Summary
Vi presentiamo un approccio dettagliato dell'esecuzione di raccolta della saliva, compreso il tracheostomy murino ed all'isolamento di tre ghiandole salivari maggiori.
Abstract
Hyposalivation è osservata comunemente nella reazione autoimmune di sindrome di Sjögren o seguente lesione da radiazioni alla ghiandole salivarie principali. In questi casi, domande rimangono per quanto riguarda la patogenesi della malattia e interventi efficaci. Una tecnica ottimizzata che consente la valutazione funzionale delle ghiandole salivari è preziosa per indagare terapeutica, la disfunzione e la biologia della ghiandola exocrine. Qui, presentiamo un approccio passo per passo all'esecuzione di Pilocarpina ha stimolato la secrezione di saliva, compreso il tracheostomy ed la dissezione delle tre principali ghiandole salivari murine. Dettagliamo anche l'appropriato anatomia di testa e collo di murino letta durante queste tecniche. Questo approccio è scalabile, che consente più topi da elaborare simultaneamente, migliorando così l'efficienza del flusso di lavoro. Puntiamo a migliorare la riproducibilità di questi metodi, ognuno dei quali ha ulteriori applicazioni all'interno del campo. Oltre alla raccolta della saliva, discutiamo metriche per quantificare e normalizzare la capacità funzionale di questi tessuti. Dati rappresentativi sono inclusi da ghiandole sottomandibolari con funzione della ghiandola salivaria depresso 2 settimane che seguono la radiazione frazionata (4 dosi di 6.85 Gy).
Introduction
Ghiandola salivare disturbi includono le sindromi di dysregulated o secrezione alterata che conduce alla sovrapproduzione (scialorrea) o sottoproduzione (xerostomia e hyposalivation) di saliva1. In entrambi i casi, c'è un interesse nel migliorare la nostra comprensione della biologia della ghiandola salivaria verso l'obiettivo finale di sviluppo terapeutico2.
Le ghiandole salivari sono organi altamente radiosensibili e spesso sono danneggiate durante la radioterapia cancro testa e del collo, che porta a permanente secchezza delle fauci (xerostomia)3,4. A differenza di altri tessuti radiosensibili, tuttavia, il tasso di turnover della ghiandola salivaria è relativamente basso e il meccanismo di perdita secretiva è capita male5,6. In questa cornice unica ferita, strategie di rigenerazione e protezione dalle radiazioni del tessuto richiedono valutazione funzionale salivare. Sperimentalmente, raccolta di saliva murino è uno strumento particolarmente valido nel valutare la risposta della ghiandola alla radiazione sia agenti terapeutici.
Qui, presentiamo un metodo per l'esecuzione e quantificare la secrezione di saliva stimolata utilizzando pilocarpina, un potente agonista muscarinico7. Pilocarpina stimola il sistema nervoso autonomo per indurre la secrezione della ghiandola8,9. Per completare questo test in modo appropriato, un tracheostomy è necessario per garantire che il mouse mantiene pervietà durante tutta la procedura e di ridurre i rischi di soffocamento e di aspirazione dalle secrezioni riunite nella cavità orale10.
Si tratta di una procedura di terminale, che si conclude con la rimozione delle ghiandole salivarie principali tre: parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG). Per gli studi funzionali, ghiandola pesi vengono registrati e sono spesso utilizzati per normalizzare saliva misura11,12,13. Questi dati sono particolarmente importanti negli studi di radiazione, in cui l'atrofia della ghiandola è un risultato atteso14,15
Non c'è variabilità nella letteratura per quanto riguarda la secrezione di saliva come stimolata viene eseguita e segnalato16. Ad esempio, dosi di Pilocarpina all'interno della letteratura span almeno tre ordini di grandezza17,18,19,20,21,22,23. Qui, presentiamo un protocollo di Pilocarpina ottimizzato ad alte dosi con l'intento di una migliore riproducibilità in esecuzione del metodo, come pure fornendo una piattaforma modulare di tecniche (tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola) che può essere adattato come necessari.
Oltre alla dimostrazione di protocollo, includiamo dati rappresentativi funzionali del flusso della saliva a 2 settimane che seguono radioterapia frazionata (4 dosi di 6.85 Gy) nella regione di SMG.
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Protocol
Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester. NY.
1. preparazione
- Utilizzando una bilancia analitica, pesano 20 mg di pilocarpina. Scioglierli in 2 mL di soluzione fisiologica sterile in una microcentrifuga.
Nota: Poiché Pilocarpina è sensibile alla luce e perde l'attività nel corso del tempo, questa soluzione dovrebbe essere preparata il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato. - Utilizzando una bilancia analitica, pesare e identificare tutte le provette per il prelievo e tubi capillari in vetro. Il numero di provette per la raccolta e tubi capillari in vetro deve corrispondere al numero di topi.
2. tracheostomia
- Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.
- Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli (cioè assenza del riflesso del pedale ritiro), che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione.
- Dopo l'erogazione di lubrificante su un applicatore con punta di cotone, applicare agli occhi delicatamente e posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. L'animale anestetizzato deve essere mantenuto sulla superficie calda.
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente. - Fissare il naso, gli arti e la coda alla fase utilizzando nastro chirurgico.
- Pulire e bagnare il collo con un batuffolo imbevuto di alcool.
Nota: Questo vi aiuterà a impedire l'ingresso di incisioni successive di pelliccia. - Sollevare la pelle del collo del midline ventrale con il forcipe, fare un piccolo taglio superficiale usando le forbici per dissezione. Guida le forbici nell'apertura e aprire lentamente le lame per via sottocutanea per separare aerei del tessuto.
- Mantenendo la pelle sollevata, accuratamente tagliato a 1 cm sotto la bocca.
- Fare due incisioni laterali inferiori e superiori gli aspetti del primo taglio. Usando il forcipe, delicatamente riflettere via la pelle per consentire l'accesso alle strutture del collo e della testa.
- Uso del microscopio per dissezione a ingrandimento X 8, visualizzare le ghiandole sottomandibolari (linea mediana: Figura 1).
- Utilizzando una pinzetta, sollevare delicatamente le ghiandole per esporre quattro muscoli sottoioidei (cinghia) che ricopre la trachea. Evitare strappi o danneggiarne il vasculature circostante o dotti escretori.
- Se raccolta saliva da più di un mouse, ripetere i passaggi 2.1-2.10 con ogni mouse prima di continuare.
Nota: Questa procedura può essere effettuata sicuro su fino a 5 topi simultaneamente. - Con piccole forbici per dissezione, rimuovere la parte mediale dei muscoli della cinghia durante il vostro soggiorno più vicino alla linea mediana come possibile. Tagliare solo quanto necessario visualizzare trachea e muscoli della cinghia di mezzo durante la procedura. Evitare di intaccare le navi nelle vicinanze perché se c'è secondaria all'emorragia significativa deplezione di volume, Pilocarpina non sarà efficace a indurre la secrezione.
- Riflettere i muscoli della cinghia dalla trachea.
- Visualizzare la laringe, la trachea e la ghiandola tiroide. Assicurarsi che la trachea sia chiara del tessuto sovrastante.
- Fare un'incisione orizzontale nella trachea inferiore/posteriore alla tiroide utilizzando piccole forbici per dissezione. Assicurarsi che le vie respiratorie siano brevetto e chiaro del fluido.
3. saliva Collection
- Rimuovere il nastro vicino a bocca e l'angolo verso il basso la fase di dissezione (45°, cranialmente) per assistere con flusso della saliva.
- Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", eseguire l'iniezione intraperitoneale di Pilocarpina peso di 10 µ l/g corpo per una dose totale di 100 mg/kg.
- Avviare un timer. Se il dosaggio più mouse, riduzione del lead time spostando rapidamente e di avere un assistente iniettare contemporaneamente i topi restanti.
- Utilizzando standard forcipe, aprire la bocca per l'accesso a tubo capillare.
- Una volta una perlina di saliva è osservata in bocca, è possibile inserire l'estremità prossimale del tubo capillare nel fluido, con l'estremità distale inserito in un tubo di raccolta posizionato sotto il palcoscenico per dissezione (entrambi i tubi pre-pesati).
Nota: Nei topi femmina C57/BL6 6-10 settimane di età, salivazione lordo si verifica entro 2 minuti di iniezione di pilocarpina. - Se la saliva è costruzione in bocca, ma non che scorre attraverso il tubo, tentare nuovamente il passaggio precedente. Assicurarsi che il tubo non è posizionato direttamente contro una superficie mucosa, che possa ostruire l'ingresso.
- Raccogliere saliva per un totale di 12 min dopo stimolazione con pilocarpina. Assicurarsi che lo stoma rimane chiaro.
Nota: Aumento del volume tidal e secrezioni (salivari, urinarie e fecale) sono normali in questo periodo. - Se i topi hanno depresso la funzione della saliva (ad es., a causa di infortunio o intervento), trasferire il liquido rimanente dalla bocca al tubo di raccolta mediante una micropipetta P200. Se raccogliendo da più mouse, assicurarsi che suggerimenti sono modificati.
- Registrare il peso della saliva raccolta più tubi 12 min dopo l'iniezione di pilocarpina.
4. ghiandola dissezione
- Eutanasia di topi di CO2 eutanasia (come descritto nelle linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali: edizione 2013) seguita dal thoracotomy, avendo cura di preservare le strutture della testa e del collo. Per questo motivo, evitare di dislocazione cervicale come metodo di eutanasia.
- Posizionare il mouse in una posizione supina sul palco. Riposizionare le ghiandole nel sito originale sulla trachea (Figura 1).
- Usando un microscopio per dissezione sotto ingrandimento 8x, visualizzare le principali ghiandole: il PG e la SMG SLG. Per distinguere le ghiandole durante la dissezione, identificare che il PG è diffuso, che si trova laterale alla SMG e SLG.
Nota: Se il PG di dissezione, questo dovrebbe essere fatto prima perché è il meno definito e più probabilità di essere strappato. - Afferrare la coda del PG con la pinzetta, distanziando strutture sottostanti e applicare una leggera tensione prima di tagliare la testa del PG con forbici di dissezione.
- Violazione la capsula che circonda il SMGs usando il forcipe. Separare delicatamente la SMG destro e sinistro.
- Gratis la funzione dorsale del SMG dal tessuto nonglandular aderito usando il forcipe.
- Rimuovere la SMG dal collo disegno dotto di Wharton teso con il forcipe e tagliando il condotto con forbici di dissezione.
- Separare delicatamente la SLG da SMG usando il forcipe.
Nota: La SLG è nella funzione superolateral del SMG. - Con una bilancia analitica, registrare pesi SMG.
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Representative Results
Quando eseguire Pilocarpina dose elevata stimolato raccolta della saliva, è importante mantenere le vie respiratorie per impedire l'aspirazione o soffocamento dalle secrezioni nella cavità orale. Lo schema del tracheostomy è fornito (Figura 1). A seguito di incisione tracheale, lo stoma deve rimanere chiaro dei tessuti e dei fluidi.
Per migliorare l'azione capillare durante la raccolta della saliva, topi devono essere posizionati con la testa verso il basso ad angolo di 45°. Questa procedura può essere eseguita su > 1 il mouse, anche se si raccomanda di non superare i 5 topi in una sola volta (Figura 2). Al termine della raccolta, è consigliabile che i tubi da pesare rapidamente per evitare perdite per evaporazione.
Dopo il prelievo della saliva, i topi sono euthanized. Dislocazione cervicale non deve essere eseguita, che potrebbero danneggiare le strutture del collo e della testa. Topi sono tornati sul palco per dissezione, e le ghiandole dovrebbero essere riposizionate sopra la trachea, come originariamente situato. Dissezione della ghiandola (Figura 3) dovrebbe iniziare con il PG, grazie alla sua posizione e la consistenza diffusa. il SMG e SLG sono fermi e può essere rimosso facilmente.
A seguito di 4 frazioni di 6.85 Gy radiazioni per il SMG murino, funzione della saliva diminuisce significativamente entro 2 settimane (Figura 4). Entrambi totale secrezione di saliva, e secrezione normalizzata per peso bagnato ghiandola sono state tracciate. Utilizzando entrambi metrica, capacità funzionale salivare è ridotto, come previsto, a 2 settimane che seguono l'irradiazione24.
Tessuto della ghiandola può essere fisse e sezionate per macchie istologiche e/o immunohistochemistry. Ematossilina ed eosina che macchia (H & E) Mostra simili lordo architettura SMG sia con o senza stimolazione pilocarpina (Figura 5). Macchiando per Nkcc1, un trasportatore di membrana sodio-potassio-cloro, dimostra morfologia cellulare simile indipendentemente dalla stimolazione di pilocarpina (Figura 6).
Figura 1 . Tracheostomia schematico. (A) dopo l'apertura della regione del collo, visualizzare le principali strutture. (B) per completare un tracheostomy, delicatamente sollevare, ma non si staccano, SMGs senza interferire con le strutture vicine, tra cui il rifornimento di sangue, innervazione e dotti escretori. Tagliare i muscoli della cinghia per esporre la cartilagine tracheale prima di fare un'incisione nella trachea. Lasciare la SMG in luogo e trachea esposti durante la procedura di raccolta intera saliva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Raccolta di saliva. Seguito a stimolazione con pilocarpina, angolo topi verso il basso e raccogliere saliva attraverso tubi capillari nelle provette di raccolta pre-pesati, che vengono inseriti sotto il palcoscenico di dissezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Major la dissezione della ghiandola salivaria. Una volta che sono stata eutanasia topi, riposizionare e separare il SMG destro e sinistro. Separare con cura ogni ghiandola da nonglandular tessuti e vasi sanguigni circostanti. Il PG è una struttura diffusa, laterale. il SMG e SLG sono Uniti, ma può essere separato in modo pulito con il forcipe. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Dati rappresentativi secrezione. Due settimane dopo la radiazione frazionata (4 dosi di 6.85 Gy) per il SMG, secrezione di saliva stimolata Pilocarpina è stata misurata. Funzione salivaria è segnalato come volume totale della saliva (A) e il volume totale della saliva (B) normalizzato a SMG bagnato peso totale. Come previsto, c'è una diminuzione significativa nella capacità funzionale di SMG (media ± DS * *p < 0.01 usando due code spaiato t-test). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Ematossilina ed eosina SMG macchiatura. Tessuto SMG è stato raccolto da un mouse dopo stimolazione con pilocarpina (100 mg/kg, destra) rispetto al controllo, non trattati del mouse SMG (a sinistra). Macchiatura di H & E Mostra struttura lordo della ghiandola a 10x (scala bar: 200 µm) (A, B) e 40 X (scala bar: 50 µm) (C, D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Nkcc1 SMG Immunohistochemistry. Tessuto SMG è stato raccolto da un mouse dopo stimolazione con pilocarpina (100 mg/kg, destra) rispetto al controllo, non trattati del mouse SMG (a sinistra). Nkcc1 è una proteina di membrana e può essere utilizzato per valutare la morfologia cellulare. DAPI è usato come una colorazione nucleare (scala bar: 75 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo un metodo multistep per valutare la funzione della ghiandola salivaria, che può essere applicata a studiare terapeutica e lesioni della ghiandola. La nostra procedura prevede tracheostomia, raccolta di saliva e la dissezione della ghiandola, ognuno dei quali ha applicazioni sperimentali che possono supportare uno studio integrato di biologia della ghiandola salivaria. Ad esempio, tracheostomy murino è stato utilizzato per la gestione generale delle vie aeree durante le procedure che ostruisce la cavità orale.
Corretta dissezione e incisione tracheale sono necessari per la pilocarpina ha stimolato la secrezione di saliva a 100 mg/kg. In alternativa, una dose ridotta di Pilocarpina potrebbe evitare la necessità per il tracheostomy e quindi utilizzata per la valutazione longitudinale della secrezione di saliva16.
Oltre a registrare la secrezione della saliva, questo protocollo fornisce anche un mezzo preciso, coerenza per raccogliere saliva per ulteriori analisi. Tali studi comprendono reologia, proteomica, l'attività dell'enzima, saliva osmolarità25,26,27e biomarker discovery28,29.
Infine, metodi standardizzati di dissezione per ghiandole salivarie principali hanno utilità di là di raccolta di saliva. C'è un interesse a comprendere lo sviluppo della ghiandola e risposta alla lesione. Per indagini efficaci, è importante eseguire dissezioni coerente, pulite delle ghiandole salivarie principali. Pulire e ghiandola efficiente isolamento è fondamentale per colture derivate da cellule primarie che sono meccanicamente ed enzimaticamente dissociate dalle ghiandole salivari maggiori30,31e per istologici e immunohistochemical preparazioni. Inoltre, quando la macchiatura per proteine secrete in sezioni di tessuto della ghiandola, è fondamentale prendere in considerazione e controllare per lo svuotamento probabile di questi prodotti dopo la raccolta della saliva stimolata.
Quantificare la funzione della ghiandola salivaria in indagini di infortunio o intervento è una tecnica sperimentale vitale. L'istologia della ghiandola è informativo e può suscitare osservazioni chiave, eppure conclusioni sono meglio supportate da dati chiaro funzionali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental e Craniofacial Research (NIDCR) e il National Cancer Institute (NCI) dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R56 DE025098, UG3 DE027695 e F30 CA206296. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Quest'opera fu appoggiata anche dalla NSF DMR 1206219 e l'innovazione di IADR in Oral Care Award (2016).
Vorremmo ringraziare il Dr. Eri Maruyama e Andrew Hollomon per la loro assistenza con raccolta di saliva. Vorremmo ringraziare Weng Pei-Lun per la sua assistenza con la dissezione della ghiandola. Vorremmo ringraziare Matthew Ingalls per la sua assistenza nella preparazione di figura. Vorremmo ringraziare Dr. Elaine Smolock ed Emily Wu per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
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