En samskrevet Intestinal Loop modell bedøvet bestemt patogen gratis kyllinger å studere Clostridium Perfringens virulens
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å opprette kirurgisk ‘intestinal samskrevet looper’ i kylling små tarmer. Denne prosedyren kan sammenligne flere Clostridium perfringens stammer virulens i situ i en enkelt vert. Denne metoden reduserer betydelig antall kyllinger vanligvis nødvendig for lignende i vivo eksperimenter.
Abstract
Nekrotisk enteritt ble studert i kyllinger bruker ulike i vivo infeksjon modeller. De fleste av disse bruker en kombinasjon av faktorene, som coccidiosis og kosthold, med gavage eller administrasjon via feed ved hjelp av Clostridium perfringens. Disse modellene krever sammenligning av flere C. perfringens stammene for virulens studier mange verter å få betydelige resultater. Dødelighet i løpet av studien kan være høy avhengig av eksperimentell modell, dermed heve visse etiske spørsmål om dyrevelferd i forskning. Utviklingen av nye infeksjon modeller krever færre dyr å studere patogenesen, likevel gir statistisk signifikant og gyldig resultater, er viktig å redusere dyr bruk i forskning. Intestinal samskrevet loop modeller har blitt brukt til å studere clostridial infeksjoner i ulike arter som mus, kaniner og kalver. Etter kirurgiske prosedyrer til å opprette samskrevet loop segmenter, C. perfringens stammene er injisert direkte inn looper å etablere en nær kontakt mellom bakterier og tarmen. Prøver av tynntarm og luminal innholdet er tatt ved oppsigelse av fremgangsmåten etter noen timer. Flere bakteriell stammer kan være inokulert i hvert dyr, derfor redusere antall nødvendige fag i forsøkene. Også er prosedyrer utført under narkose å redusere dyr smerte. I kyllinger, ville denne modell være mer hensiktsmessig enn peroral administrering sammenligne C. perfringens belastning virusets fordi færre dyr kreves ingen faktorene som kreves for å indusere sykdommen og pain kontrolleres av smertestillende . Intestinal samskrevet loop modellen er dårlig beskrevet i kyllinger og standardisering er avgjørende for optimal bruk. Dette manuskriptet gir alle nødvendige skritt for å opprette mange intestinal ligated looper i kyllinger og gir informasjon om kritiske punkter å oppnå gyldig resultater.
Introduction
Bruk av dyr modeller å studere smittsomme sykdommer som påvirker mennesker og dyr er et sentralt verktøy i vurderingen virulens faktorer regulere patogenesen av et bestemt vilkår samt å utdype strategier for å forebygge eller kurere sykdommer1. Til tross for mange fordeler med å bruke dyremodeller for å studere ulike sykdommer, er Etiske bekymringene om denne praksisen som oppstår. Forskere må redusere dyr bruk under henting signifikant og gyldig resultater. Begrepet 3 Rs prinsipper (Erstatt, Reduser og Forny) ble utarbeidet for å sikre at velferd var adressert i slike studier. Kylling nekrotisk enteritt studier brukes i vivo kylling modeller å undersøke den etiologi, forebygging og behandling av denne tilstanden2,3,4,5. Sykdomsfremkallende stammer av C. perfringens bærer bestemte virulens faktorer, for eksempel NetB gift6, administreres for å forårsake nekrotisk enteritt i kyllinger7. Erstatning prinsippet er derfor vanskelig å oppnå i så fall som disse virulens faktorer ikke kan være så avgjørende i andre dyrearter. De fleste modeller for nekrotisk enteritt i kyllinger bruker en kombinasjon av risikofaktorer, som coccidiosis og endret kosthold for å indusere nekrotisk enteritt etterfulgt av gavage kjøttkraft kultur som inneholder store mengder C. perfringens2. Disse modellene vil indusere sykdommen i en rekke kyllinger og dødelighet kan være viktig i slike forsøk8dermed øke bekymringer om reduksjon og raffinement prinsippene i Forsøksdyrutvalget.
Intestinal samskrevet looper modeller er et ønskelig alternativ for studier av sykdommer forårsaket av intestinal patogener med hensyn til prinsippet reduksjon, og raffinement. Disse modellene opprettes intestinal segmenter som kalles “looper” ved å plassere ligaturer langs tarmkanalen til uavhengige og hermetiske rom hvor patogener kan injiseres alene9 eller med andre molekyler, som vaksine kandidater 10 , 11. patogener av interesse er plassert nær kontakt med intestinal celler og etter noen timer infeksjon tid, intestinal prøver kan gjenopprettes for videre analyse. Dette tillater bruk av flere behandling og kontroll grupper i samme dyret. Statistisk analyse kan utføres med gjentatte measures modeller, som øker kraften til diskriminering mellom grupper og reduserer antallet nødvendige kyllinger sammenlignet muntlig gavage forsøk. Også utføres kirurgiske prosedyrer og påfølgende infeksjon ganger under kontinuerlig narkose og analgesi, derav som dyr smertene. Lukket sløyfe ligations er en ideell mal for å redusere vert tall og skape en mer human system i Forsøksdyrutvalget.
Intestinal samskrevet looper modeller er også beskrevet i ulike arter, som kalver, kanin og mus2,9, men dårlig beskrevet i kyllinger7. For optimal utnyttelse av denne kirurgiske modellen er riktig teknikk og utførelse avgjørende for etableringen av samskrevet intestinal looper å unngå skader på intestinal integritet. Målet med dette manuskriptet er å beskrive en steg for steg metoden i etableringen av flere intestinal looper i en kylling modell. Denne teknikken er begrenset av kirurgens dyktighet og erfaring, som nøyaktig prosedyrer er avgjørende for suksess for prosjektet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinal looper modeller har blitt beskrevet i mange arter å studere vert-patogen samhandling og patogenesen av sykdommer forårsaket av ulike intestinal patogener, som Clostridium perfringens, Clostridium difficile og Salmonella enterica7,9,13,14,15. Det er også brukt til å analysere mucosal immunrespons16</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av stolen i fjørfe forskning (M. Boulianne) fra Veterinary fakultet over Université de Montréal. Dr. Boulianne og overordnede utviklet modellen. Dr. Boulianne og overordnede fremført operasjoner. Dr. Burns bistått i utviklingen av anestesi-protokollen. Dr. Parent redigert video og skrev manuskriptet. DRS Burns, Desrochers og Boulianne endret manuskriptet.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal ‘loops’ provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
