Summary
マウスの気管切開と 3 つの大唾液腺の分離を含む唾液のコレクションを実行する詳細なアプローチを提案します。
Abstract
唾液は、シェーグレン症候群や大唾液腺に次の放射線障害の自己免疫の反作用でよく観察されます。これらの場合、病気の発症と効果的介入に関する質問のまま。唾液腺の機能評価ができる最適化されたテクニックは外分泌腺の生物学、機能不全、および治療の調査のため貴重です。ピロカルピンを実行するステップ バイ ステップ アプローチを提案するここでは、気管切開と 3 つの主要なマウス唾液腺の解剖など、唾液の分泌を刺激します。我々 はまた、これらのテクニックの中にアクセス適切なマウス頭頸部解剖の詳細します。このアプローチは、スケーラブルな仕事の流れの効率を上げる複数のマウスを同時に処理を可能にします。それぞれはさらにフィールド内でアプリケーションがこれらのメソッドの再現性の向上を目指しています。唾コレクションに加えて指標を定量化し、これらの組織の機能の正常化をについて説明します。代表的なデータは分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間落ち込んで唾液腺機能と顎下腺から含まれます。
Introduction
唾液腺の障害には、調節不全の過剰産生 (sialorrhea) や唾1の生産不足 (口腔乾燥症と唾液) の分泌障害症候群が含まれます。どちらの場合も、治療開発2の最終目標に向けて唾液腺の生物学の私達の理解の向上に関心があります。
唾液腺は放射線感受性非常器官、頭頸部がんの放射線治療、永久的なドライマウス (口腔乾燥症)3,4につながる間しばしば破損しています。他の放射線感受性の組織とは異なりただし、唾液腺の離職率は比較的低いと分泌の損失のメカニズムはかり5,6。このユニークなけが設定で組織再生と放射線防護戦略唾液の機能評価が必要です。実験的マウス唾液コレクションは腺に対する放射線と治療薬の評価に特に貴重なツールです。
実行して、ピロカルピン、強力なムスカリン作動薬7を使用して刺激唾液分泌の定量化の方法を紹介します。ピロカルピンは、腺分泌8,9を誘導するために自律神経を刺激します。このテストを適切に完了するには、気管切開は、マウスがプロシージャ中気道を維持するために口腔内10でプールされた分泌物から誤嚥・窒息のリスクを低減する必要があります。
これは、3 つの大唾液腺の除去で最高潮に達する、ターミナル手順: (PG) 耳下腺、顎下腺 (SMG)、舌下腺 (SLG)。機能性研究腺重量は記録され、唾液測定11,12,13を正規化する頻繁に使用されます。このデータは、前記腺萎縮が予想した結果14,15放射線研究で特に重要です。
どのように刺激唾液の分泌に関して文献の変動が実行され、16の報告があります。たとえば、ピロカルピン投与量文学スパン少なくとも 3 桁17,18,19,20,21,22,23内。今回、最適化された高用量ピロカルピン プロトコルとして合わせることができる技術 (気管、唾液のコレクション、および腺郭清) のモジュール式プラットフォームを提供することと同様に、メソッドの実行、再現性向上の目的で必要があります。
プロトコル デモに加えて、我々 は SMG 領域に分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間で唾液の流れの代表的な機能のデータを含めます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべては、生体内での下記手続は、ロチェスターの大学、ロチェスター動物資源の大学委員会によって承認されました。NY。
1. 準備
- 分析用天秤を使用すると、ピロカルピンの 20 mg の重量を量る。微量遠心チューブの滅菌生理食塩水 2 mL に溶かします。
注: ピロカルピンが光に敏感で、時間をかけて活動を失うのでこのソリューション必要があります準備注入の日と投与までの光から保護されました。 - 分析用天秤を使用すると、重量を量るし、すべてのコレクション チューブ、ガラス管を識別します。コレクション チューブ、ガラス管の数には、マウスの数を一致する必要があります。
2. 気管切開
- 分析用天秤を用いた C57/BL6 マウスの重量を量る。
- 29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入滅菌生理食塩液をマウスを麻酔します。マウスが応答する刺激 (すなわちペダル逃避反射の不在) に一般的に投与 5 〜 10 分以内に発生するときは、次の手順に進みます。
- 綿の先端アプリケータに潤滑剤を塗布後軽く目に適用され、仰臥位でステージ上にマウスを置きます。麻酔下の動物は、暖かい表面に保たれなければなりません。
注: すべての手順は、室温で実行されます。 - 鼻、手足、サージカル テープを使用して、ステージに尾を保護します。
- きれいにしアルコール ワイプで首を濡れています。
注: これは入力後切開から毛皮を防ぐため役立ちます。 - 鉗子で腹側正中線の首の皮膚を引き上げ、解剖はさみを使用して小さい、表面的なカットをします。開口部にはさみをご案内し、ゆっくりと皮下組織面を分離するブレードを開きます。
- 口の下に 1 cm 上げた肌に保つ、慎重にカットします。
- 最初のカットの劣ると優れた側面を 2 つの横切開を確認します。鉗子を使用すると、頭と首の構造へのアクセスを有効にする皮膚反映まで優しく。
- 顎下腺 8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた可視化 (正中線:図 1)。
- 微細鉗子を使用すると、気管を覆う 4 つの舌骨下 (ストラップ) 筋肉を公開する腺をそっと持ち上げます。涙や周囲の血管や導管を中断することを避けるため。
- 1 つ以上のマウスから唾液を収集する続行する前に各マウスを使って手順 2.1 2.10 を繰り返します。
メモ: この手順が安全で実行できます 5 マウスまで同時に。 - 小さな解剖はさみでできるだけ正中線に近い滞在中ストラップの筋肉の内側の部分を削除します。気管を視覚化し、プロシージャの間に方法のストラップの筋肉を保つために必要な量だけカットのみ。ピロカルピンが分泌を誘導する効果的ではない重要な出血にセカンダリ ボリュームの枯渇がある場合ために任意の近くの血管を傷つけないでください。
- 気管からストラップの筋肉を反映してください。
- 喉頭・気管・甲状腺を視覚化します。気管がない組織を覆うことを確認します。
- 小さな解剖はさみを使って甲状腺に劣る/後部気管内横切開を加えます。気道が特許と流体の明確なことを確認します。
3. 唾液コレクション
- 口と角解離ステージ下方近くテープを削除 (45 ° 頭側) 唾液の流れを支援します。
- 29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg の総線量の 10 μ L/g 本体重量ピロカルピンの腹腔内投与を実行します。
- タイマーを起動します。複数のマウスを投与している場合、は、迅速に移動することによって、アシスタント残りのマウスを同時に注入することでリードタイムを短縮します。
- 通常鉗子を使用すると、キャピラリー チューブのアクセスのための口を開きます。
- 口の中で唾液のビードを観察すると、遠位端で、流体にキャピラリー チューブの近位端の場所が (両方のチューブが事前の重量を量った) 解離性の段階の下に収集の管に配置。
注: C57/BL6 雌ネズミの 6-10 週齢総唾液分泌に発生しますピロカルピン注射の 2 分以内。 - 唾液は、口の中でビル管を通って流れていない場合、前の手順を再試行します。入口を妨げることができる粘膜表面に対して直接チューブが配置されていないことを確認します。
- ピロカルピン刺激 12 分の合計のため唾液を収集します。ストーマは明確に残ることを確認します。
注: この時間の間に、通常一回換気量の増加や分泌物 (唾液、尿、便) が。 - マウスは唾液の機能に踏み込んだ場合 (e.g。、ケガや介入のため)、P200 ピペットを使用してコレクションの管口から残りの流体に転送。複数のマウスから収集する場合は、ヒントを変更することを確認します。
- ピロカルピン注射後採取唾液プラス チューブ 12 分の重量を記録します。
4. 腺解剖
- CO2安楽死によってマウスを安楽死させる (動物の安楽死の AVMA のガイドラインに従って: 2013 年版) 開胸、頭と首の構造を維持するために世話が続きます。このため、安楽死の方法として頚部転位を避けます。
- 仰臥位でステージ上にマウスを置きます。気管 (図 1) を元のサイトで腺の位置を変更します。
- 8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた視覚化大腺: PG、SMG、SLG。解剖中腺を区別するために、PG がびまん性、SMG と SLG に横で横になっていることを特定します。
注: PG を解剖する場合これされるべき最初だから少なくとも定義され引き裂かれるらしい。 - 基になる構造から引き離し、鉗子で PG の尾をつかみ、優しく解剖はさみで PG の頭を切断する前に緊張を適用します。
- 鉗子を用いた SMGs を覆う被膜を破る。左と右の SMG を優しきます。
- 無料の鉗子を用いた付着 nonglandular 組織から SMG の背側面。
- 鉗子でピンと張ったウォートンのダクトを描画し、解剖はさみとダクトを切断、首から SMG を削除します。
- SMG は鉗子を使用してから、SLG を優しきます。
注: SLG は、SMG の上外側面では。 - 分析のバランスを使用して、SMG の重みを記録します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
唾コレクションに刺激高用量ピロカルピンを実行するときは、誤嚥を防ぐために気道を維持するために重要なまたは口腔内の分泌物から窒息です。切開の概略図 (図 1) を提供しています。気管切開後ストーマは組織や体液の明確なままする必要があります。
唾コレクション中に毛管作用を向上させるため、下方 45 ° の角度で自分の頭を持つマウスを配置必要があります。これらの手順を実行できます > 1 マウス、5 マウスを一度に (図 2) を超えることは推奨はしないが。コレクションが完了すると、チューブが蒸発損失を避けるために迅速に検討するをお勧めします。
次の唾コレクション、マウス、安楽死させた。頭と首の構造を損傷する可能性があります、頚部転位を実行できませんする必要があります。マウスは解離性のステージに戻り、最初に配置として、気管上腺の位置を変更する必要があります。腺解剖 (図 3) はパプア ニューギニア、その位置とびまん性の一貫性のために始まるべきであります。SMG と SLG のしっかりした、簡単に削除することができます。
次のマウスの smg 6.85 Gy 放射線の 4 分画、唾大幅縮小します 2 週間 (図 4)。両方合計唾液分泌、分泌腺の湿重量に正規化をプロットしました。いずれかのメトリックを使用して、次の照射242 週間で期待どおりに、唾液の機能容量は削減されます。
腺組織は、固定との切片の組織学的汚れや免疫組織化学的にすることができます。ヘマトキシリンとエオシン染色 (H & E) に示しますような SMG アーキテクチャ ピロカルピン刺激 (図 5) の有無の両方を総します。Nkcc1 の汚損、膜塩化ナトリウム カリウム輸送体は、ピロカルピン刺激 (図 6) に関係なく同じような細胞の形態を示しています。
図 1.気管スケマティック。(A)頸部を開いたら、主要な構造を可視化します。(B)気管切開を完了するには、持ち上げてが血液の供給、神経支配、導管など近隣の構造を停止させることがなく SMGs を取り外さないで優しく。気管切開を作る前に気管軟骨を公開するストラップの筋肉をカットします。場所と全体の唾コレクション処理中に公開されている気管の SMG を残します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.唾コレクション。ピロカルピン刺激マウス下の角度し、郭清のステージの下に配置されている事前重量を量られたコレクションの管に毛細管を通じて唾液を収集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.主要な唾液腺解剖します。マウスに安楽死されている位置を変更、別の左と右の SMG。慎重に nonglandular 組織や血管を周囲から各腺を区切ります。PG は、拡散反射光、水平構造です。SMG、SLG の参加している鉗子できれいに分離することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.代表的な分泌データ。Smg、分別された放射 (6.85 Gy の 4 用量) を次の 2 週間ピロカルピン刺激唾液の分泌を測定しました。唾液の機能が報告される総唾液量 (A) と合計唾液量 (B) に正規化された SMG 湿重量を合計します。予想通り、そこは SMG の機能が大幅に低下 (± SD を意味 * *p < 2 尾対になっていない t 検定を用いて 0.01)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.ヘマトキシリンとエオシン SMG 染色します。SMG 組織制御、未処理マウス SMG (左) と比較してピロカルピン刺激 (100 mg/kg、右) 後のマウスから収穫されました。10 X で総腺構造を示しています H & E 染色 (スケール バー: 200 μ m) (A、B) と 40 X (スケール バー: 50 μ m) (C, D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.Nkcc1 SMG 免疫。SMG 組織制御、未処理マウス SMG (左) と比較してピロカルピン刺激 (100 mg/kg、右) 後のマウスから収穫されました。Nkcc1 は、膜タンパク質、細胞形態を評価するために使用できます。DAPI は核の対比染色として使用されます (拡張バー: 75 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
腺傷害や治療研究に適用可能な唾液腺機能を評価するためにマルチ ステップ法を提案します。私たちの手順には、気管、唾液のコレクション、および唾液腺の生物学の統合研究をサポートすることができます実験アプリケーションを持つ腺解剖が含まれます。たとえば、マウスの気管は、口腔内を妨害する手順の中で一般的な気道管理のため使用されています。
ピロカルピンの適切な郭清と気管切開が必要で 100 mg/kg の唾液の分泌を刺激します。または、削減ピロカルピン投与気管切開の必要性を避けることができるし、唾液分泌16の縦断的評価のため。
唾液の分泌を記録に加えこのプロトコルは、追加の分析のため唾液を収集するために正確で一貫した手段を提供します。このような研究には、レオロジー、プロテオミクス、酵素活性、唾浸透圧25,26,27、およびバイオ マーカー探索28,29が含まれます。
最後に、標準郭清法大唾液腺唾液コレクションを超えてユーティリティがあります。腺の発達と傷害への応答を理解することに関心があります。効果的な調査の主要な唾液腺の一貫性のある、きれいな解剖を行うことが重要です。きれいにし、効率的な腺分離に由来する、機械的および酵素によって解離や大唾液腺30,31, からの一次電池文化の重要な組織学的および免疫組織化学準備。また、腺組織切片における分泌タンパク質の染色しているとき、は、考慮し、これらの製品の可能性が枯渇のため制御が重要です刺激唾液採取します。
けがや介入の調査で唾液腺機能の定量化は重要な実験手法です。腺組織は有益でありの重要な観測を引き出す可能性がありますまだ結論が明確な機能データでサポートされる最高。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、国立歯科研究所と顔面研究 (NIDCR) ・賞数 R56 DE025098、UG3 DE027695、F30 CA206296 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所 (NCI) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。この作品も、NSF DMR 1206219 と口腔ケア賞 (2016), 技術革新によって支えられました。
唾コレクション援助の博士えり丸山とアンドリュー ホローモンに感謝したいと思います。腺解剖して彼の支援の Pei Lun 翁に感謝したいと思います。我々 は図の準備の彼の援助のマシュー ・ インガルスを感謝したいです。この原稿の批判的読解の博士 Elaine Smolock とエミリー呉に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
