्रत्येक अंश को 15% जेल पर । ९० मिनट के लिए जेल में चलाने के लिए १८० V. दाग Coomassie डाई के साथ जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार । चित्र 1Dमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।

3. अपने6-सूमो-टैग और HPLC शुद्धि का क्लीवेज

चेतावनी: Trifluoroacetic एसिड (TFA) एक अस्थिर तरल है और गंभीर जलता है इसलिए देखभाल के साथ संभाल कर सकते हैं । एक धुएं डाकू में सभी हैंडलिंग बाहर ले और पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी, डिस्पोजेबल nitrile दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट) पहनते हैं ।

  1. एक 5 एल बोतल में, एक प्लास्टिक सिरिंज के साथ TFA के 5 एल पानी (विलायक एक: एच2ओ, ०.१% (TFA) के 5 मिलीलीटर जोड़ें । acetonitrile (विलायक बी: acetonitrile, ०.१% TFA) की एक २.५ एल बोतल के लिए एक प्लास्टिक सिरिंज के साथ TFA के २.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. निर्माता द्वारा सुझाए गए अनुसार HPLC प्रणाली तैयार करें । क्लीन स्तंभ सुनिश्चित करने के लिए एक रिक्त रन निष्पादित करें ।
  3. UPLC (चरण ३.५) द्वारा दरार प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए ULP1 के अलावा से पहले फ्यूजन प्रोटीन के १०० µ एल का एक नमूना ले लो ।
  4. एक नया ५० एमएल ट्यूब करने के लिए फ्यूजन प्रोटीन के 20 मिलीलीटर स्थानांतरण और ULP1 स्टॉक समाधान के ०.४ मिलीलीटर जोड़ें, बर्फ पर मशीन । बचे हुए फ्यूजन प्रोटीन को बर्फ पर रखें ।
    नोट: अपने-टैग उत्प्रेरक टुकड़ा 403-621 की तरह Ubiquitin-विशिष्ट 1 (यहां के रूप में संदर्भित करने के लिए "ULP1") के लिए सुमो टैग सट इस्तेमाल किया गया था । फ्यूजन प्रोटीन से सट Httex1 ज्यादा स्थिर होता है । इसमें पूरे बैच के सूमो टैग को न सट जाने की सिफारिश की गई है । इसके बजाय, जो सीधे और पूरी तरह से HPLC स्तंभ के लिए लागू किया जा सकता एक आकार के aliquots के साथ जारी रखें ।
  5. हर 10 मिनट में, अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) द्वारा प्रगति की निगरानी करने के लिए दरार प्रतिक्रिया के १०० µ एल का एक नमूना ले. नमूनों के केंद्रापसारक (१८००० rpm, 4 ° c, 2 min) और UPLC द्वारा supernatant के 2 µ l का विश्लेषण करें (ग्रैडिएंट 10% से ९०% विलायक बी एक के लिए ०.२५ में 3 मिनट के लिए, 10% B 1 मिनट के लिए, साधन के उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें) । ULP1 के अलावा नमूने के लिए प्राप्त chromatograms की तुलना करें और बाद में लिया गया नमूनों । चित्र 2Bमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
  6. एक बार सूमो-दरार पूरा हो गया है (फ्यूजन प्रोटीन के शिखर UPLC वर्णलेख में गायब हो गया है और पूरी तरह से नए दिखने सूमो और Httex1 पीक करने के लिए परिवर्तित), एक सिरिंज फिल्टर (०.२२ µm) के साथ नमूना फिल्टर.
    नोट: सूमो दरार आम तौर पर बहुत तेजी से है (4 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट) इसलिए UPLC विश्लेषण 4 मिनट के एक रन समय के साथ प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । HPLC शुद्धि से पहले नमूना फ़िल्टरिंग मुख्य रूप से स्तंभ के जीवनकाल को बढ़ाने के लिए एक निवारक उपाय है. नमूना पंकिल बंद नहीं करना चाहिए ।
  7. आरपी द्वारा फ़िल्टर नमूना शुद्ध-HPLC (विलायक में 25-35% विलायक बी के ढाल, पर ४० मिनट में 15 मिलीलीटर/min. (0-10 मिनट: 5%; 10-12.5 मिनट: 5 से 25%; 12.5-52.5 मिनट: 25 से ३५%; 52.5-57.5 मिन ३५ से ९५%; साधन उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें) । चित्र 2Cमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
    नोट: Httex1 और उसके6-सूमो आरपी-HPLC द्वारा अच्छी तरह से अलग । हालांकि, शुरुआत और चोटी के अंत में छोटा Httex1 की छोटी मात्रा में हो सकता है । शुद्ध सामग्री की अधिकतम मात्रा प्राप्त करने के लिए छोटे अंशों को एकत्र करें ।
    चेतावनी: क्रायोजेनिक तरल पदार्थ हैंडलिंग जब उपयुक्त सुरक्षा उपकरण (यानी, लैब कोट, अछूता दस्ताने और एक चेहरा ढाल) का उपयोग करें ।
  8. इलेक्ट्रो-स्प्रे ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा HPLC-भिन्न विश्लेषण (ईएसआई-MS, नमूना, सुई 10 µ एल, प्रवाह ०.६ मिलीलीटर/मिनट, विलायक: 20% A में B, कोई स्तंभ, उपकरण उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें) और UPLC (ढाल से 10% करने के लिए ९०% विलायक बी में एक के लिए ०.२५ 3 मिनट, 10% B 1 मिनट के लिए, साधन के उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें) । ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में समान शुद्धता के पूल अंशों, तरल नाइट्रोजन और lyophilize में फ्रीज । वजन और 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में lyophilized प्रोटीन हस्तांतरण और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  9. UPLC, ईएसआई-एमएस और एसडीएस-पृष्ठ द्वारा शुद्ध सामग्री की विशेषता । भंग १०० एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में साफ TFA के 8 µ एल में lyophilized Httex1 के µ जी और बंद टेस्ट ट्यूब में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन । ध्यान से नाइट्रोजन या आर्गन की एक धारा के साथ एक धुएं डाकू के तहत TFA लुप्त हो जाना । नमूने के नुकसान से बचने के लिए नाइट्रोजन/आर्गन के कम दबाव का उपयोग करें ।
    1. के १०० µ एल में प्रोटीन भंग एच2ओ. का विश्लेषण 2 µ l द्वारा UPLC और 5 µ l द्वारा ईएसआई-MS के रूप में ३.८ चरण में. मिश्रण 20 µ 2x लोडिंग डाई के एल के साथ प्रोटीन समाधान के µ एल ।
    2. एसडीएस-PAGE के द्वारा 1 µ g को 10 µ g की मात्रा का विश्लेषण करें । ९० मिनट के लिए जेल में चलाने के लिए १८० V. दाग Coomassie डाई के साथ जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार । चित्र 2Dमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।

4. Httex1 प्रोटीन के समुच्चय और Resolubilization

चेतावनी: TFA एक अस्थिर तरल है और गंभीर जलता है इसलिए देखभाल के साथ संभाल कर सकते हैं । एक धुएं डाकू में सभी हैंडलिंग बाहर ले और पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी डिस्पोजेबल nitrile दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट) पहनते हैं ।

  1. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रित पाउडर से 10 मिलीलीटर Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) (१३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी ना2HPO4, 2 मिमी KH2पीओ4, पीएच ७.४) तैयार करें । प्रत्येक उपयोग करने से पहले एक ०.२ µm फ़िल्टर के माध्यम से DPBS समाधान फ़िल्टर करें ।
  2. भंग १५० एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में साफ TFA के 12 µ एल में lyophilized Httex1 के µ जी और बंद टेस्ट ट्यूब में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन । ध्यान से नाइट्रोजन या आर्गन की एक धारा के साथ एक धुएं डाकू के तहत TFA लुप्त हो जाना । नमूना३८के नुकसान से बचने के लिए नाइट्रोजन/आर्गन के कम दबाव का उपयोग करें ।
    नोट: सामान्य रूप से, 4 µ l TFA को भंग करने के लिए उपयोग करें और कुल ५० µ g को प्रोटीन के इस प्रक्रिया में टेस्ट ट्यूब के अंदर की दीवारों पर प्रोटीन की एक फिल्म बनाई जाएगी । निम्नलिखित चरणों में Httex1 के तत्काल एकत्रीकरण को रोकने के लिए, प्री-कूल्ड बफ़र्स के साथ काम करें, प्रोटीन हमेशा बर्फ पर रखें और उच्च सांद्रता से बचें ।
  3. पूर्व ठंडा DPBS के 1 मिलीलीटर में समग्र प्रोटीन भंग और 1 मीटर NaOH के साथ पीएच को 7.2-7.4 समायोजित करें । एक १०० केडीए केंद्रापसारक फिल्टर के माध्यम से १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में प्रोटीन समाधान फ़िल्टर (२०००० x g, 4 ° c, 20 मिनट) ।
    नोट: Httex1 की गणना की सैद्धांतिक एकाग्रता संभव हानि के लिए खाते में वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में अधिक है. निस्पंदन कदम प्रोटीन के विघटन के दौरान गठन किया है हो सकता है कि किसी भी समुच्चय को दूर करने के लिए आवश्यक है ।
  4. एक UPLC अंशांकन एमिनो एसिड विश्लेषण पर आधारित वक्र का उपयोग कर Httex1 की एकाग्रता का निर्धारण (λ२१४पर पता लगाने) और एमिनो एसिड विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन के 2 µ जी भेजने के लिए एकाग्रता10मांय । 3 µ एम Httex1 की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा करने की जरूरत है कि DPBS की राशि की गणना.
  5. DPBS की परिकलित मात्रा को टेस्ट ट्यूब में जोड़कर प्रोटीन को 3 µ मीटर तक पतला करें । एकत्रीकरण प्रोटोकॉल की दीक्षा तक बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    नोट: Httex1 43Q समाधान में संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए । इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के आधार पर हमेशा एक ताजा प्रोटीन समाधान तैयार । Httex1 प्रोटीन सबसे अच्छा-20 डिग्री सेल्सियस पर एक lyophilized पाउडर के रूप में संग्रहित कर रहे हैं ।

5. UPLC और परिपत्र Dichroism (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा समुच्चय के लक्षण वर्णन का उपयोग कर Httex1 43Q के एकत्रीकरण कैनेटीक्स की निगरानी

  1. पहले रिपोर्ट३९के रूप में उनि के लिए uranyl प्रारूप समाधान तैयार करें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर DPBS में एक 3 µ एम समाधान की मशीन द्वारा Httex1 43Q के एकत्रीकरण आरंभ (विघटन प्रोटोकॉल में ऊपर वर्णित के रूप में तैयार समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें) ।
    नोट: Httex1 के एकत्रीकरण की जरूरत है और प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर उच्च सांद्रता में किया जा सकता है ।
  3. (0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, ४८ और १२० ज) पर संकेत दिया समय बिंदुओं पर UPLC का उपयोग घुलनशील प्रोटीन की मात्रा यों तो । ऐसा करने के लिए, ३५ µ एल के एक aliquot ले लो और (२०००० एक्स जी, 4 ° c, 20 मिनट) केंद्रापसारक द्वारा अघुलनशील समुच्चय हटा दें । UPLC में supernatant के 4 µ एल इंजेक्षन । साधन सॉफ्टवेयर ४०का उपयोग कर पीक क्षेत्र के परिवर्तन के आधार पर घुलनशील मोनोमर के अनुपात की गणना । प्रतिनिधि परिणाम के साथ चित्र 3Aमें परिणामों की तुलना करें ।
  4. 0 और ४८ h पर CD स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके द्वितीयक संरचना में परिवर्तनों को चिह्नित करता है । १०० µ एल की एक aliquot ले लो और ellipticity (1 मिमी क्वार्ट्ज cuvette, १९५ एनएम के लिए २५० एनएम, 20 डिग्री सेल्सियस, डेटा अंक हर ०.२ एनएम, स्पीड 10 एनएम/मिनट, डिजिटल एकीकरण समय 2 एस, १.० एनएम की बैंडविड्थ) को मापने । नमूने के 6 स्पेक्ट्रा प्राप्त और औसत और चिकनी ९९ की चौड़ाई कनवल्शनफ़िल्टर्स के साथ एक द्विपद फिल्टर का उपयोग कर । स्पेक्ट्रा का मतलब अवशेषों के रूप में प्लाट दाढ़ ellipticity (θMRE)४१. चित्र 3Bमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।
  5. उनि द्वारा समुच्चय के संरचनात्मक और रूपात्मक गुणों की विशेषताएं । एक Formvar/कार्बन लेपित २००-मेष पर प्रोटीन समाधान के 3 µ एल रखो, चमक-1 मिनट के लिए डिस्चार्ज कॉपर ग्रिड 15 μL पानी के साथ दो बार ग्रिड धो लें, ०.७% (डब्ल्यू/वी) के 15 μL के साथ uranyl formate और दाग 30 एस के लिए ०.७% डब्ल्यू/वी uranyl formation के 15 μL के साथ । ग्रिड के एक उनि विश्लेषण करते हैं । चित्र 3Cमें प्रतिनिधि परिणामों के साथ परिणामों की तुलना करें ।

Representative Results

Httex1 ई. कोलाई में एक एन-टर्मिनल अपने6-सूमो टैग के साथ व्यक्त की है । अभिव्यक्ति और फ्यूजन प्रोटीन की शुद्धि के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में संक्षेप हैं । Httex1 के अनुक्रम Htt के अवशेषों के होते हैं और Ala2 के साथ शुरू होता है, क्योंकि Met1 vivo४२में पूरी तरह से सट गया है । अमीनो एसिड की संख्या 23Q संस्करण को संदर्भित करता है, व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का पूरा अनुक्रम चित्रा 1एमें दिखाया गया है । plasmids को समुदाय के साथ साझा करने के लिए निकट भविष्य में Addgene पर जमा किया जाएगा । प्लाज्मिड और व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का एक योजनाबद्ध चित्र 1बीमें दिखाया गया है । His6-सूमो Httex1 एक मध्यम स्तर पर एक्सप्रेस (चित्रा 1सी) और फ्यूजन प्रोटीन के अधिकांश lysis के बाद घुलनशील अंश में मौजूद है, दोनों 23Q और 43Q संस्करण के लिए । फ्यूजन प्रोटीन, आणविक भार के आधार पर अपेक्षा से अधिक विस्थापित हो जाता है । यह आंशिक रूप से सूमो की मजबूत तह की वजह से है, लेकिन ज्यादातर Httex1 की असामांय अनुक्रम संरचना के कारण, जिसमें मुख्य रूप से glutamine और रेखा के अवशेषों । wildtype (23Q) और उत्परिवर्ती (43Q) फ्यूजन प्रोटीन दोनों IMAC द्वारा ~ ८०% पवित्रता को समृद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1घ) सह शुद्ध मेजबान प्रोटीन की उपस्थिति Httex1 के तुलनात्मक रूप से कम अभिव्यक्ति स्तर और बड़ा नमूना द्वारा समझाया जा सकता है स्तंभ पर लागू किया गया वॉल्यूम ।

उसकी6-सूमो टैग के क्लीवेज और Httex1 की शुद्धि चित्रा 2एमें दिखाई गई है । UPLC अपने6-सुमो टैग (चित्रा 2बी) के क्लीवेज की निगरानी करने के लिए एक कुशल उपकरण है । फ्यूजन प्रोटीन का मूल शिखर भस्म हो जाता है और दो नए और अच्छी तरह से अलग चोटियों इसी अपने6-सूमो टैग और Httex1 दिखाई देते हैं । दरार प्रतिक्रिया 10-20 मिनट में समाप्त हो गया है । पश्चिमी ब्लाट (पश्चिम बंगाल) भी दरार की प्रतिक्रिया कुशलता से निगरानी करने के लिए धीमी है, लेकिन यह संदर्भ के लिए आंकड़ा में शामिल किया गया है और सूमो दरार की पूर्णता का प्रदर्शन । दोनों Httex1 23Q और 43Q अच्छी तरह से अपने6-सूमो टैग से RP-HPLC (चित्रा 2सी) से अलग किया जा सकता है और उच्च पवित्रता में प्राप्त किया गया के रूप में UPLC, एमएस और एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण (चित्रा 2डी) द्वारा दिखाया गया है ।

यह वर्णन करने के लिए कि Httex1 प्रोटीन इस विधि द्वारा तैयार Httex1 के अपेक्षित एकत्रीकरण गुण बनाए रखने, हम ३७ डिग्री सेल्सियस पर उत्परिवर्ती Httex1 के fibrillization कैनेटीक्स एक अवसादन परख द्वारा मूल्यांकन, सीडी द्वारा द्वितीयक संरचना में परिवर्तन पर नजर रखी स्पेक्ट्रोस्कोपी, और उनि द्वारा समुच्चय की आकृति विज्ञान की विशेषता । mHttex1 फाइब्रिल गठन के एकत्रीकरण कैनेटीक्स के एक प्रतिनिधि डेटा सेट के रूप में एक अवसादन परख द्वारा निर्धारितचित्रा 3एमें दिखाया गया है । समय के साथ घुलनशील Httex1 43Q की हानि, फाइब्रिल गठन के कारण UPLC द्वारा quantified था. हम घुलनशील प्रोटीन की एक पूरी कमी का निरीक्षण के बाद ४८ घंटे की मशीन । इसके अतिरिक्त, हम सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन की माध्यमिक संरचना निर्धारित (चित्रा 3बी) । Httex1 43Q unस्ट्रक्चर्ड (λमिन २०५ एनएम) से मुख्य रूप से β-शीट रिच रचना (λंयूनतम २१५ एनएम) के लिए पाली की मशीन के ४८ घंटे के बाद । इस संरचनात्मक परिवर्तन ४८ घंटे (चित्रा 3सी) में उनि द्वारा चौकसी के रूप में लंबे समय fibrillar समुच्चय के गठन के साथ है ।

Figure 1
चित्रा 1 . उसकी6-सूमो Httex1 फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि । 
(क) एमिनो एसिड अनुक्रम के अपने6-सूमो-Httex1-qn फ्यूजन constructs (अपने6-सूमो में हरे और Httex1-qn नारंगी में); (ख) संफ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि का योजनाबद्ध अवलोकन; (ग) अभिव्यक्ति का एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण और lysis के पश्चात् फ्यूजन प्रोटीन का घुलनशीलता; (घ) फ्यूजन प्रोटीन के IMAC शुद्धिकरण के वर्णलेख और एसडीएस द्वारा अंशों के विश्लेषण-पृष्ठ (लाल पट्टी: असीम अंश, नीला पट्टी: हाथ धोना, काली पट्टी: रेफरेंस पीक से युक्त भिन्न); कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . अपने6 सूमो टैग के क्लीवेज और टैग के शुद्धि-नि: शुल्क Httex1-QN प्रोटीन ।
(क) योजनाबद्ध सिंहावलोकन; (ख) UPLC द्वारा ULP1 के साथ सूमो टैग के दरार का विश्लेषण (नीला: ULP1 के अलावा पहले; काला: 20 मिनट (23Q), क्रमशः 10 मिनट (43Q) के बाद ULP1 के अलावा) और पश्चिम बंगाल (MAB5492 1:2000, माध्यमिक बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी 1:5000); (ग) Httex1 के preparative आरपी-HPLC शुद्धिकरण के वर्णलेख; D: UPLC द्वारा शुद्ध Httex1 का विश्लेषण, एसडीएस-पृष्ठ और ईएसआई-MS; अपेक्षित आणविक भार क्रमशः ९९४३ दा (23Q) और १२५०६ दा (43Q) है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . Httex1-43Q का समुच्चय: (क) UPLC के आधार पर अवसादन परख । (ख) माध्यमिक संरचना की सीडी स्पेक्ट्रा पर 0 एच और ४८ एच. (ग) उनि माइक्रोग्राफ के समुच्चय पर ४८ ज (स्केल बार्स हैं २०० एनएम). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम मूल, untagged Httex1 जिसमें 23 या ४३ glutamine अवशेषों की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया को रेखांकित किया है । यह एक सी के रूप में व्यक्त Httex1 द्वारा प्राप्त किया गया था टर्मिनल एक अपने6-सूमो टैग, जो IMAC द्वारा lysate सेल से फ्यूजन प्रोटीन अलग किया जाता है और Httex1 के HPLC शोधन से पहले सट जाता है । जबकि सूमो रणनीति कई अंय प्रोटीन के उत्पादन में इस्तेमाल किया गया है, हमारे विधि से पता चलता है कि अद्वितीय गुण सूमो भी आंतरिक रूप से परिक्रमा उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एकत्रीकरण प्रवण, amyloidogenic प्रोटीन है कि पहले से साबित कर दिया है बेहद मुश्किल से संभाल और४३,४४का उत्पादन । हम एक प्रोटोकॉल है कि सीधा है, का उपयोग करने के लिए आसान है और एक "अच्छी तरह से व्यवहार" प्रोटीन की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल के तुलनीय उपस्थित । सूमो फ्यूजन solubilizes और स्थिर Httex1 अभिव्यक्ति के दौरान और IMAC शुद्धिकरण कदम । टैग के समय से पहले दरार, के रूप में intein रणनीति10 और एकत्रीकरण के साथ मनाया अब एक मुद्दा थे ।

आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन विशेष रूप से गिरावट को कमजोर कर रहे हैं । N17 क्षेत्र में N-टर्मिनल क्षरण इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कोई समस्या नहीं है, जबकि Httex1 के PRD में जनचेतना हो सकता है । के रूप में कटा हुआ प्रोटीन बहुत hydrophobicity, प्रभारी और आकार में Httex1 के समान हैं, उंहें क्रोमेटोग्राफिक मतलब से हटाने के चुनौतीपूर्ण है, इस प्रकार यह सबसे अच्छा है पहली जगह में उनके गठन को रोकने के लिए । प्रोटोकॉल को बारीकी से चिपके रहते हैं, हमेशा बर्फ पर काम कर रहे है और एक पर्याप्त राशि का उपयोग करने के लिए तंग अवरोधक मनाया जनचेतना का स्तर बहुत कम रखने में मदद करनी चाहिए । Httex1 के C-टर्मिनस पर फ्यूजन टैग लगाने से PRD में जनचेतना को आसानी से हटा सकता है क्योंकि कटा हुआ प्रोटीन समानता टैग को भी खो देगा । हालांकि, अगर देशी अनुक्रम को बनाए रखने की जरूरत है इस विकल्प के रूप में लागू नहीं किया जा सकता Httex1 के साथ समाप्त होता है और हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा वहाँ कोई सी-टर्मिनल फ्यूजन टैग कि रेखांकित करने के बाद स्ट्रेस और कुशल दरार के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है कर रहे हैं.

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा ULP1 द्वारा सूमो टैग के क्लीवेज के बाद मुक्त Httex1 की हैंडलिंग है । प्रोटीन को तुरंत आरपी-HPLC द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए । सौभाग्य से, यह एक कुशल और तेजी से प्रतिक्रिया है कि आम तौर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट में पूरा हो गया है । इसके विपरीत, intein रणनीति intein की पूरी दरार के लिए कई घंटे की आवश्यकता है, इस प्रकार एक व्यापार की आवश्यकता होती है अधूरा दरार और शुरुआत एकत्रीकरण के बीच बंद क्रम में उपज को अधिकतम करने के लिए । एक तेजी से workup उत्परिवर्ती Httex1 के लिए आवश्यक है, के रूप में यह एक लंबे समय के लिए स्थिर है, जबकि दरार प्रतिक्रिया में मौजूद अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता पर कुल करने के लिए शुरू हो जाएगा । आरपी-HPLC शुद्धि के दौरान, सूमो का एक और लाभ स्पष्ट हो जाता है: जबकि एसएसपी DnaB intein hydrophobic है और स्तंभ के लिए दृढ़ता से चिपक जाती है, सूमो अधिक हाइड्रोफिलिक और elutes पूरी तरह से C4 उलट-चरण कॉलम से है । हालांकि वाणिज्यिक ULP1 काफी महंगा है, प्रोटीन आसानी से उच्च उपज में पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल29निंनलिखित का उत्पादन किया जा सकता है ।

Httex1 का उपयोग करने से पहले एक विसमुच्चय प्रोटोकॉल लागू करने के महत्वपूर्ण महत्व पर पर्याप्त जोर नहीं दिया जा सकता । Lyophilized polyQ प्रोटीन जैसे Httex1 स्थिर होते हैं और इन्हें लंबे समय तक संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन पानी में पूरी तरह घुलनशील नहीं होते और ये बफ़र्स होते हैं । क्षेऽ oligomers या तंतुओं की उपस्थिति के एकीकरण कैनेटीक्स और प्रोटीन४५के भौतिक गुणों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । यहां वर्णित समुच्चय प्रोटोकॉल प्रोटीन के विघटन, एक lyophilized नमूना से monomeric Httex1 के एक समाधान के अनुरूप समुच्चय और पीढ़ी को हटाने की अनुमति देता है । । हम सुमो और intein रणनीति के साथ प्राप्त Httex1 के लिए समान एकत्रीकरण कैनेटीक्स और फाइब्रिल आकृति विज्ञान मनाया ।

Httex1 उत्पादन के लिए पिछले तरीकों की तुलना में, सूमो रणनीति यहां वर्णित कई लाभ प्रदान करता है और संभव अध्ययन की सीमा का विस्तार और स्वास्थ्य और रोग में इस प्रोटीन के कार्यात्मक गुण की जांच । सूमो-Httex1 फ्यूजन प्रोटीन को संभालने के लिए आसान है, यह जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है या समाधान में 24 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर रखा, जबकि मुक्त mHttex1 समग्र होगा जल्दी । घुलनशीलता की स्थिरता और उच्च सूमो-Httex1 फ्यूजन प्रोटीन अधिक लचीलापन प्रदान करने के लिए हेरफेर प्रोटीन और/या mHttex1 में एंजाइमी और रासायनिक संशोधनों कि अंयथा संभव नहीं होगा परिचय के बाद क्लीवेज । इसमें पोस्ट-शोधों के संशोधनों, fluorophores, स्पिन लेबल, बायोटिन टैग आदि की शुरूआत शामिल है । यहां प्रस्तुत अग्रिम 1 चाहिए) स्पष्ट संरचना करने के लिए भविष्य के अध्ययनों की सुविधा-Httex1 के फंक्शन रिश्ते; 2) Htt एकत्रीकरण और विकृति प्रसार की जांच करने के लिए नए उपकरण उत्पन्न; 3) नए परख के विकास के लिए सक्षम अणुओं की पहचान है कि उत्परिवर्ती Httex1 स्थिर और उसके एकत्रीकरण को रोकने; और 4) अंय क्षेत्रों से वैज्ञानिकों को प्रोत्साहित करने के लिए इस प्रोटीन पर काम और हमारे खोज में शामिल होने के लिए है Huntington रोग के लिए इलाज मिल ले आओ ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे इस लेख की सामग्री के साथ ब्याज की कोई संघर्ष है ।

Acknowledgments

इस काम के CHDI फाउंडेशन और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा मुख्य रूप से वित्त पोषित किया गया । हम इस नई अभिव्यक्ति प्रणाली और इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ अपने अनुभव बांटने के लिए और उनके इनपुट और बहुमूल्य प्रतिक्रिया के लिए Lashuel समूह के अंय सदस्यों के विकास के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ सोफी Vieweg धंयवाद । हम भी ULP1 प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए प्रो ओलिवर Hantschel धंयवाद । लेखकों ने डॉ जॉन बी वार्नर और डॉ सेंथिल Thangaraj की पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धंयवाद

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

जैव रसायन अंक १३६ एचडी Huntington के रोग huntingtin neurodegeneration polyglutamine polyQ एकत्रीकरण तंतुओं सूमो फ्यूजन प्रौद्योगिकी प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि
देशी की पीढ़ी, untagged Huntingtin Exon1 मोनोमर और तंतुओं एक सूमो संलयन रणनीति का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter