Summary
Nous présentons une approche détaillée pour effectuer le prélèvement de salive, y compris la trachéotomie murin et l’isolement des trois glandes salivaires principales.
Abstract
Hypoptyalisme est fréquemment observé dans la réaction auto-immune du syndrome de Sjögren ou d’après une blessure rayonnement vers les glandes salivaires principales. Dans ces cas, les questions demeurent au sujet de la pathogenèse de la maladie et des interventions efficaces. Une technique optimisée qui permet l’évaluation fonctionnelle des glandes salivaires est inestimable pour l’étude thérapeutique, dysfonction et la biologie des glandes exocrines. Ici, nous présentons une approche étape par étape, lorsque vous exécutez pilocarpine stimule la sécrétion de salive, y compris la trachéotomie et la dissection des trois principales glandes salivaires murines. Nous détaillons également l’anatomie tête et cou murine approprié consultée au cours de ces techniques. Cette approche est évolutive, permettant plusieurs souris être traitées simultanément, améliorant ainsi l’efficacité du flux de travail. Notre objectif est d’améliorer la reproductibilité de ces méthodes, dont chacun contient d’autres applications dans le domaine. En plus de prélèvement de salive, nous discutons des métriques pour quantifier et normaliser la capacité fonctionnelle de ces tissus. Des données représentatives sont incluses à partir des glandes sous-maxillaires avec la fonction des glandes salivaires déprimé 2 semaines après l’irradiation fractionnée (4 doses de 6,85 Gy).
Introduction
Troubles des glandes salivaires incluent syndrome de dysrégulation ou ayant une déficience de sécrétion conduisant à la surproduction (sialorrhée) ou sous-production (xérostomie et hypoptyalisme) de salive1. Dans les deux cas, il y a un intérêt dans l’amélioration de notre compréhension de la biologie de la glande salivaire vers le but ultime de développement thérapeutique2.
Les glandes salivaires sont des organes très radiosensibles et sont souvent endommagés au cours de la radiothérapie du cancer tête et cou, conduisant à une sécheresse permanente de la bouche (xérostomie)3,4. Contrairement aux autres tissus radiosensibles, cependant, les taux de roulement des glandes salivaires est relativement faible, et le mécanisme de perte sécrétoire est mal compris5,6. Dans ce cadre unique blessure, stratégies de régénération et de la radioprotection tissu exigent une évaluation fonctionnelle salivaire. Expérimentalement, prélèvement de salive murin est un outil particulièrement précieux pour évaluer la réaction de glande à rayonnement et agents thérapeutiques.
Nous présentons ici une méthode pour effectuer et quantifier la sécrétion de salive stimulée à l’aide de la pilocarpine, un puissant agoniste muscarinique7. Pilocarpine stimule le système nerveux pour induire la sécrétion de la glande8,9. Pour compléter ce test convenablement, une trachéotomie est nécessaire pour s’assurer que la souris conserve un brevet airway tout au long de la procédure et de réduire les risques d’étouffement et d’aspiration des sécrétions regroupées dans la cavité buccale10.
Il s’agit d’une procédure de terminale, qui a abouti à la suppression des trois glandes salivaires principales : la glande parotide (PG), la sous-maxillaire (SMG) et la sublinguale (SLG). Pour des études fonctionnelles, poids de la glande sont enregistrées et sont souvent utilisés pour normaliser la salive mesure11,12,13. Ces données sont particulièrement importantes dans les études de rayonnement, dans laquelle une atrophie de la glande est un résultat attendu14,15
Il y a la variabilité dans la littérature en ce qui concerne la sécrétion de salive comment stimulée est effectuée et rapporté16. Par exemple, les doses de pilocarpine dans la littérature portée au moins trois ordres de grandeur17,18,19,20,21,22,23. Nous présentons ici un protocole de pilocarpine optimisée de dose élevée avec l’intention de reproductibilité améliorée dans l’exécution de la méthode, comme fournissant une plate-forme modulaire de techniques (trachéotomie, prélèvement de salive et dissection de la glande) qui peut être adapté comme nécessaires.
En plus de la démonstration de protocole, nous incluons des données fonctionnelles représentatives des flux de salive à 2 semaines après l’irradiation fractionnée (4 doses de 6,85 Gy) dans la région SMG.
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Protocol
Toutes les procédures en vivo décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité Université sur les ressources animales de l’Université de Rochester, Rochester. NY.
1. préparation
- À l’aide d’une balance analytique, peser 20 mg de pilocarpine. Dissolvez-le dans 2 mL de sérum physiologique stérile dans un tube de microcentrifuge.
Remarque : Parce que la pilocarpine est sensible à la lumière et perd l’efficacité au fil du temps, cette solution devrait être préparée le jour de l’injection et abrie de la lumière jusqu'à ce que les administrés. - À l’aide d’une balance analytique, peser et identifier tous les tubes de prélèvement et capillaires en verre. Le nombre de tubes de prélèvement et capillaires en verre doit correspondre au nombre de souris.
2. canule de trachéotomie
- Peser les souris C57/BL6 en utilisant une balance analytique.
- À l’aide d’une seringue 0,5 mL avec aiguille 29 x ½", anesthésier la souris avec une solution saline stérile injectée par voie intrapéritonéale de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg. Passez à l’étape suivante lorsque la souris ne répond plus aux stimuli (c'est-à-dire l’absence du réflexe retrait pédale), qui se produit généralement dans les 5 à 10 min après l’injection.
- Après l’utilisation de lubrifiant sur un coton-tige, doucement s’appliquent aux yeux et placez la souris dans une position en décubitus dorsal sur la scène. L’animal anesthésié doit être conservé sur la surface chaude.
Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à température ambiante. - Fixer le nez, membres et queue sur la scène à l’aide de ruban chirurgical.
- Nettoyer et mouiller la nuque avec un imbibé d’alcool.
Remarque : Cela aidera à empêcher l’entrée des incisions ultérieures de fourrure. - Soulevant la peau ventrale médiane du cou avec une pince, faire une coupe petite et superficielle à l’aide de ciseaux de dissection. Guider les ciseaux dans l’ouverture et ouvrir lentement les lames par voie sous-cutanée pour séparer les tissus avions.
- Garder la peau soulevée, soigneusement coupé à 1 cm en dessous de la bouche.
- Faire deux incisions latérales sur les aspects inférieures et supérieures de la première coupe. À l’aide de pinces, refléter doucement loin la peau pour permettre l’accès aux structures de la tête et du cou.
- En utilisant le microscope à dissection à un grossissement 8 X, visualiser les glandes sous-maxillaires (médiane : Figure 1).
- À l’aide de pinces fines, soulever doucement les glandes pour exposer les quatre muscles sous-hyoïdiens (sangle) recouvrant la trachée. Éviter de déchirer ou de perturber la vascularisation environnante ou conduits excréteurs.
- Si collecte de salive depuis plus d’une souris, répétez les étapes 2.1-2.10 avec chaque souris avant de continuer.
Remarque : Cette procédure peut être en toute sécurité effectuée sur jusqu'à 5 souris en même temps. - Avec des petits ciseaux de dissection, enlever la partie médiale des muscles de la sangle tout en restant aussi près que possible la ligne médiane. Couper seulement autant que nécessaire pour visualiser la trachée et de garder les muscles de la sangle de la route au cours de la procédure. Éviter les entailles des navires voisins parce que s’il y a appauvrissement de volume secondaire à une hémorragie importante, il ne sera pas efficace pour induire la sécrétion pilocarpine.
- Refléter les muscles de la sangle de la trachée.
- Visualiser le larynx, la trachée et la glande thyroïde. Veiller à ce que la trachée est exempte de tout recouvrant les tissus.
- Faire une incision horizontale dans la trachée inférieure/postérieur à la thyroïde à l’aide de petits ciseaux de dissection. S’assurer que les voies respiratoires sont patent et claire du fluide.
3. prélèvement de salive
- Retirer le ruban adhésif près de stade de dissection bouche et angle vers le bas (45°, parotidien) pour aider à l’écoulement de la salive.
- À l’aide d’une seringue 0,5 mL avec aiguille 29 x ½", effectuer une injection intrapéritonéale de pilocarpine de poids 10 µL/g corps pour une dose totale de 100 mg/kg.
- Démarrer un minuteur. Si le dosage de plusieurs souris, réduire les délais en déplaçant rapidement et en ayant un assistant injecter simultanément les autres souris.
- À l’aide de pinces standard, ouvrir la bouche pour l’accès de tube capillaire.
- Une fois qu’on observe un filet de salive dans la bouche, placez l’extrémité proximale du tube capillaire dans le liquide, avec l’extrémité distale, placée dans un tube collecteur placé au-dessous de la platine de dissection (les deux tubes préalablement pesés).
Remarque : Chez les souris C57/BL6 femelles 6 à 10 semaines d’âge, salivation brute survient moins de 2 min d’injection de la pilocarpine. - Si la salive est de construction dans la bouche, mais ne pas coulant à travers le tube, retentez l’étape précédente. S’assurer que le tube n’est pas placé directement contre une surface muqueuse, qui peut faire obstacle à l’entrée.
- Recueillir la salive pour un total de 12 min après stimulation de la pilocarpine. Veiller à ce que la stomie reste claire.
Remarque : Une augmentation de volume courant et sécrétions (salivares, urinaires, fécales) sont normale pendant ce temps. - Si les souris ont déprimé fonction de salive (e.g., en raison de blessures ou d’intervention), transférer le liquide restant de la bouche dans le tube de prélèvement à l’aide d’une micropipette P200. Si la collecte de plusieurs souris, s’assurer que les conseils soient modifiés.
- Enregistrer le poids de salive plus tubes 12 min après l’injection de la pilocarpine.
4. glande Dissection
- Euthanasier souris de CO2 euthanasie (tel que décrit dans les directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux : édition 2013) suivi par thoracotomie, en prenant soin de préserver les structures de la tête et du cou. Pour cette raison, éviter la dislocation cervicale comme une méthode d’euthanasie.
- Placez la souris dans une position en décubitus dorsal sur la scène. Replacer les glandes dans le site d’origine sur la trachée (Figure 1).
- À l’aide d’un microscope à dissection sous un grossissement 8 X, visualiser les glandes principales : les PG et SMG SLG. Pour distinguer les glandes au cours de la dissection, identifier que le PG est diffuse, couché latéral au SMG et SLG.
Remarque : Si le PG de dissection, cela devrait être faite préalablement parce que c’est les plus susceptibles de se déchirer et moins définies. - Saisir la queue de la PG avec une pince, en tirant les structures sous-jacentes et exercez une légère tension avant de couper la tête de la PG avec ciseaux de dissection.
- Rupture de la capsule entourant le SMGs avec une pincette. Doucement, séparer le SMG gauche et droite.
- Gratuit l’aspect dorsal de la SMG de tissus collés de mycangiums avec une pincette.
- Retirer le SMG le cou par le canal de Wharton tendue de dessin avec une pince et couper le tuyau avec le ciseaux de dissection.
- Doucement le SLG séparer le SMG avec une pincette.
Remarque : Le SLG est dans l’aspect supéro de la SMG. - À l’aide d’une balance analytique, noter le poids de la SMG.
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Representative Results
Lors de l’exécution pilocarpine dose élevée, stimulée par le prélèvement de salive, il est important de maintenir les voies respiratoires afin d’éviter l’aspiration ou étouffement des sécrétions de la cavité buccale. Une représentation schématique de la trachéotomie est fournie (Figure 1). Après incision trachéale, la stomie doit rester à l’écart des fluides et les tissus.
Pour améliorer l’action capillaire pendant le prélèvement de salive, souris doivent être positionnés la tête vers le bas à un angle de 45°. Ces étapes peuvent être effectuées sur > 1 souris, même si elle n’est pas recommandé de dépasser 5 souris en même temps (Figure 2). Une fois que la collection soit effectuée, il est recommandé que les tubes être évaluée rapidement pour éviter les pertes par évaporation.
La suite de prélèvement de salive, les souris sont euthanasiés. Dislocation cervicale ne doit pas être effectuée, car cela pourrait endommager les structures de la tête et du cou. Souris sont renvoyés à l’étape de dissection, et les glandes doivent être repositionnés au-dessus de la trachée, comme initialement situé. Dissection (Figure 3) de la glande doit commencer avec le PG, en raison de sa position et la cohérence diffus. Le SMG SLG sont fermes et peut être enlevé facilement.
Suite 4 fractions de 6,85 rayonnement de Gy pour le SMG murine, fonction de salive diminue de manière significative par 2 semaines (Figure 4). Les deux total de la sécrétion de salive, et sécrétion normalisée au poids de la glande ont été tracées. Utilisant une métrique, capacité fonctionnelle salivaire est réduite, comme prévu, à deux semaines après l’irradiation,24.
Tissu des glandes peut être fixes et sectionnés pour taches histologiques et/ou immunohistochimie. L’hématoxyline et éosine (H & E) coloration montre semblable brut architecture SMG avec ou sans stimulation pilocarpine (Figure 5). Coloration pour Nkcc1, un transporteur sodium-potassium-chlorure de membrane, montre une morphologie cellulaire semblable indépendamment de la stimulation de pilocarpine (Figure 6).
Figure 1 . Trachéotomie schématique. (A) après l’ouverture de la région du cou, visualiser les grandes structures. (B) pour compléter une trachéotomie, doucement soulever, mais ne retirez pas, le SMGs sans perturber les structures voisines, y compris l’approvisionnement en sang, innervation et conduits excréteurs. Couper les muscles de la sangle pour exposer le cartilage trachéal avant de faire une incision dans la trachée. Laisser le SMG en place et de la trachée exposés au cours de la procédure de collecte de salive entière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Prélèvement de salive. Après une stimulation de pilocarpine, angle de souris vers le bas et recueillir la salive par le biais de tubes capillaires dans les tubes de prélèvement préalablement pesé, qui sont placés au-dessous de la platine de dissection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Principales glandes salivaires dissection. Une fois que les souris ont été euthanasiés, repositionner et séparer le SMG gauche et droite. Soigneusement séparer chaque glande qui entoure les mycangiums tissus et les vaisseaux sanguins. Le PG est une structure diffuse, latérale. Le SMG et SLG sont jointes, mais peuvent être proprement séparés avec une pince. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Données de sécrétion représentatif. Deux semaines après irradiation fractionnée (4 doses de 6,85 Gy) à la SMG, la sécrétion de salive stimulée par la pilocarpine a été mesurée. Fonction salivaire est signalée comme volume de salive total (A) et le volume total de salive (B) normalisés à SMG poids humide total. Comme prévu, il y a une diminution significative de la capacité fonctionnelle de la SMG (moyenne ± écart-type **p < 0,01 aide bilatérale non apparié t-test). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . L’hématoxyline et éosine SMG coloration. Tissu SMG a été récolté d’une souris après stimulation de pilocarpine (100 mg/kg, droite) par rapport au témoin, les souris non traitées SMG (à gauche). La coloration H & E montre glande brut structure à 10 X (barreaux de l’échelle : 200 µm) (A, B) et 40 X (barreaux de l’échelle : 50 µm) (C, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Nkcc1 SMG immunohistochimie. Tissu SMG a été récolté d’une souris après stimulation de pilocarpine (100 mg/kg, droite) par rapport au témoin, les souris non traitées SMG (à gauche). Nkcc1 est une protéine de membrane et peut être utilisé pour évaluer la morphologie cellulaire. DAPI est utilisé comme contre-colorant nucléaire (barreaux de l’échelle : 75 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous présentons une méthode plusieurs étapes pour évaluer la fonction des glandes salivaires, qui peut être appliquée à l’étude thérapeutique et lésion de la glande. Notre procédé implique la trachéotomie, prélèvement de salive et dissection de la glande, dont chacun a des applications expérimentales qui peuvent soutenir une étude intégrée de la biologie de la glande salivaire. Par exemple, trachéotomie murine a servi pour la gestion des voies aériennes générales au cours de procédures obstruant la cavité buccale.
Bonne dissection et incision trachéale sont requis pour pilocarpine stimule la sécrétion de salive à 100 mg/kg. Sinon, une dose réduite de pilocarpine peut éviter la nécessité d’une canule de trachéotomie et par conséquent être utilisée pour une évaluation longitudinale de la sécrétion de salive16.
En plus de noter la sécrétion de salive, ce protocole prévoit également un moyen précis et cohérent pour recueillir la salive pour des analyses supplémentaires. Ces études incluent la rhéologie, la protéomique, l’activité enzymatique, salive d’osmolarité25,26,27et biomarker discovery28,29.
Enfin, méthodes de dissection normalisés pour les glandes salivaires principales ont utilité au-delà de prélèvement de salive. Il y a un intérêt dans la compréhension de développement de la glande et de la réponse à une lésion. Pour des enquêtes efficaces, il est important d’effectuer des dissections conformes, propres, des glandes salivaires principales. Propreté et isolation efficace de la glande est critique pour les cultures dérivées des cellules primaires qui sont mécaniquement et enzymatiquement dissociées de la glandes salivaires principales30,31et pour histologique et immunohistochimique préparations. En outre, lorsque la coloration des protéines sécrétées dans les sections de tissu de la glande, il est essentiel d’examiner et de contrôler pour l’épuisement probable de ces produits après le prélèvement de salive stimulée.
Quantifier la fonction des glandes salivaires dans les enquêtes de blessures ou d’intervention est une technique expérimentale vitale. Histologie des glande est informatif et peut susciter des observations clés, pourtant conclusions sont mieux étayées par des données fonctionnelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental et recherche Craniofacial (NIDCR) et le National Cancer Institute (NCI) de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R56 DE025098 et UG3 DE027695 F30 CA206296. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce travail a été également soutenu par la NSF DMR 1206219 et de l’Innovation de l’AIRD en Oral Care Award (2016).
Nous tenons à remercier le Dr Eri Maruyama et Andrew Hollomon pour leur aide avec prélèvement de salive. Nous tenons à remercier Weng Pei-Lun pour son aide avec dissection de la glande. Nous tenons à remercier Matthew Ingalls pour son aide dans la préparation de la figure. Nous tenons à remercier le Dr Elaine Smolock et Emily Wu pour une lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
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