Summary
Her præsenterer vi en protokol for at kirurgisk oprette intestinal sammenskrevne sløjfer i kylling små tarme. Denne procedure giver mulighed for sammenligning af flere Clostridium perfringens stammer virulens i situ i en enkelt vært. Denne metode reducerer markant antallet af kyllinger normalt nødvendigt for lignende i vivo eksperimenter.
Abstract
Nekrotisk enteritis blev studeret i kyllinger ved hjælp af forskellige i vivo infektion modeller. De fleste af disse bruger en kombination af disponerende faktorer, såsom coccidiose og kost, med sonde eller administration via foder ved hjælp af Clostridium perfringens. I disse modeller kræver sammenligning af flere C. perfringens stammer for virulens undersøgelser et stort antal af værter til at opnå betydelige resultater. Dødelighed i løbet af undersøgelsen kan være høje afhængigt af den eksperimentelle model, dermed øge etiske bekymringer vedrørende dyrevelfærd i forskning. Udviklingen af nye infektion modeller kræver færre dyr at studere patogenese, endnu giver statistisk signifikant og valide resultater, er vigtigt at reducere brug af dyr i forskning. Intestinal sammenskrevne loop modeller har været brugt til at studere clostridier infektioner i forskellige arter såsom mus, kaniner og kalve. Efter kirurgiske procedurer til at oprette sammenskrevne loop segmenter, C. perfringens stammer injiceres direkte i løkker til at etablere en tæt kontakt mellem bakterier og tarmslimhinden. Der tages prøver af tyndtarmen og luminale indhold ved afslutning af procedurerne efter et par timer. Flere bakteriestammer kan podes i hvert dyr, derfor reducere antallet af krævede fag i eksperimenter. Også, procedurerne udføres under generel anæstesi til at mindske dyrenes smerter. I kyllinger, ville denne model være mere passende end oral administration at sammenligne C. perfringens stamme patogenicitet, fordi færre dyr er nødvendig, ingen disponerende faktorer er nødvendige for at fremkalde sygdommen og smerter er kontrolleret af analgetika . Tarm sammenskrevne loop model er dårligt beskrevet i kyllinger og standardisering er afgørende for optimal brug. Håndskriftet indeholder alle de nødvendige trin for at oprette talrige intestinal sammenskrevne sløjfer i kyllinger og bringer oplysninger om de kritiske punkter at opnå gyldige resultater.
Introduction
Anvendelsen af dyremodeller for at studere smitsomme sygdomme hos mennesker og dyr er et centralt værktøj i vurderingen af virulens faktorer regulering patogenesen af en bestemt tilstand samt at udarbejde strategier for at forebygge eller helbrede sygdomme1. Trods adskillige fordele ved at bruge dyremodeller for at studere forskellige sygdomme, opstår etiske bekymringer med hensyn til denne praksis. Forskere skal minimere brug af dyr samtidig at opnå væsentlige og valide resultater. Begrebet de 3 Rs principper (erstatte, begrænse og raffinere) blev udarbejdet for at sikre, at dyrevelfærd blev behandlet i sådanne forsøg. I kylling nekrotisk enteritis undersøgelser, der i vivo kylling modeller bruges til at undersøge ætiologi, forebyggelse og behandling af denne tilstand2,3,4,5. Patogene stammer af C. perfringens bærer specifikke virulens faktorer, såsom NetB toksin6, gives til at forårsage nekrotisk enteritis hos kyllinger7. Udskiftning princippet er derfor vanskeligt at opnå i sådanne tilfælde som disse virulens faktorer ikke kan være så kritisk i andre dyrearter. De fleste modeller for nekrotisk enteritis hos kyllinger bruger en kombination af risikofaktorer, såsom coccidiose og ændret kost for at fremkalde nekrotisk enteritis efterfulgt af sonde af bouillon kultur som indeholder store mængder af C. perfringens2. Disse modeller vil fremkalde sygdom hos et stort antal kyllinger, og dødeligheden kan være vigtigt i sådanne forsøg8, hvilket giver anledning til bekymringer om principperne om reduktion og raffinement i dyreforsøg.
Tarm sammenskrevne sløjfer modeller er et ønskeligt alternativ til studiet af sygdomme forårsaget af intestinal patogener med hensyn til princippet om reduktion og raffinement. I disse modeller, er intestinal segmenter kaldet 'loops' lavet ved at placere ligaturer langs den tarmkanal til at danne selvstændige og hermetiske rum hvor patogener kan injiceres alene9 eller med andre molekyler, som vaccine kandidater 10 , 11. patogener af interesse er placeret i tæt kontakt med de tarmcellerne og efter et par timers tid, infektion, intestinal prøver kan inddrives for yderligere analyse. Dette tillader brug af flere behandling og kontrolgrupper i samme dyr. Statistiske analyse kan udføres med gentagne foranstaltninger modeller, som øger styrken af forskelsbehandling mellem grupper og reducerer antallet af nødvendige kyllinger i forhold til oral sonde forsøg. Også, kirurgiske procedurer og efterfølgende infektion gange udføres under kontinuerlig generel anæstesi og analgesi, dermed minimere den animalske smerte. Lukket kredsløb ligations er en ideel skabelon for at reducere vært numre og skabe et mere humant system i dyreforsøg.
Tarm sammenskrevne sløjfer modeller er godt beskrevet i forskellige arter, som kalve, kaniner og mus2,9, men dårligt beskrevet i kyllinger7. For optimal udnyttelse af denne kirurgiske model er korrekt teknik og udførelse afgørende for oprettelsen af sammenskrevne intestinal loops til at undgå skader på tarm integritet. Målet med dette manuskript er at beskrive en trinvis metode til oprettelse af flere intestinal sløjfer i en kylling model. Denne teknik er begrænset af kirurgen dygtighed og erfaring, som nøjagtige procedurer er afgørende for projektets succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer med levende dyr brug blev godkendt af det etiske udvalg af Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux ").
1. overvejelser før operationen
- Vælg 10 uger gamle specifikke patogen gratis (SPF) leghorn kyllinger til kirurgi.
Bemærk: Deres vægt skal være mellem 1.0 og 1.2 kg. - Trække foder 12t før procedurer til at tømme den tarmkanal.
- Forud for operationen, placere kyllinger under generel anæstesi efter en protokol, der er kontrolleret af en anæstesilæge. Premedicate hver kylling 15 min før operationen med en intramuskulær (IM) injektion af midazolam 1 mg/kg og butorphanol 4 mg/kg. Gentager: hver 4 h, injektion af butorphanol 4 mg/kg IM eller når vejrtrækning mønster ændringer og hyppigheden stiger under anæstesi. For narkose, under alle procedurer, administrere isofluran i en koncentration på mellem 1,5 og 2,5% med en intratrakeal tube.
Bemærk: Brugen af præmedicinering til sedation og analgesi anbefales, da de bliver væsentligt forbedre dybde af anæstesi, reducere mængden af anæstetika nødvendigt under alle procedurer, samt sætte forskerne til at kontrollere smerter niveauer. - Overvåge anæstesi ved optagelse kropstemperatur, puls og elektrokardiogram (EKG), respiratorisk sats og rytme, iltmætning, udløbet kuldioxid (CO2) og neurologiske reflekser.
Bemærk: En person, der skal tildeles at overvåge disse parametre i hele alle procedurer. - Følg sterilitet principper i hele de kirurgiske procedurer. Sikre, at kirurgen og assisterende kirurg kjole med steril kjoler, handsker, en maske og beskyttende briller efter institutionelle præoperativ protokoller. Sikre, at kirurgen scrubs hænder med en klorhexidin gluconat imprægneret sterile børste op til albuen med vægt på fingernegle og hver finger overflade.
- Sterilisere de kirurgiske instrumenter med en sterilizer.
2. kirurgiske byggemodning
- For det første manuelt fjerne fjerene fra maven med en blid trækkraft.
- Skrub operationsstedet med en klorhexidin gluconat vaskemiddel imprægnerede sterile pensel. Forsigtigt krat huden fra center uden for en total kontakttid af 5 min uden at komme tilbage til centrum.
- Udføre 3 alternative passager på operationsstedet med klorhexidin gluconat løsning og isopropylalkohol ved hjælp af steril gauzes.
Bemærk: Passage skal starte fra midten af operationsstedet grænser til at undgå forurening fra de ikke-desinficeret områder til operationsstedet. - Placer den steril kirurgiske drapere på kyllingen.
3. udvinding af små tarme fra bughulen
- Incise den kirurgiske drapere med saks til at afsløre kun huden af operationsstedet.
- Incise huden ved at udføre et '' L'' figur lav-midterlinjen snit med en skalpel klinge #3.
- Start den første snit 1 cm caudale til brystbenet og Afslut det på 1 cm kranie til kloak.
- Udføre andet snit vinkelret på det første snit. Starter fra den caudale slutningen af den første indsnit og fortsætte 5 cm til venstre side af maven ved at følge linjen bækken.
Bemærk: Denne åbning vil skabe en klap, der giver mulighed for en lettere udvinding af tarmene.
- Med kirurgi saks, klippe bughinden og mavemuskler med den samme '' L'' figur mønster til at åbne i bughulen.
Bemærk: Dette vil afsløre luftsække. Tarmene er placeret nedenunder disse strukturer. Luftsække skal være fugtet med gauzes mættet med sterilt saltvand 0,85% at undgå udtørring og muligt brud under hele proceduren. - Indsæt en Snook spay krog i bughulen ved at følge den venstre bugvæggen og arbejd omkring de abdominale luftsække.
- Forsigtigt exteriorize tarmene og sprede disse på det kirurgiske område.
Bemærk: Hold tarmene fugtet af ofte sprøjtning sterilt saltvand 0,9% under hele proceduren. Også, gauzes fugtet med sterilt saltvand kan placeres på tarme at undgå udtørring. - Få fat i tarmene ved hjælp af en tør steril gaze og træk forsigtigt ud små tarme af manuel trækkraft til at udsætte jejunum.
Bemærk: Mesenteriallymfeknuderne skibe er skrøbelige og overdreven spændinger kan briste dem, hvilket kan føre til tarm iskæmiske læsioner og kraftigt kompromittere resultatet af proceduren.
4. fabrikation af Intestinal sløjfer
- Oprettelse af loop no. 1.
- Sted en enkelt ligatur med en polyglactin multifilament syntetisk resorberbar materiale i den proksimale jejunum ved at undgå ligatur af store mesenteriallymfeknuderne skibe.
- Placer en distal ligatur 2 cm fra den proksimale ligatur.
Bemærk: Simple ligaturer lavet med multifilament suture klæde er placeret langs den tarmkanal oprette hermetiske segmenter. Et skema (figur 1) beskriver placeringen af alle ligaturer. Sløjfer består af en proksimale og distale ligatur adskilt af 2 cm.
- Oprettelse af interloop no. 1.
- Sted en enkelt ligatur 0,5 cm aborally til det distale ligatur af loop no.1.
Bemærk: Mellem successive sløjfer, der er interloops på 1 cm, dvs segmenter at gøre en fysisk adskillelse mellem sløjfer. Hvis du vil sandsynligvis mindske den mulige risiko for krydskontaminering fra en løkke til en anden, er en enkelt ligatur placeret i midten interloop (0,5 cm fra den distale og proksimale ligatur af 2 tilstødende sløjfer). Dette reducerer risikoen for en eventuel rende forurenende fra en løkke til at nå ligature af et tilstødende loop. Disse segmenter er ikke obligatoriske men vil mindske risikoen for krydskontaminering.
- Sted en enkelt ligatur 0,5 cm aborally til det distale ligatur af loop no.1.
- Oprettelse af efterfølgende sløjfer og interloops.
- Gentag trin 4.1 og 4.2 at få antallet af ønskede sløjfer.
Bemærk: I dette eksperiment, 9 sløjfer og 8 interloops blev oprettet. Totallængde udgjorde 26 cm. Antallet af sløjfer kan justeres afhængigt af undersøgelsen.
- Gentag trin 4.1 og 4.2 at få antallet af ønskede sløjfer.
5. indsprøjtning af Clostridium perfringens stammer i the Loops
- Injiceres med en steril sprøjte og kanyle 26 G patogen i loop no.1. Forsigtigt indsætte nålen på den antimesenteric side af tarmen med en 45° vinkel.
Bemærk: I dette eksperiment var 0,2 mL af hjernen hjerte infusion (BHI) indeholdende 1 x 106 CFU (koloni danner enheder) af C. perfringens i midten log vækstfase injiceres i hver sløjfe. 5 forskellige stammer blev injiceret i 5 forskellige loops og de 4 resterende sløjfer blev sprøjtet med en negativ kontrol som indeholder ingen bakterier (steril BHI), skiftevis patogener og sterile BHI sløjfer. - Gentag trin 5.1 at injicere alle sløjfer.
- Forsigtigt erstatte tarm-kanalen i den dorsale område af bughulen, nedenunder luftsække.
6. lukning af bughulen
- Sutur af bughinden og mavemuskler.
- Sutur bughinden og mavemusklerne langs bækken (lavet i trin 3.3) med en enkel fortløbende sutur mønster ved hjælp af en polyglactin multifilament syntetisk resorberbar materiale.
- Sutur bughinden og mavemuskler fra brystbenet til kloak (lavet i trin 3.3. med en enkel fortløbende sutur mønster ved hjælp af en polyglactin multifilament syntetisk resorberbar materiale.
- Sutur i huden.
- Ved hjælp af en polyglactin lukke multifilament syntetisk materiale og en enkel fortløbende sutur mønster, indsnit i huden langs bækken foretaget i trin 3.2.
- Brug den samme multifilament ligatur materiale og en enkel fortløbende sutur mønster, lukke incision af hud fra brystbenet til kloak foretaget i trin 3.2.
7. konklusion
- Efter de kirurgiske procedurer, holde kylling under generel anæstesi med korrekt brug af analgetika til at minimere animalske smerter under infektion tid. Fortsætte bedøvelsesmiddel overvågning for at sikre en passende anæstesi.
- Efter tidspunktet, ønskede infektion, humant euthanize kyllingen af cervikal dislokation under fuld narkose.
Bemærk: Disse procedurer, den nødvendige tid til at fremkalde mikroskopiske læsioner med C. perfringens patogene stammer var 7 h. - Med en skalpel klinge #3, skåret en 0,5 cm til 1 cm lang sløjfe sektionen og placere den i 10% formalin til fiksering overnight og yderligere histopatologiske analyse.
- Med samme skalpel bladet, skære sektionen resterende loop og anbringes i en steril microcentrifuge tube til isolering af C. perfringens stammer i hver løkke yderligere bacteriologic analyse til deres genetiske karakteristika.
- Gentag trin 7.2 og 7.3 for alle loops ved at ændre skalpel kniv mellem hver sløjfe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af 9 intestinal sløjfer og 8 interloops er vist i figur 1. I denne model, ialt 9 sløjfer og 8 interloops er lavet med simple ligaturer. Et loop består af proksimale og distale ligaturer fordelt med 2 cm målt fra den proksimale ligatur. To tilstødende loops er adskilt af en interloop på 1 cm. For at mindske den mulige risiko for krydskontaminering mellem sløjfer af lækage fra en ligatur, placeres en interloop ligatur halvvejs fra den distale ligatur og proksimale ligatur af 2 tilstødende sløjfer. Antallet af sløjfer kan justeres afhængigt af kravene i undersøgelsen.
Figur 1: skematisk fremstilling af sammenskrevne intestinal sløjfer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2A (HPS pletten) viser den mikroskopiske udseende af en tarm løkke injiceres med en steril medium, kontrol. Den slimhinde pensel grænse er intakt og der er ingen nekrose i afsnittet. Mild overbelastning kan være til stede i de intestinale lag (slimhinden, submucosa, muscularis og serosa) af segmenterne. Figur 2B (HPS pletten) viser slimhinde nekrose 7 timer efter injektion af et patogen stamme af Clostridium perfringens inddrives fra et klinisk tilfælde af nekrotisk enteritis på en hønsefarm. Villi tips er eroderet med nekrotiske enterocytes omkring villi tips. Nekrotisk materiale omkring villi, observeres klynger af store stang-formede bakterier (pile). Disse bakterier blev yderligere identificeret som Gram-positive bakterier med en Twort pletten (ikke vist). Denne konstatering, kombineret med isolering af bakteriologi stort antal Clostridium perfringens, angiver, at læsioner var forårsaget af denne bakterie. Figur 2 c (HPS pletten) viser histologiske læsioner af en iskæmisk løkke, hvor nekrose er ikke relateret til injektion af patogene C. perfringens stammer, men resultatet af dårligt udført procedurer. Denne forstørrelse viser alvorlige koagulation nekrose, der kan mistolkes som læsioner forårsaget af Clostridium perfringens. Dog er ingen bakterier observeret i dette afsnit. Også, blodkar i muskuløs lag er alvorligt forstørrede af ophobning af store antal udarter erytrocytter (pile). Dette er vejledende af vaskulære overbelastning og i dette tilfælde overbelastning var forårsaget af sammenskrevne mesenteriallymfeknuderne blodkar. Iskæmisk sløjfer kan let identificeres makroskopisk under de kirurgiske procedurer; efter svær vaskulære overbelastning bliver serosa mørkeblå i stedet for sin normale Rosa-rødlig farve.
Figur 2: histopatologiske fund 7 h efter infektionen. (A) der er ingen nekrotiske læsioner i slimhinden på histopatologisk undersøgelse efter injektion af hjernen hjerte Infusion (BHI), en steril næringssubstratet. (B) i sløjfer injiceres med en patogene stamme af Clostridium perfringens, der markeres nekrose af slimhinden med talrige store Gram-positive stang-formede bakterier der dækker slimhinden. (C) iskæmiske læsioner kan ligne nekrotiske læsioner forårsaget af C. perfringens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I denne undersøgelse, blev sløjfer sprøjtet med enten en steril kontrol næringssubstratet (BHI) eller en af de fem forskellige stammer af Clostridium perfringens inddrives fra forskellige antibiotisk gratis kylling flokke påvirket eller ikke med nekrotisk enteritis12 . Ti høns blev anvendt i denne undersøgelse. Stammer patogenicitet kunne bestemmes baseret på evnen til at gentagne gange forårsager læsioner kompatibel med nekrotisk enteritis til slimhinden. Mens stammer fra kliniske tilfælde af nekrotisk enteritis viste evne til at forårsage slimhinde nekrose 7 h efter infektionen, stammer inddrives fra klinisk sunde kylling gårde fremkalde ikke slimhinde nekrose og slimhinden svarede til normalitet resultaterne fra de kontrol sløjfer injiceres med BHI12. Ved hjælp af talrige sløjfer i samme dyr, kan fem C. perfringens stammer og fire control sløjfer bruges i den samme fugl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarm sløjfer modeller er blevet beskrevet i adskillige arter at studere vært-patogen interaktion og patogenese af sygdomme forårsaget af forskellige intestinal patogener, såsom Clostridium perfringens, Clostridium difficile og Salmonella enterica7,9,13,14,15. Det er også blevet brugt til at analysere den slimhinde immunrespons16, effekten af antistoffer at neutralisere bakteriel toksiner udskilles af intestinal patogener11 og evaluere vaccine kandidater for at forhindre tarmsygdomme10 . Men denne model ved hjælp af talrige sammenskrevne sløjfer i en enkelt enkelte dyr er dårligt beskrevet i kyllinger og standardisering af denne teknik er obligatorisk for at opnå gyldige resultater som utilstrækkelig manipulationer kan føre til falsk resultater og fejlfortolkninger . Dette manuskript viser skabelsen af 9 successive sammenskrevne sløjfer ligger i jejunum og ileum af kylling mave-og tarmkanal. Denne undersøgelse anvendes specifikke patogen gratis (SPF) leghorn hanekyllinger vejer mellem 1,0 og 1,2 kg. Det maksimale antal sløjfer tilladt af denne race på denne vægt var 9, da 26 cm af tyndtarmen kan nemt exteriorized fra den coelomic hulrum. Det er ikke udelukket, at ved hjælp af en anden race og/eller en tungere leghorn mandlige kylling, det samlede antal loops oprettet kan være anderledes, endda højere end 9. Tarm sløjfer længde kan også ændres, men 2-cm længde blev anset for optimal at tillade prøvetagning for histopatologi og bakteriologi mens du bruger den maksimale kapacitet af de tilgængelige intestinal længde.
Tarm sammenskrevne loop teknik beskrevet i denne artikel kan være et værdifuldt alternativ til de nuværende modeller til rådighed til at studere nekrotisk enteritis hos kyllinger forårsaget af Clostridium perfringens. Ifølge resultaterne beskrevet i en tidligere artikel12, var evaluering af 5 C. perfringens stammer med 10 høns tilstrækkelige til at skelne meget virulent og commensal stammer af C. perfringens. Til sammenligning, vil andre infektion modeller bruger per os podning til at reproducere nekrotisk enteritis med C. perfringens kræver et stort antal personer til at opnå de samme resultater. I litteraturen, antallet fugle skulle evaluere virulens i C. perfringens stammer spænder fra 10 til 30 høns pr. gruppe17,18,19 til hundrede hosts pr. gruppe20. Hvad angår raffinement princippet for brug af dyr i forskning, ville være anbefales det at bruge den teknik, der kræver det laveste antal værter for at opnå væsentlige resultater. Tarm sammenskrevne loop model beskrevet i denne artikel er mest sandsynligt den model, der kræver det laveste antal kyllinger at sammenligne virulens af C. perfringens stammer.
Da krydskontaminering af lækage fra en ligatur kunne evalueres efter C. perfringens kultur og karakterisering af pulserende field gelelektroforese (PFGE) mange dage efter procedurerne, var det af yderste vigtighed at minimere dette risikoen ved at medtage 1 cm interloops, der indeholder en interloop ligatur midtvejs mellem 2 tilstødende sløjfer. Ved at tage disse forholdsregler, var det muligt at undgå en mulig krydskontaminering. Faktisk, mens patogene stammer forårsaget mikroskopiske nekrotiske læsioner overensstemmende med nekrotisk enteritis, der var ingen signifikant mikroskopiske læsioner i tilstødende sløjfer injiceres med ikke-patogene C. perfringens stammer eller BHI kultur medium negativ kontrol. Det var betegnende, at forskellige stammer sikkert kan injiceres i tilstødende intestinal sløjfer af samme kylling.
En af de mest udfordrende problemer med denne model var eksteriorisering af de små tarmene uden at kompromittere ventilation og tarm vascularization. Fugle har en forskellige åndedrætsorganerne end pattedyr. Mellemgulvet er fraværende, og ventilation styres af airsacs, tyndvæggede strukturer i bughulen. Der er 7 af disse i kyllinger og de er opdelt i den cervikale (1), forreste thorax (2), posterior thorax (2) og abdominal (2) luftsække. Disse ballon-lignende strukturer, er direkte forbundet til lungerne og giver mulighed for flytning af luft i luftvejene. Efter åbning af bughulen mellem brystbenet og kloak, abdominal airsacs er fremtrædende og tendens til at være let bristede, især hvis tør. Af denne grund er konstant befugtning med gauzes dæmpet med sterilt saltvand vigtigt at lette ordentlig ventilation og anæstesi under procedurer. Også, kan det være svært at undgå små punkteringer i den abdominal airsacs mens exteriorizing tarme ud af bughulen. Det er vigtigt at overvåge bedøvelsesmiddel parametre, såsom respirationsfrekvens og mønster, øjenlågenes reflekser, puls og kyllings bevægelser, at sikre kyllingen bliver under en passende plan for anæstesi. Små air lækage er mindre tilbøjelige til at påvirke kvaliteten af anæstesi, men denne lækage skal minimeres. Det er vigtigt at hermetisk lukker bughinden efter procedurerne. Dette vil genoprette den interne lufttryk og ventilation vil vende tilbage til normal efter dette trin. Efter lukningen af denne struktur bør der ingen luft lækager fra maven. Dette kan kontrolleres ved at sprøjte en lille mængde sterilt saltvand på suturer og kigge efter boble dannelse der angiver luft fra bughulen. Hvis dette sker, kan yderligere simple hud suturer placeres på webstedet luft lækage.
En anden teknisk udfordrende aspekt er relateret til risikoen for iskæmisk læsioner udvikle i tyndtarmen på grund af dårligt udført kirurgiske procedurer. Iskæmi sker, når der er en begrænsning af blodforsyningen til væv, forårsager en mangel på ilt og andre molekyler, der er nødvendige for cellulære metabolisme. I dette tilfælde tarmen bliver hurtigt makroskopisk mørkeblå i stedet for pink-rødlig og tarmens slimhinde cellerne vil degenerere hurtigt. Dette vil medføre iskæmisk læsioner ikke er relateret til den injicerede patogen og det vil forstyrre de histopatologiske fortolkning. To problematiske situationer kan føre til iskæmi. Først, ligatur af mesenteriallymfeknuderne skibe ved fejltagelse vil forårsage denne betingelse. Derfor er det vigtigt at se nøje på placeringen af ligaturer langs tarmkanalen at undgå herunder mesenteriallymfeknuderne skibe. Andet, iskæmi kan ske hemorrhages af den mesenteriallymfeknuderne skibe forekommer under procedurerne. Disse strukturer er tynd walled og skrøbelige. Overdreven spænding kan føre til deres brud, og mens manuelt exteriorizing tarmene, opmærksomhed bør gives til spændingerne på den mesenteriallymfeknuderne skibe at sikre deres integritet under dette trin. Også, mesenteriallymfeknuderne skibe blødning kan opstå, hvis disse er punkteret med en nål for kirurgisk sutur. Kirurgen skal se nøje på lokationen gennemboret gennem mesenterium med nålen. Blødning kan være stoppet i begge situationer, men koagulation proces vil stoppe eller nedsætte betydeligt blodgennemstrømningen til disse intestinal segmenter, dermed forårsager uoprettelige læsioner og at kompromittere gyldigheden af resultaterne.
Denne model er nyttig for studiet af vært-patogen interaktioner og patogenese af tarmsygdomme forårsaget af smitstoffer. Den model, der foreslås kan tilpasses alt efter undersøgelsen, ved at ændre antallet af loops oprettet eller ved at ændre længden på hver sløjfe. Før du implementerer sådanne ændringer, anbefales det at standardisere metode til at sikre betydelige resultater. Begrænsninger af denne teknik er skill-orienteret og kun korrekt uddannet personale skal udføre denne operation på levende dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af stolen i fjerkræ forskning (M. Boulianne) fra fakultetet for veterinærmedicin af Université de Montréal. DRs. Boulianne og overordnede udviklet modellen. DRs. Boulianne og overordnede udførte operationer. Dr. Burns bistået med at udvikle anæstesi protokol. Dr. Parent redigeret video og skrev manuskriptet. DRs Burns, Desrochers og Boulianne redigeret håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
