Summary
선물이 murine tracheostomy 등 3 개의 주요 침 샘의 침 컬렉션을 수행 하는 자세한 접근.
Abstract
Hyposalivation는 Sjögren의 증후군 또는 주요 침 샘을 다음 방사선 상해의 면역 반응에서 일반적으로 관찰 된다. 이러한 경우에 질문은 질병 병 인 및 효과적인 개입에 관한 남아 있다. 침 샘의 기능 평가 허용 하는 최적화 기법 조사 전 선 생물학, 부전, 및 치료제에 대 한 소중한 있다. 여기, 우리가 pilocarpine 수행 하는 단계 접근 방식을 제시 tracheostomy 등 세 가지 주요 murine 침 샘의 해 부, 타 액 분 비를 자극. 우리는 또한 적절 한 murine 머리와 목 해부학이이 기술 중 액세스를 선발. 이 방식은 확장성, 따라서 작업 흐름의 효율성을 향상 시키는 여러 마우스를 동시에 처리 될 수 있도록 합니다. 우리는 각각의 추가 필드 내에서 응용 프로그램은이 방법의 재현성을 향상을 목표로. 타 액 컬렉션, 이외에 우리는 메트릭을 측정 하 고이 조직의 기능 능력을 정상화 논의. 대표적인 데이터 분류 한 방사선 (6.85 Gy의 4 복용량) 다음 2 주 우울된 침 샘 기능 submandibular 동맥에서 포함 되어 있습니다.
Introduction
침 샘 장애 증후군 dysregulated 또는 장애인된 분 비 과잉 (sialorrhea) 또는 타 액1의 이용률 (xerostomia 및 hyposalivation)를 선도 포함 됩니다. 두 경우 모두에서 치료 개발2의 최종 목표를 향해 침 샘 생물학의 우리의 이해를 향상에 관심이 있다.
침 샘 매우 radiosensitive 기관, 그리고 종종 머리와 목 암 방사선 치료, 영구적인 구강 건조 증 (xerostomia)3,4로 이어지는 동안 손상 된. 그러나 달리 다른 radiosensitive 조직,, 침 샘 이직 률 상대적으로 낮은 이며 분 비 손실의 메커니즘은 불완전 하 게 이해5,6. 이 독특한 부상 설정에서 조직 재생과 radioprotection 전략 침 기능 평가 요구 한다. 실험적으로, murine 침 컬렉션은 방사선을 치료제 선 응답을 평가에 특히 유용한 도구입니다.
여기, 우리가 수행 및 pilocarpine, 강력한 muscarinic 주 작동 근7를 사용 하 여 자극된 타 액 분 비를 측정 하는 방법 제시. Pilocarpine 동맥 분 비8,9를 유도 하는 자율 신 경계를 자극. 이 테스트를 적절 하 게 완료 한 tracheostomy는 마우스는 절차를 통해 특허 기도 유지 하 고 질 식와 구강10에서 풀링된 분 비에서 소망의 위험을 줄이기 위해 필요 합니다.
이것은 3 개의 주요 침 샘의 제거에 culminating 터미널 절차: 귀 밑 (PG), submandibular (서울시), 그리고 삶의 (SLG). 기능 연구에 대 한 선 무게 기록 됩니다 하 고 타 액 측정11,,1213정상화에 자주 사용 됩니다. 이 데이터는 어떤 점에서 선 위축 예상된 결과14,15 는 방사선 연구에서 특히 중요 하다
어떻게 자극된 타 액 분 비에 관하여 문학에 있는 가변성 수행 되 고16보고 있다. 예를 들어 문학 범위 적어도 3 개의 크기 순서17,18,19,20,,2122,23내 pilocarpine 복용량. 여기, 메서드 실행, 뿐만 아니라 기술 (tracheostomy, 타 액, 수집과 동맥 해 부)으로 적응 될 수 있는 모듈형 플랫폼을 제공 하는 향상 된 재현성의 목적으로 최적화 된 높은 복용량 pilocarpine 프로토콜 선물이 필요합니다.
프로토콜 데모, 뿐만 아니라 우리는 서울시 지역에 분류 한 방사선 (6.85 Gy의 4 복용량) 다음 2 주에 타 액 흐름의 대표 기능 데이터를 포함 합니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 vivo에서 절차는 로체스터, 로체스터의 대학에서 동물 자원에 대학 위원회에 의해 승인 되었다. NY입니다.
1입니다. 준비
- 분석 균형을 사용 하 여, pilocarpine의 20 밀리 그램 무게. Microcentrifuge 튜브에서 메 마른 염 분 2 mL에 녹.
참고: pilocarpine 빛에 민감한 이며 시간이 지남에 따라 활동을 잃는다, 때문에이 솔루션 주입의 날 준비와 있어야 관리까지 빛 으로부터 보호 합니다. - 분석 균형을 사용 하 여, 무게 고 모든 컬렉션 튜브와 유리 모 세관을 식별 합니다. 컬렉션 튜브와 유리 모 세관의 수 생쥐의 수를 일치 해야 합니다.
2입니다. tracheostomy
- C57/BL6 마우스 사용 하 여 분석 균형 무게.
- 29G x ½"바늘 0.5 mL 주사기를 사용 하 여, 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 intraperitoneally 주입 된 살 균 염 분 솔루션 마우스 anesthetize. 마우스 이상에 응답 자극 (즉 페달 철수 반사의 부재), 일반적으로 주입 다음 5 ~ 10 분 이내 발생 하는 경우 다음 단계로 진행 합니다.
- 솜 밀고 주걱에 윤활제를 분배 후 부드럽게 눈에 적용 하 고 무대에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 마 취 동물 따뜻한 표면에 유지 되어야 한다.
참고: 모든 단계는 상 온에서 수행 됩니다. - 보안 코, 팔, 다리 및 꼬리 수술 테이프를 사용 하 여 단계를.
- 깨끗 하 고 젖은 알코올 지우기와 목.
참고:이 입력 이후 절에서 모피를 방지 도움이 됩니다. - 집게와 복 부 중간 목 피부를 올리는, 작은, 표면 커트 해가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 오프닝으로는 위를 안내 하 고 천천히 피하 조직 비행기를 분리 하는 블레이드를 엽니다.
- 입 아래 1cm를 잘라 신중 하 게 발생 하는 피부를 유지.
- 첫 번째 컷의 열 등 하 고 우량한 측면에 두 개의 측면 절 개를 확인 합니다. 집게를 사용 하 여 부드럽게 반영 멀리 머리 및 목 구조에 액세스할 수 있도록 피부.
- 8 X 확대 해 현미경을 사용 하 여 시각화 submandibular 동맥 (중간: 그림 1).
- 기도 overlying 4 infrahyoid (스트랩) 근육을 노출 하는 땀 샘을 리프트 부드럽게 미세 집게를 사용 하 여. 찢 어 또는 주변 맥 관 구조 또는 배설 덕트 방해 하지 마십시오.
- 둘 이상의 마우스에서 타 액을 수집 하는 경우 계속 하기 전에 단계 2.1-2.10 각 마우스를 반복 합니다.
참고:이 절차를 수행할 수 있습니다 안전 하 게에 5 쥐까지 동시에. - 작은 해가 위, 가능한 중간 선 가까이 머물면서 스트랩 근육의 중간 부분을 제거 합니다. 기도 시각화 하 고 절차 동안 방식의 스트랩 근육을 유지 하는 필요한 만큼만 잘라. 상당한 출혈을 보조 볼륨 고갈 경우 pilocarpine 됩니다 효과적으로 분 비를 유도 하기 때문에 어떤 가까운 선박 nicking 하지 마십시오.
- 기도에서 결박 근육을 반영 합니다.
- 갑 상선, 기관지, 후 두를 시각화 합니다. 기관 조직 overlying의 명확한 인지 확인 합니다.
- 게는 가로 절 개 기도에 열 등/후부 작은 해가 위를 사용 하 여 갑 상선. 특허 및 액체의 명확한 기도 인지 확인 합니다.
3. 타 액 컬렉션
- 입과 각도 해 부 무대 아래로 근처 테이프 제거 (45 °, cranially) 타 액 흐름을 지원 하기 위해.
- 29G x ½"바늘 0.5 mL 주사기를 사용 하 여, 100 mg/kg의 총계 복용량에 대 한 10 µ L/g 몸 무게 pilocarpine의 복 주사를 수행 합니다.
- 타이머를 시작 합니다. 여러 생쥐를 먹이 지, 신속 하 게 이동 하 여 및 보조 나머지 마우스를 동시에 주입 함으로써 리드 타임을 줄일.
- 표준 집게를 사용 하 여, 모 세관 튜브 액세스에 대 한 입을 엽니다.
- 타 액의 구슬을 입에 관찰 되 면 선단부 수집 관 해 단계 (사전 무게 두 튜브) 아래 위치에 배치와 함께 액체에 모 세관 튜브의 근 위 끝을 놓습니다.
참고: C57/BL6 여성 쥐에 있는 나이의 6-10 주 심한 타 액 분 비 발생 합니다 pilocarpine 주입의 2 분 이내. - 경우 타 액은 건물 입에 하지 튜브를 통해 흐르는, 이전 단계를 다시 시도 합니다. 튜브 입구를 저지할 수 있는 점 막 표면에 직접 배치 되지 않습니다 확인 하십시오.
- Pilocarpine 자극 다음 12 분의 총에 대 한 타 액을 수집 합니다. stoma 명확 남아 확인 하십시오.
참고: 증가 해 일 볼륨 및 분 비 물 (침, 오 줌, 배설물)은 보통이 시간 동안. - 마우스는 침 함수를 우울 하 게 하는 경우 (예., 부상 또는 개입), P200 micropipette를 사용 하 여 컬렉션 튜브를 입에서 나머지 액체를 전송. 여러 마우스에서 수집 하는 경우 팁 변경 됩니다 확인 합니다.
- 기록 수집된 타 액 플러스 튜브 pilocarpine 주사 후 12 분의 무게.
4. 동맥 해 부
- CO2 안락사로 마우스를 안락사 (동물의 안락사에 AVMA 지침에 설명 된 대로: 2013 판) 이어서 thoracotomy, 머리와 목의 구조를 보존 하도록. 이러한 이유로, 안락사의 방법으로 자 궁 경부 전위를 하지 마십시오.
- 무대에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 기도 (그림 1)을 통해 원래 사이트에 샘을 재조 정할.
- 8 배 확대, 아래 해 현미경을 사용 하 여 시각화 주요 동맥: PG, SMG, SLG. 해 부 동안 동맥을 구별 하는 PG는 확산, SMG와 SLG 측면 거짓말 식별 합니다.
참고: 경우 PG, 해 부 한다 이렇게 먼저 이상 정의 하 고 가장 찢 길 것 이기 때문에. - 기본 구조에서 당기고 집게와 PG의 꼬리를 잡고 하 고 부드럽게 해 부가 위와 PG의 머리를 절단 하기 전에 긴장을 적용 합니다.
- 위반 주변 SMGs 집게를 사용 하 여 캡슐. 부드럽게 왼쪽 및 오른쪽 SMG를 구분 합니다.
- 집게를 사용 하 여 준수 nonglandular 조직에서 서울시의 등 쪽 부분을 무료.
- 집게와 긴장 된 왓슨의 덕트 절단가 위 해 부와 덕트 여 목에서 서울시를 제거 합니다.
- 부드럽게 집게를 사용 하 여 서울시에서는 SLG를 구분 합니다.
참고:는 SLG는 SMG의 superolateral 부분에는. - 분석 균형을 사용 하 여, SMG 무게 기록.
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Representative Results
높은 복용량 pilocarpine 수행 자극 타 액 컬렉션, 그것은 흡 인을 방지 하기 위해 기도 유지 하는 것이 중요 또는 구강에 분 비 물에서 질 식. tracheostomy 회로도 (그림 1)를 제공 됩니다. Tracheal 절 개, 다음은 stoma 조직과 체액의 명확한 유지 되어야 합니다.
타 액 수집 중 모 세관 작용을 향상, 마우스 아래쪽 45 ° 각도에서 그들의 머리와 함께 위치 한다. 다음이 단계에서 수행할 수 있습니다 > 1 마우스, 비록 5 마우스를 한 번에 (그림 2)를 초과 하는 권장 되지 않습니다. 컬렉션 완료 되 면, 튜브 증발 손실을 피하기 위해 신속 하 게 무게가 될 것이 좋습니다.
타 액 컬렉션에 따라 마우스는 안락사. 자 궁 경관 탈 구 해야 하지 수행할 수, 그것은 머리와 목 구조를 손상 될 수 있습니다. 쥐 해 단계에 반환 되 고 분 비 기관으로 원래 위치에 위치 한다. 동맥 절 개 (그림 3) 페이지, 그것의 위치 및 확산 일관성으로 시작 한다. SMG와 SLG, 회사는 쉽게 제거 될 수 있다.
6.85 Gy 방사선 murine SMG 4 분수, 다음 침 기능 2 주 (그림 4)에 의해 크게 감소합니다. 둘 다 타 액 분 비, 총 고 분 비 샘 젖은 무게 정규화 표시 했다. 어느 통계를 사용 하 여 침 기능 능력은 감소, 2 주 조사24다음 예상 대로.
고정 및 대 한 sectioned 조직학 얼룩 또는 immunohistochemistry 동맥 조직 될 수 있습니다. 되며 고 오신 얼룩 (H & E) 쇼 유사한 총 SMG 아키텍처와 함께 또는 없이 pilocarpine 자극 (그림 5). Nkcc1에 대 한 얼룩, 막 나트륨-칼륨-염화 운송업 자 pilocarpine 자극 (그림 6)에 관계 없이 비슷한 셀 형태를 보여줍니다.
그림 1 . 도식 tracheostomy. (A) 목 지역을 연 후 주요 구조 시각화. (B)는 tracheostomy 완료, 부드럽게 리프트, 하지만 않습니다 하지 분리, 혈액 공급, 신경 분포, 배설 덕트 등 이웃 구조를 방해 하지 않고 SMGs. 기도에 절 개를 하기 전에 tracheal 연골을 노출 결박 근육을 잘라. 장소와 기관 전체 타 액 수집 절차 동안 노출에 SMG를 남겨 주세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 타 액 컬렉션. Pilocarpine 자극, 다음 마우스 아래쪽 각도 하 고 미리 무게 컬렉션 튜브, 해 부 무대 아래 배치로 모 세관을 통해 타 액을 수집 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 주요 침 샘 해 부. 일단 쥐 안락사 되었습니다, 위치 하 고 왼쪽 및 오른쪽 SMG를 분리. 신중 하 게 nonglandular 조직 및 혈관 주위에서 각 선을 구분 합니다. PG는 확산, 측면 구조입니다. SMG와 SLG 결합, 하지만 집게와 완전히 분리 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 대표적인 분 비 데이터. 서울시, 분류 한 방사선 (6.85 Gy의 4 복용량) 다음 2 주 pilocarpine 자극 타 액 분 비를 측정 했다. 침 기능 총 타 액 (A) 볼륨과 볼륨 총 타 액 (B) 정규화를 보고 서울시 젖은 무게 총. SMG의 기능 능력에 상당한 감소는 예상 대로 (± SD 의미 * *p < 0.01 양측 짝이 없는 t-검정을 사용 하 여). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 되며 고 오신 SMG 얼룩. 서울시 조직 제어, 치료 마우스 (왼쪽) 서울시에 비해 pilocarpine 자극 (100 mg/kg, 오른쪽) 후 마우스에서 수확 했다. 10 X 총 선 구조를 보여줍니다 H & E 염색 (바 규모: 200 µ m) (A, B)와 40 X (바 규모: 50 µ m) (C, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . Nkcc1 서울시 Immunohistochemistry. 서울시 조직 제어, 치료 마우스 (왼쪽) 서울시에 비해 pilocarpine 자극 (100 mg/kg, 오른쪽) 후 마우스에서 수확 했다. Nkcc1 막 단백질 이며, 세포 형태를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다. DAPI 핵 counterstain로 사용 됩니다 (바 규모: 75 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리 동맥 상해 및 치료제 연구에 적용 될 수 있는 침 샘 기능을 평가 하기 위해 다단계 방법 제시. 우리의 절차 tracheostomy, 타 액, 수집과 동맥 해 부, 각각의 침 샘 생물학의 통합된 연구를 지원할 수 있는 실험적인 응용 프로그램은 포함 한다. 예를 들어 murine tracheostomy 구강 방해 절차 동안 일반 기도 관리를 위해 사용 되었습니다.
Pilocarpine에 필요한 적절 한 해 부 및 tracheal 절 개는 100 mg/kg에서 타 액 분 비를 자극. 또는, 감소 pilocarpine 투여 tracheostomy에 대 한 필요성을 피할 수 있는 고 타 액 분 비16의 경도 평가 따라서 사용 합니다.
이 프로토콜 녹화 뿐만 아니라 타 액 분 비, 추가 분석에 대 한 타 액을 수집 하는 정확 하 고 일관 된 방법을 제공 합니다. 이러한 연구에는 유동성, proteomics, 효소 활동, 타 액 osmolarity25,,2627및 바이오 마커 발견28,29포함 됩니다.
마지막으로, 주요 침 샘에 대 한 표준화 된 해 부 방법 침 컬렉션 넘어 유틸리티가 있다. 선 개발 및 부상에 대 한 응답을 이해에 관심이 있다. 효과적인 수사에 대 한 주요 침 샘의 일관성, 깨끗 한 해 수행 하는 것이 중요입니다. 깨끗 하 고 효율적인 선 분리는 기계적으로 그리고 효소 해리 주요 침 샘30,31에서 1 차 셀에서 파생 된 문화에 대 한 중요 하다 더 고 immunohistochemical 준비입니다. 또한, 선 조직 단면도 있는 단백질 분 비에 대 한 얼룩 때 그것은 중요 한 고려 하 고 이러한 제품의 가능성이 고갈에 대 한 제어 다음 자극된 타 액 컬렉션.
부상이 나 개입의 조사에서 침 샘 기능을 측정 하는 것은 중요 한 실험 기술입니다. 동맥의 조직학 유익 하 고 주요 관찰, 유도 수 있습니다 아직 결론 가장 명확한 기능 데이터에 의해 지원 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구는 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIDCR)와 보너스 번호 R56 DE025098, UG3 DE027695, 및 CA206296 F30 국립 보건원의 국립 암 연구소 (NCI)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 작품 또한 NSF DMR 1206219와 IADR 혁신 구강 케어 상 (2016)에 의해 지원 되었다.
우리는 박사에 리 마루야마와 앤드류 Hollomon 타 액 컬렉션과 함께 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다. 우리는 동맥 해 부와 그의 지원에 대 한 페이 Lun Weng 감사 하 고 싶습니다. 우리는 매튜 잉 그림 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는이 논문의 중요 한 읽기 박사 Elaine Smolock, 에밀리 우 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
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