Summary
Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.
Abstract
Hyposalivation wird allgemein in der Autoimmun-Reaktion von Sjögren Syndrom oder die folgenden Strahlung Verletzung der großen Speicheldrüsen beobachtet. In diesen Fällen bleiben Fragen hinsichtlich der Pathogenese der Krankheit und wirksame Interventionen. Eine optimierte Technik, die funktionale Bewertung der Speicheldrüsen können, ist von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von therapeutisches Drüse Biologie, Dysfunktion und Therapeutika. Hier präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung von Pilocarpin stimuliert die Sekretion von Speichel, einschließlich Tracheostoma und die Zerlegung der drei großen murinen Speicheldrüsen. Wir ausführlich auch die entsprechenden murine Kopf und Hals Anatomie während dieser Techniken zugegriffen. Dieser Ansatz ist skalierbar, so dass für mehrere Mäuse gleichzeitig verarbeitet werden somit die Effizienz der Arbeitsabläufe. Unser Ziel ist es, die Reproduzierbarkeit dieser Methoden zu verbessern, von die jede weitere Anwendungen auf dem Gebiet hat. Neben Speichel Sammlung diskutieren wir Metriken für die Quantifizierung und Normalisierung der Funktionsfähigkeit dieser Gewebe. Repräsentative Daten sind 2 Wochen nach der fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) von mandibulären Drüsen mit depressiven Speicheldrüse Funktion enthalten.
Introduction
Speicheldrüse Störungen gehören Syndrome Dysregulated oder beeinträchtigt Sekretion führt zu Überproduktion (Sialorrhea) oder Unterproduktion (Xerostomie und endodontischen) Speichel1. In beiden Fällen gibt es Interesse an der Verbesserung unser Verständnis der Biologie der Speicheldrüse auf das Endziel der therapeutischen Entwicklung2.
Die Speicheldrüsen sind sehr strahlenempfindlichen Organe und sind oft im Kopf und Nacken Krebs Strahlentherapie, führt zu dauerhaften Mundtrockenheit (Xerostomie)3,4beschädigt. Im Gegensatz zu anderen strahlenempfindlichen Geweben Speicheldrüse Fluktuationsrate ist relativ gering, und der Mechanismus der sekretorischen Verlust ist schlecht verstandene5,6. In dieser Umgebung einzigartig Verletzung erfordern Gewebe-Regeneration und Strahlenschutz-Strategien Speichel funktionale Bewertung. Experimentell, ist murine Speichel Sammlung ein besonders wertvolles Instrument bei der Bewertung der Drüse auf Strahlung und Therapeutika.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Durchführung und Quantifizierung der stimulierten Speichels Sekretion mit Pilocarpin, eine potente muskarin Agonist-7. Pilocarpin stimuliert das vegetative Nervensystem Drüse Sekret8,9induzieren. Um diesen Test entsprechend abzuschließen, ist ein Tracheostoma erforderlich, um sicherzustellen, dass die Maus hält ein patent Atemwege während des Verfahrens und zur Reduzierung des Risikos von Würgen und Aspiration von gepoolten Sekret in der Mundhöhle10.
Dies ist ein terminal Verfahren, die ihren Höhepunkt bei der Entfernung von den drei großen Speicheldrüsen: die Parotis (PG), der mandibulären (SMG) und der Sublingual (SLG). Für funktionelle Studien Drüse Gewichte werden aufgezeichnet und werden oft verwendet, um Speichel Messung11,12,13zu normalisieren. Diese Daten sind besonders wichtig in Strahlung Studien, wobei Drüse Atrophie ein erwartetes Ergebnis14,15 ist
Gibt es Variabilität in der Literatur in Bezug auf wie stimuliert Sekretion von Speichel erfolgt und16berichtet. Z. B. Pilocarpin Dosen innerhalb der Literatur Span mindestens drei Größenordnungen17,18,19,20,21,22,23. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte hochdosierte Pilocarpin-Protokoll mit der Absicht der verbesserte Reproduzierbarkeit Methodenausführung sowie eine modulare Plattform von Techniken (Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion), die als angepasst werden kann benötigt.
Wir gehören neben Protokoll Demo 2 Wochen nach fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) für die SMG-Region repräsentative Funktionsdaten des Speichelflusses.
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Protocol
Alle in-Vivo -Verfahren unten umrissen wurden vom Ausschuss für Tier-Ressourcen an der University of Rochester, Rochester University angenommen. NY.
1. Vorbereitung
- Wiegen Sie mit Hilfe einer Analysenwaage, 20 mg Pilocarpin. In 2 mL steriler Kochsalzlösung in einem Microcentrifuge Schlauch auflösen.
Hinweis: Da Pilocarpin lichtempfindlich ist und Aktivität im Laufe der Zeit verliert, diese Lösung sollte am Tag der Injektion vorbereitet, und lichtgeschützt bis verabreicht. - Mit Hilfe einer Analysenwaage, wiegen und alle Röhrchen und Glaskapillaren identifizieren. Die Anzahl der Röhrchen und Glaskapillaren sollte die Anzahl der Mäuse übereinstimmen.
(2) Tracheostoma
- Wiegen Sie C57/BL6 Mäuse mit einer Analysenwaage.
- Mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, Betäuben Sie Mäuse mit einem intraperitoneal injizierten steriler Kochsalzlösung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort, wenn die Maus reagiert nicht mehr auf Reize (z. B. Fehlen der Reflex-Pedal Rückzug), die in der Regel innerhalb von 5 bis 10 min nach der Injektion auftritt.
- Nach der Entnahme Schmiermittel auf einem Baumwolle-gespitzten Applikator, sanft gelten für Augen und platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Das narkotisierten Tier muss auf warme Oberfläche gehalten werden.
Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt. - Die Nase, Gliedmaßen und Rute auf die Bühne mit chirurgischen Klebeband zu sichern.
- Reinigen und den Hals mit einem Alkohol abwischen naß.
Hinweis: Dies wird helfen, Fell in nachfolgenden Einschnitte zu verhindern. - Anhebung der ventralen Mittellinie Halshaut mit einer Pinzette, machen Sie einen kleinen, oberflächlichen Schnitt mit sezierenden Schere. Führen Sie die Schere in die Öffnung, und öffnen Sie langsam die klingen subkutan, um Gewebe Flugzeuge zu trennen.
- Halten Sie die Haut angehoben, schneiden Sie vorsichtig bis 1 cm unterhalb der Mündung.
- Stellen Sie zwei seitliche Einschnitte die minderwertigen und überlegenen Aspekte des ersten Schnittes. Mit Pinzette, sanft spiegeln Sie entfernt die Haut, um Zugriff auf Kopf und Nacken Strukturen ermöglichen.
- Das sezierenden Mikroskop bei 8 X Vergrößerung, visualisieren die submandibulären Drüsen (Mittellinie: Abbildung 1).
- Mit feinen Pinzette, heben Sie vorsichtig die Drüsen, die die vier Infrahyoid (Gurt) Muskeln über die Luftröhre aussetzen. Vermeiden Sie reißen oder Störung der umliegenden Gefäßsystem oder absondernde Luftschachte.
- Wenn Speichel aus mehrere Mäuse sammeln, wiederholen Sie Schritte 2.1-2.10 mit jeder Maus bevor Sie fortfahren.
Hinweis: Dieses Verfahren kann sicher auf bis zu 5 Mäuse gleichzeitig durchgeführt werden. - Mit kleinen sezierenden Schere Entfernen des medialen Teils der Gurt Muskeln während Ihres Aufenthalts möglichst nahe an der Mittellinie wie möglich. Schneiden Sie nur so viel wie nötig zu visualisieren Luftröhre Gurt Muskeln aus dem Weg während des Verfahrens. Vermeiden Sie nicking keine nahe gelegenen Schiffe, denn wenn es Volumenmangel sekundär zu erheblichen Blutungen gibt, Pilocarpin nicht effektiv bei der Induktion der Sekretion.
- Der Gurt Muskeln Weg von der Luftröhre zu reflektieren.
- Visualisieren Sie den Kehlkopf, Luftröhre und Schilddrüse. Sicherstellen Sie, dass die Luftröhre klar ist der darüberliegende Gewebe.
- Nehmen Sie einen horizontalen Schnitt in der Luftröhre minderwertig/Posterior an der Schilddrüse mit kleinen sezierenden Schere. Sicherstellen Sie, dass die Atemwege Patent- und klare Flüssigkeit.
(3) Speichel Sammlung
- Entfernen Sie das Klebeband in der Nähe von Mund und Winkel Dissektion Stufe nach unten (45° cranially), mit Speichelfluss zu unterstützen.
- Führen Sie mit einer 0,5 mL Spritze mit 29 x ½" Nadel, intraperitoneale Injektion von 10 µL/g Körper Gewicht Pilocarpin für eine Gesamtdosis von 100 mg/kg.
- Einen Timer gestartet wird. Wenn mehrere Mäuse Dosierung, reduzieren Sie Vorbereitungs-und Anlaufzeit sich schnell zu bewegen und gleichzeitig die verbleibenden Mäuse zu injizieren Assistent.
- Öffnen Sie standard Pinzetten verwenden, den Mund für Kapillarrohr Zugang.
- Sobald eine Perle von Speichel im Mund beobachtet wird, legen Sie das proximale Ende der Kapillare in die Flüssigkeit mit dem distalen Ende in ein Sammelrohr unterhalb der sezierenden Bühne (beide Rohre vorher gewogen) gelegt.
Hinweis: Bei weiblichen Mäusen C57/BL6 6-10 Wochen alt, tritt grobe Speichelfluss innerhalb von 2 min. von Pilocarpin-Injektion. - Wenn Speichel im Mund bauen, aber nicht durch das Rohr fließt, Korrekturen Sie vorherigen Schritt. Stellen Sie sicher, dass das Rohr nicht direkt gegen eine Schleimhautoberfläche gesetzt, die den Einlass behindern können.
- Sammeln Sie Speichel für insgesamt 12 min nach Pilocarpin Stimulation. Stellen Sie sicher, dass das Stoma klar bleibt.
Hinweis: Erhöhte Tidalvolumen und Sekret (Speichel, Urin, fäkale) sind während dieser Zeit normal. - Wenn Mäuse Speichel Funktion gedrückt haben (zB., aufgrund einer Verletzung oder Intervention), die restliche Flüssigkeit aus dem Mund auf dem Sammelrohr mit einer Mikropipette P200 übertragen. Wenn mehrere Mäuse sammeln, sicherzustellen Sie, dass Tipps geändert werden.
- Nehmen Sie das Gewicht der gesammelten Speichel plus Rohre 12 min nach Pilocarpin Injektion.
(4) Drüse Dissektion
- Einschläfern Mäuse durch CO2 Euthanasie (wie beschrieben in den AVMA Richtlinien für Euthanasie von Tieren: die Ausgabe 2013) gefolgt von Thorakotomie, kümmert sich um die Strukturen des Kopfes und des Halses zu bewahren. Vermeiden Sie aus diesem Grund zervikale Dislokation als Methode der Euthanasie.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf der Bühne. Positionieren Sie Drüsen am ursprünglichen Standort in der Luftröhre (Abbildung 1).
- Mit einem sezierenden Mikroskop unter 8 X Vergrößerung, visualisieren die großen Drüsen: die PG, SMG und SLG. Um die Drüsen während der Präparation zu unterscheiden, erkennen Sie, dass das PG diffuse, liegt lateral der SMG und SLG.
Hinweis: Wenn die PG sezieren, sollte dies zuerst erfolgen, da ist der zuletzt definierte und höchstwahrscheinlich abgerissen werden. - Das Heck des PG mit der Pinzette, ziehen es weg von zugrunde liegenden Strukturen zu erfassen und Spannung vor dem Schnitt den Kopf des PG mit präparierscheren sanft auftragen.
- Verletzung der Kapsel umgibt die SMGs mit Pinzette. Vorsichtig Trennen der linken und rechten SMG.
- Kostenlos des dorsalen Aspekt des SMG aus eingehalten nonglandular Gewebe mit Pinzette.
- Entfernen Sie die SMG vom Hals, indem Wharton Kanal straff mit der Pinzette zeichnen und schneiden das Rohr mit präparierscheren.
- Trennen Sie vorsichtig die SLG von der SMG mit Pinzette.
Hinweis: Die SLG ist in der Superolateral Aspekt der SMG. - Verwendung eines analytischen Waage, SMG Gewichte aufnehmen.
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Representative Results
Wenn Speichel Sammlung durchführen hochdosierte Pilocarpin stimuliert werden, ist es wichtig, die Atemwege um Aspiration zu vermeiden oder würgen von Sekret in der Mundhöhle. Eine schematische Darstellung des das Tracheostoma ist (Abbildung 1) zur Verfügung gestellt. Nach trachealen Schnitt muss das Stoma Gewebe und Flüssigkeiten frei bleiben.
Zur Verbesserung der Kapillarwirkung im Speichel Sammlung sollte Mäuse mit dem Kopf nach unten in einem 45° Winkel positioniert werden. Diese Schritte können durchgeführt werden, auf > 1 Maus, obwohl es nicht empfohlen ist, 5 Mäuse auf einmal (Abbildung 2) überschreiten. Nach Abschluss der Sammlung empfiehlt es sich, dass Rohre schnell abgewogen werden, um Verdunstungsverluste zu vermeiden.
Im Anschluss an Speichel Sammlung sind Mäuse eingeschläfert. Zervikale Dislokation sollte nicht durchgeführt werden, da es Kopf und Nacken Strukturen beschädigen kann. Mäuse sind auf die sezierenden Bühne zurück, und die Drüsen sollte über der Luftröhre, als ursprünglich befindet sich neu positioniert werden. Drüse Dissektion (Abbildung 3) sollte mit dem PG, aufgrund seiner Lage und diffuse Konsistenz beginnen. Die SMG SLG sind fest und können leicht entfernt werden.
Nach 4 Fraktionen von 6,85 Gy Bestrahlung der murinen SMG Speichel Funktion verringert erheblich von 2 Wochen (Abbildung 4). Beide total Sekretion von Speichel und Sekret auf Drüse Nassgewicht normalisiert wurden geplottet. Verwenden entweder metrisch, Speichel funktionellen Kapazität sinkt erwartungsgemäß in 2 Wochen nach der Bestrahlung24.
Drüsengewebe kann feste und geschnittenen für histologische Flecken und/oder Immunohistochemistry. Hämatoxylin und Eosin Färbung (H & E) ähnliche zeigt Brutto SMG Architektur mit oder ohne Pilocarpin Stimulation (Abbildung 5). Färbung für Nkcc1, zeigt ein Membran-Natrium-Kalium-Chlorid-Transporter, ähnliche Zellmorphologie unabhängig von Pilocarpin Stimulation (Abbildung 6).
Abbildung 1 . Tracheostoma schematische. Visualisieren Sie (A) nach dem Öffnen der Hals-Region, die wichtigsten Strukturen. (B) zur Vervollständigung Tracheostoma sanft heben Sie, aber nicht lösen Sie, die SMGs ohne Unterbrechung der benachbarten Strukturen, einschließlich der Blutversorgung und Innervation absondernde Luftschachte. Schneiden Sie die Gurt Muskeln um trachealen Knorpel verfügbar zu machen, bevor Sie einen Schnitt in die Luftröhre zu machen. SMG und Luftröhre ausgesetzt während der gesamten Speichel Einzugsverfahren zu verlassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Speichel Sammlung. Nach Pilocarpin Stimulation Winkel Mäuse nach unten und sammeln Sie Speichel durch Kapillaren in vorgewogene Röhrchen, die unterhalb der Dissektion Bühne platziert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Großen Speicheldrüse Dissektion. Sobald Mäuse eingeschläfert worden, neu zu positionieren und die linke und Rechte SMG zu trennen. Trennen Sie vorsichtig jede Drüse aus den umliegenden nonglandular Gewebe und Blutgefäße. Das PG ist eine diffuse, seitliche Struktur. Die SMG und SLG verbunden sind, sondern mit der Pinzette sauber getrennt werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Repräsentative Sekretion Daten. Zwei Wochen nach dem SMG fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) gemessen wurde Pilocarpin-stimulierten Speichels Sekretion. Speichel-Funktion wird berichtet, wie total Speichel Volumen (A) und total Speichel Volumen normalisiert (B), Gesamtgewicht SMG nass. Wie erwartet, gibt es eine signifikante Abnahme der Funktionsfähigkeit der SMG (± SD bedeuten **p < 0,01 mit zweiseitigen ungepaarten t-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Hämatoxylin und Eosin SMG Beflecken. SMG-Gewebe wurde von einer Maus nach Pilocarpin Stimulation (100 mg/kg, rechts) im Vergleich zur Kontrolle, unbehandelte Maus SMG (links) geerntet. H & E Färbung zeigt Brutto Drüse Struktur bei 10 X (Skalieren Bars: 200 µm) (A, B) und 40 X (Skalieren Bars: 50 µm) (C, D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Nkcc1 SMG Immunohistochemistry. SMG-Gewebe wurde von einer Maus nach Pilocarpin Stimulation (100 mg/kg, rechts) im Vergleich zur Kontrolle, unbehandelte Maus SMG (links) geerntet. Nkcc1 ist ein Membranprotein und kann zur zellulären Morphologie zu bewerten. DAPI dient als eine nukleare gegenfärbung (Skalieren Bars: 75 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir präsentieren Ihnen eine mehrstufige Methode zur Speicheldrüse Funktion bewerten die Drüse Verletzungen und Therapeutika studieren angewendet werden können. Unsere Verfahren beinhaltet Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion, von denen jede experimentelle Anwendungen hat, die ein integriertes Studium der Speicheldrüse Biologie unterstützen kann. Beispielsweise hat murinen Tracheostoma für allgemeine Atemwegsmanagement bei Eingriffen, die Behinderung der Mundhöhle verwendet worden.
Richtige Dissektion und trachealen Schnitt sind erforderlich für Pilocarpin stimuliert die Sekretion von Speichel bei 100 mg/kg. Alternativ eine reduzierte Pilocarpin-Dosis könnte vermeiden die Notwendigkeit Tracheostoma und daher für längs-Bewertung der Speichel Sekretion16verwendet werden.
Neben der Erfassung der Sekretion von Speichel, ermöglicht dieses Protokoll auch eine präzise, konsistente Speichel für zusätzliche Analysen zu sammeln. Diese Studien umfassen Rheologie, Proteomik, Enzymaktivität, Speichel Osmolarität25,26,27und Biomarker Discovery28,29.
Schließlich haben standardisierte Dissektion Methoden für die großen Speicheldrüsen Dienstprogramm über Speichel Sammlung. Es gibt ein Interesse an der Entwicklung der Drüse und Reaktion auf eine Verletzung zu verstehen. Für wirksame Untersuchungen ist es wichtig, einheitliche, saubere Sezierungen der großen Speicheldrüsen durchzuführen. Saubere und effiziente Drüse Isolation ist entscheidend für Kulturen abgeleitet von Primärzellen, die mechanisch und enzymatisch von den großen Speicheldrüsen30,31, und für getrennt sind histologische und immunhistochemische Vorbereitungen. Darüber hinaus Wenn für sekretierten Proteine in Gewebeschnitten Drüse Färbung, ist es kritisch zu prüfen und Steuern für den wahrscheinlich Abbau dieser Produkte stimulierten Speichels Sammlung folgen.
Speicheldrüse Funktion bei der Untersuchung von Verletzungen oder Interventionen zu quantifizieren, ist eine wichtige experimentelle Technik. Drüse Histologie ist informativ und Schlüsselbeobachtungen entlocken kann, dennoch Schlussfolgerungen werden am besten durch klare funktionelle Daten unterstützt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das nationale Institut des Dental und Craniofacial Forschung (NIDCR) und das National Cancer Institute (NCI) der National Institutes of Health Award Anzahl R56 DE025098, UG3 DE027695 und F30 CA206296 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch von der NSF-DMR-1206219 und der IADR-Innovation in Oral Care Award (2016) unterstützt.
Wir möchten Dr. Eri Maruyama und Andrew Hollomon danken für ihre Unterstützung mit Speichel-Kollektion. Wir möchten Pei-Lun Weng danken für Unterstützung mit Drüse Dissektion. Wir möchten danken Matthew Ingalls für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der Figur. Wir möchten Dr. Elaine Smolock und Emily Wu für kritische Lektüre des Manuskripts danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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