Summary
我们提出了一个详细的方法来执行唾液收集, 包括小鼠气管切开和隔离三大涎腺。
Abstract
Hyposalivation 通常观察到 Sjögren 综合征的自身免疫反应或继放射损伤的主要涎腺。在这些情况下, 有关疾病发病机制和有效干预的问题仍然存在。一种优化的技术, 允许对涎腺的功能性评估是非常宝贵的研究外分泌腺生物学, 功能障碍和治疗。在这里, 我们提出一步一步的方法来执行的匹凡刺激唾液分泌, 包括气管切开和解剖三大鼠涎腺。我们还详细介绍了适当的小鼠头部和颈部解剖学在这些技术的访问。这种方法是可伸缩的, 允许多个鼠标同时处理, 从而提高了工作流的效率。我们的目的是提高这些方法的重现性, 每一个都有进一步的应用领域内。除了唾液收集, 我们还讨论了量化和规范化这些组织的功能能力的指标。有代表性的数据包括从颌下腺功能下降2周后, 分光辐射 (4 剂量 6.85)。
Introduction
涎腺疾病包括失调或分泌障碍的症状, 导致生产过剩 (sialorrhea) 或减产 (口干症和 hyposalivation) 的唾液1。在这两种情况下, 都有兴趣提高我们对涎腺生物学的认识, 迈向治疗发展的最终目标2。
涎腺是高度敏感器官, 并且经常被损坏在头颈癌放疗期间, 导致永久干嘴 (口干症)3, 4.与其他敏感组织不同, 涎腺的更替率相对较低, 分泌性损失的机制不太了解5,6。在这种独特的损伤设置, 组织再生和防护策略需要唾液功能评估。实验中, 小鼠唾液收集是评估辐射和治疗药物的腺体反应的一个特别有价值的工具。
在这里, 我们提出了一个方法, 以执行和量化刺激唾液分泌使用的匹毒蕈, 一个强有力的7激动剂。匹凡刺激自主神经系统诱发腺体分泌8,9。为了适当地完成这项试验, 需要进行气管切开, 以确保老鼠在整个过程中保持一个专利气道, 并减少口腔内的分泌物窒息和吸入的风险10。
这是一个终端程序, 最终清除三大涎腺: 腮腺 (PG), 颌下腺 (SMG) 和舌下 (SLG)。在功能性研究中, 腺体重量被记录下来, 通常用来规范化唾液测量11,12,13。这些数据在辐射研究中尤为重要, 其中腺体萎缩是预期结果14,15
在文献中有可变性的关于如何刺激唾液分泌被执行和报告的16。例如, 在文学范围内的匹比剂量至少三级17,18,19,20,21,22,23。在这里, 我们提出了一个优化的高剂量匹凡协议, 目的是提高方法执行的重现性, 以及提供一个模块化的技术平台 (气管切开, 唾液收集和腺体解剖), 可以适应需要。
除了协议演示外, 我们还包括有代表性的2周内唾液流动的功能数据 (4 剂量 6.85) 到 SMG 地区。
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Protocol
下文概述的所有体内程序均经罗切斯特罗切斯特大学动物资源大学委员会批准。纽约。
1. 准备
- 使用分析天平, 重20毫克的匹。将其溶于2毫升的无菌盐水中, 离心管。
注意: 由于匹属轻敏感, 并且随着时间的推移而失去活动, 这个解决方案应该在注射之日准备好, 并在被管理之前保护光线。 - 使用分析平衡, 权衡和识别所有收集管和玻璃毛细血管。收集管和玻璃毛细血管的数量应与小鼠数量相匹配。
2. 气管切开术
- 用分析天平称 C57/BL6 小鼠。
- 使用0.5 毫升注射器与 29G x ½ "针, 麻醉小鼠与腹腔注射无菌盐水溶液100毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克甲苯噻嗪。当鼠标不再响应刺激 (即没有踏板退出反射) 时, 继续执行以下步骤, 通常在注射后5到10分钟内发生。
- 在用棉签涂抹润滑剂后, 轻轻地涂抹在眼睛上, 把鼠标放在舞台上的仰卧位置。麻醉动物必须保持在温暖的表面上。
注意: 所有步骤都在室温下执行。 - 用手术胶带把鼻子、四肢和尾巴固定在舞台上。
- 用酒精擦干净和湿脖子。
注意: 这将有助于防止毛皮进入随后的切口。 - 用镊子提高腹中线颈部皮肤, 用解剖剪刀做一个小而浅的切口。引导剪刀进入开口, 慢慢地打开皮下的刀片, 分开组织平面。
- 保持皮肤抬起, 小心地切到1厘米以下的嘴。
- 在第一切口的下等和上级方面做两个侧向切口。使用镊子, 轻轻地反射离开皮肤, 使进入头部和颈部结构。
- 使用解剖显微镜在8X 放大, 可视化颌下腺 (中线:图 1)。
- 使用细钳, 轻轻地抬起腺体, 以暴露四舌骨下 (带) 肌肉在气管上方。避免撕裂或扰乱周围的血管或排泄管道。
- 如果从多个鼠标收集唾液, 请在继续之前对每只鼠标重复步骤 2.1-2.10。
注: 本程序可同时安全执行多达5只鼠标。 - 用小解剖剪刀, 移除带肌内侧部分, 同时尽量靠近中线。在手术过程中, 尽量减少气管的可视性, 保持带肌。避免偷任何附近的船只, 因为如果有严重出血继发量耗尽, 在诱导分泌物时, 匹比不会有效。
- 从气管中反射出带肌。
- 可视化喉、气管和甲状腺。确保气管的上部组织不明显。
- 用小解剖剪刀在气管的下/后向甲状腺进行水平切口。确保气道是专利的, 并清除液体。
3. 唾液收集
- 将胶带移近口部和角部解剖阶段向下 (45°, cranially), 以协助唾液流动。
- 使用0.5 毫升注射器与 29G x ½ "针, 执行腹腔注射10µL/克体重的匹凡总剂量100毫克/千克。
- 开始计时器。如果多剂量的老鼠, 通过快速移动和由助手同时注射其余的老鼠缩短提前时间。
- 使用标准钳, 打开口管进入毛细管。
- 一旦唾液中的一颗珠子被观察到, 将毛细管的近端放到液体中, 远端端放到位于解剖阶段以下的收集管 (两管预称重)。
注: 在 C57/BL6 雌性小鼠 6-10 周的年龄, 总流涎发生在2分钟的匹比注射。 - 如果唾液是在口中生成的, 而不是流过管子, 重试上一步。确保管不直接放置在粘膜表面, 这会阻碍入口。
- 收集唾液, 总共12分钟后, 匹凡刺激。确保气孔保持清晰。
注: 在这段时间内, 增加的潮汐量和分泌物 (唾液、泌尿、粪便) 是正常的。 - 如果老鼠有压抑的唾液功能 (g., 由于伤害或干预), 使用 P200 微将剩余的液体从口腔转移到收集管。如果从多个鼠标收集, 请确保提示被更改。
- 记录12分钟后收集唾液加管的重量。
4. 腺体解剖
- 弄死小鼠由 CO2安乐死 (如 AVMA 指南为动物安乐死: 2013 编辑) 然后切开, 注意保存头和脖子的结构。因此, 避免颈椎脱位是安乐死的一种方法。
- 将鼠标放在舞台上的仰卧位置。将原始站点中的腺体重新定位到气管 (图 1)。
- 使用解剖显微镜在8X 放大, 可视化主要腺体: PG, SMG 和 SLG。为了区分解剖过程中的腺体, 确定 PG 是弥漫的, 躺在与 SMG 和 SLG 侧。
注: 如果解剖 PG, 这应该首先做, 因为它是最不明确的, 最有可能被撕裂。 - 用镊子抓住 pg 的尾部, 将其从底层结构中拉出, 在用解剖剪刀切开 pg 头前轻轻地施加张力。
- 用镊子将 SMGs 周围的胶囊破坏。轻轻地分开左, 右的 SMG。
- 用镊子从粘附的 nonglandular 组织中释放 SMG 的背侧。
- 用镊子把沃顿商学院的导管拉紧, 用解剖剪刀切开导管, 从颈部取出 SMG。
- 用镊子轻轻地将 SLG 与 SMG 分开。
注: SLG 在 SMG 的 superolateral 方面。 - 使用分析天平记录 SMG 重量。
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Representative Results
当执行高剂量的匹比刺激唾液收集, 重要的是保持呼吸道, 以防止吸入或窒息的分泌物在口腔。提供了气管切开的示意图 (图 1)。气管切开后, 气孔必须保持清晰的组织和液体。
为了加强唾液收集过程中的毛细血管作用, 应将小鼠的头部置于45°角度向下定位。这些步骤可以在 > 1 鼠标上执行, 但不建议一次超过5只老鼠 (图 2)。收集完成后, 建议快速称量管子以避免蒸发损耗。
在唾液收集后, 老鼠被安乐死。颈椎脱位不应进行, 因为它可能会损害头部和颈部结构。小鼠返回解剖阶段, 腺体应重新定位在气管, 如原来的位置。腺体剥离 (图 3) 应从 PG 开始, 因为它的位置和扩散一致性。SMG 和 SLG 是牢固的, 并且可以容易地被去除。
在对小鼠4分6.85 的辐射后, 唾液功能显著减少2周 (图 4)。总唾液分泌, 和分泌规范化的腺体湿重被绘制。使用任一指标, 唾液功能容量减少, 如预期, 在辐照后2周24。
腺体组织可以固定和切片的组织学污渍和/或免疫组化。苏木精和伊红染色 (H & E) 显示类似的总的 SMG 结构, 无论是有或没有匹斯刺激 (图 5)。Nkcc1, 膜钠-氯化钾转运器的染色, 显示类似的细胞形态, 无论是匹比刺激 (图 6)。
图 1.气管切开示意图(A)在打开颈部区域后, 可视化主要结构。(B)完成气管切开术, 轻轻抬起, 但不分离, SMGs 不干扰邻近结构, 包括血液供应、神经支配和排泄导管。切开带肌以暴露气管软骨, 然后切开气管。在整个唾液收集过程中, 让 SMG 在原地和气管外露。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.唾液收集.跟随匹比刺激, 角度小鼠向下并且收集唾液通过毛细管入被安置的前称的收集管, 被放置在解剖阶段之下。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.涎腺主要解剖.一旦老鼠被安乐死, 重新定位和分离左, 右的 SMG。小心地将每个腺体与周围的 nonglandular 组织和血管分开。PG 是一个弥漫的, 横向的结构。SMG 和 SLG 加入, 但可以干净地与镊子分开。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.代表性分泌数据.两周后的分光 (4 剂量6.85 磅) 的 SMG, 匹凡刺激唾液分泌物测量。唾液功能被报告为总唾液容量 (A) 和总唾液容量 (B) 规范化对总 SMG 湿的重量。如预期的那样, 使用双尾配对 t 检验, SMG 的功能容量显著下降 (平均 @ SDp < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.苏木精和伊红染色.在匹比控制, 未经治疗的小鼠 (左) 后, 从一只老鼠身上收获了一个小鼠 (100 毫克/千克, 右)。H & E 染色显示总腺体结构在 10X (鳞片: 200 µm) (A, B) 和 40X (鳞片酒吧:50 µm) (C, D)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.Nkcc1 的免疫组化.在匹比控制, 未经治疗的小鼠 (左) 后, 从一只老鼠身上收获了一个小鼠 (100 毫克/千克, 右)。Nkcc1 是一种膜蛋白, 可用于评价细胞形态学。DAPI 用作核 counterstain (鳞片杆:75 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文提出一种评价涎腺功能的多步法方法, 可用于研究腺损伤和治疗。我们的程序包括气管切开, 唾液收集和腺体解剖, 每个实验应用都能支持涎腺生物学的综合研究。例如, 小鼠气管切开术在阻塞口腔的过程中被用于一般的气道管理。
正确的解剖和气管切开是需要的, 以刺激唾液分泌100毫克/千克。另一种方法是, 减少的匹比, 可以避免对气管切开的需要, 因此用于纵向评估唾液分泌物16。
除了记录唾液分泌物, 该协议还提供了一种准确的, 一致的方法来收集唾液的额外分析。此类研究包括流变学、蛋白质组学、酶活性、唾液渗透25、26、27和生物标志发现28、29。
最后, 对大涎腺的规范化解剖方法在唾液收集之外有效用。对了解腺体发育和对损伤的反应有兴趣。为了进行有效的调查, 重要的是要进行一致的, 清洁解剖的主要涎腺。清洁和有效的腺体隔离对于从主要的涎腺分离出的主要细胞的培养, 从机械上和酶的, 从大唾液腺30,31, 和组织学和免疫组化的文化至关重要。准备。此外, 当染色腺组织切片分泌蛋白时, 重要的是要考虑和控制这些产品可能耗尽后, 刺激唾液收集。
定量研究涎腺在损伤或干预中的作用是一项重要的实验技术。腺体组织学是信息性的, 可能引起关键的观察, 但结论是最好的支持, 明确的功能数据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该出版物中报告的研究得到国家牙科和颅面研究研究所 (NIDCR) 和国立卫生研究院全国癌症研究所 (R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296) 的支持。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。这项工作也得到了 NSF DMR 1206219 和 IADR 口腔护理奖 (2016) 创新的支持。
我们要感谢 Eri 圆山博士和安德鲁 Hollomon 为他们提供的唾液收集帮助。我们要感谢培伦翁协助进行腺体解剖。我们要感谢马修·格尔斯在图准备方面的协助。我们要感谢伊莲 Smolock 博士和艾米莉. 吴对这篇手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
