Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para criar cirurgicamente 'intestinais laços ligados' no intestino de frango. Este procedimento permite a comparação de virulência em situ em um único host vários as estirpes Clostridium perfringens . Esse método marcadamente diminui o número de galinhas geralmente necessários para experimentos semelhantes na vivo .
Abstract
Enterite necrótica foi estudada em galinhas usando várias em vivo modelos de infecção. A maioria destes usa uma combinação de fatores predisponentes, tais como a dieta e coccidiose com gavagem ou administração através do feed usando o Clostridium perfringens. Nestes modelos, a comparação de várias cepas de c. perfringens para estudos de virulência requer um grande número de hosts para obter resultados significativos. Mortalidade no decorrer do estudo pode ser alta dependendo do modelo experimental, portanto, levantando preocupações éticas relativas ao bem-estar dos animal na pesquisa. O desenvolvimento de novos modelos de infecção, exigindo menos animais para estudar a patogênese, ainda, fornecer resultados estatisticamente significativos e válidos, é importante na redução do uso de animais em pesquisa. Modelos de alça intestinal ligados têm sido usados para estudar clostridial infecções em várias espécies, como ratos, coelhos e bezerros. Na sequência de procedimentos cirúrgicos para criar segmentos de laço ligados, cepas de c. perfringens são injetadas diretamente dos loops para estabelecer um contato próximo entre as bactérias e a mucosa intestinal. São retiradas amostras de intestino delgado e conteúdo luminal a finalização dos procedimentos, depois de algumas horas. Várias estirpes bacterianas podem ser inoculadas em cada animal, portanto, reduzindo o número de sujeitos necessários nos experimentos. Também, os procedimentos são realizados sob anestesia geral para reduzir a dor do animal. Em galinhas, esse modelo seria mais adequado que a administração oral para comparar a patogenicidade de cepa de c. perfringens , porque menos animais são necessários, sem fatores predisponentes são necessárias para induzir a doença e dor é controlada por analgésicos . O modelo de alça intestinal ligados é mal descrito em galinhas e padronização é essencial para optimizar a sua utilização. Este manuscrito fornece todos os passos necessários para criar inúmeros laços ligados intestinais em frangos e traz informações sobre os pontos críticos para obter resultados válidos.
Introduction
O uso de modelos animais para estudo de doenças infecciosas que afetam os seres humanos e animais é uma ferramenta central na avaliação de fatores de virulência, regulando a patogênese de uma condição específica, bem como para elaborar estratégias para prevenir ou curar doenças1. Apesar das inúmeras vantagens do uso de modelos animais para o estudo de várias doenças, estão surgindo preocupações éticas em relação a esta prática. Os pesquisadores precisam minimizar o uso de animais durante a obtenção de resultados significativos e válidos. O conceito dos 3 princípios Rs (Replace, Reduce e Refine) foi elaborado para garantir que o bem-estar questões foram tratadas em tais ensaios. Em estudos de enterite necrótica do frango, na vivo modelos de galinha são usados para investigar a etiologia, prevenção e tratamentos desta condição2,3,4,5. Cepas patogênicas de c. perfringens carregando fatores de virulência específicos, tais como a toxina NetB6, são administradas para causar enterite necrótica em galinhas7. O princípio de substituição é, portanto, difícil de conseguir neste caso como estes fatores de virulência podem não ser tão críticos em outras espécies animais. A maioria dos modelos para enterite necrótica em galinhas usam uma combinação de fatores de risco, tais como coccidiose e alteraram a dieta para induzir a enterite necrótica, seguido por gavagem do caldo de cultura que contém um grande número de c. perfringens2. Estes modelos irão induzir a doença em um grande número de galinhas, e a mortalidade pode ser importante em tais ensaios8, assim, levantando preocupações sobre os princípios de redução e refinamento em pesquisas com animais.
Modelos de laços ligados intestinal são uma alternativa desejável para o estudo de doenças induzidas por patógenos intestinais em relação à redução de princípio e refinamento. Nestes modelos, chamados 'loops' de segmentos intestinais são criados colocando ligaduras ao longo do trato intestinal formando compartimentos independentes e herméticos onde patógenos podem ser injetados sozinho9 ou com outras moléculas, tais como candidatos vacinais 10 , 11. os patógenos de interesse são colocados em contato com as células intestinais, e após algumas horas de tempo de infecção, amostras intestinais podem ser recuperadas para posterior análise. Isto permite o uso de múltiplos grupos tratamento e controle no mesmo animal. Análise estatística pode ser realizada com modelos de medidas repetidas, o que aumenta o poder de discriminação entre grupos e reduz o número de galinhas necessárias em relação aos testes de gavagem oral. Além disso, procedimentos cirúrgicos e subsequente infecção vezes são realizadas sob anestesia geral contínua e analgesia, portanto, minimizando a dor animal. Câmara de circuito fechado é um modelo ideal para reduzir o números de hosts e criando um sistema mais humano em pesquisas com animais.
Modelos de laços ligados intestinal são bem descritos em várias espécies, tais como vacas, coelhos e ratos2,9, mas mal descritos em galinhas7. Para uma utilização óptima deste modelo cirúrgico, execução e técnica adequada são essenciais para a criação de loops intestinais ligados para evitar danos à integridade intestinal. O objetivo deste manuscrito é descrever um método passo a passo na criação de vários loops intestinais em um modelo de frango. Esta técnica é limitada pela habilidade e experiência do cirurgião, como procedimentos precisos são essenciais para o sucesso do projeto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos com uso de animais vivo foram autorizados pelo Comitê de ética da faculdade de medicina veterinária, Université de Montréal (CÉUA, 'Comitê d' éthique de l'utilisation des Animaux').
1. considerações antes da cirurgia
- Selecione 10 semanas de idade patógenos específicos (SPF) Livorno galinhas livres para a cirurgia.
Nota: O seu peso deve estar entre 1,0 e 1,2 kg. - Retire a alimentação 12 h antes dos procedimentos para esvaziar o trato intestinal.
- Antes da cirurgia, coloque os frangos sob anestesia geral, seguindo um protocolo verificado por um anestesiologista. Pré-medicar cada frango 15 min antes da cirurgia com uma injeção intramuscular de (IM) de midazolam 1 mg/kg e butorfanol 4 mg/kg. Repito, todas as 4h, a injeção de butorfanol 4 mg/kg IM ou quando as mudanças de padrão de respiração e frequência aumenta durante a anestesia. Para a anestesia geral, durante todos os procedimentos, administre isoflurano em concentrações entre 1,5 e 2,5%, com um tubo endotraqueal.
Nota: O uso de pré-medicação para sedação e analgesia é recomendado como eles serão significativamente melhorar a profundidade da anestesia, reduzir a quantidade de anestésicos necessárias durante todos os procedimentos, bem como permitir aos investigadores controlar os níveis de dor. - Monitore a anestesia pela gravação da temperatura corporal, frequência cardíaca e eletrocardiograma (ECG), respiratório taxa e ritmo, saturação de oxigênio, expirada de dióxido de carbono (CO2) e reflexos neurológicos.
Nota: Uma pessoa deve ser atribuída para monitorar esses parâmetros ao longo de todos os procedimentos. - Segui princípios de esterilidade durante os procedimentos cirúrgicos. Certifique-se que o cirurgião e o cirurgião assistente vestido com batas esterilizadas, luvas, máscara e óculos de protecção, de acordo com protocolos institucionais de pré-operatório. Certifique-se de que o cirurgião esfrega as mãos com uma escova esterilizada impregnado de gluconato de clorexidina até o cotovelo com ênfase em cada superfície de dedos e unhas.
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador.
2. preparação do local cirúrgico
- Em primeiro lugar, remova manualmente as penas do abdômen com uma tração suave.
- Esfregue o local cirúrgico com um clorexidina gluconato detergente impregnados escova esterilizada. Esfregue suavemente a pele do centro para fora por um tempo de contato total de 5 min sem voltar para o centro.
- Execute 3 passagens alternativas no local da cirurgia com uma solução de gluconato de clorexidina e álcool isopropílico, usando gazes estéreis.
Nota: A passagem deve começar do centro do local cirúrgico para as bordas para evitar a contaminação das áreas não-desinfectados para o sítio cirúrgico. - Coloque a cortina cirúrgica estéril sobre o frango.
3. extração do intestino na cavidade Abdominal
- Incise a cortina cirúrgica com uma tesoura para expor somente a pele do local cirúrgico.
- Faça uma incisão na pele através da realização de uma ' L ' forma baixa-incisão com uma lâmina de bisturi #3.
- Iniciar a primeira incisão de 1 cm caudal ao esterno e terminá-la a 1 cm cranial para a cloaca.
- Realize a segunda incisão perpendicular a primeira incisão. Começar da extremidade caudal da primeira incisão e continuar a 5 cm para o lado esquerdo do abdômen, seguindo a linha da pelve.
Nota: Esta abertura criará uma aba que permite uma extração mais fácil dos intestinos.
- Com a cirurgia a tesoura, corte o peritônio e os músculos abdominais, com o mesmo padrão de forma ' L ' para abrir a cavidade abdominal.
Nota: Isto irá expor os sacos de ar. Os intestinos estão localizados por baixo destas estruturas. Sacos de ar devem ser humedecidos com gazes saturadas com estéril salina 0,85% para evitar a dessecação e possível ruptura durante o procedimento. - Inserir um Snook spay gancho na cavidade abdominal, seguindo a parede abdominal esquerda e trabalhar da maneira em torno os sacos aéreos abdominais.
- Delicadamente, exteriorize os intestinos e espalhar estas no campo cirúrgico.
Nota: Manter os intestinos umedecidos por pulverização frequentemente estéril salina 0,9% ao longo do processo. Além disso, gazes humedecidas com soro fisiológico estéril podem ser colocados nos intestinos para evitar a dessecação. - Pegue os intestinos, usando uma gaze esterilizada seca e puxe delicadamente para fora do intestino por tração manual para expor o jejuno.
Nota: Os vasos mesentéricos são frágeis e tensão excessiva pode romper-se-los pode levar a lesões isquêmicas intestinais e comprometer significativamente o resultado do procedimento.
4. fabricação de Loops Intestinal
- Criação de circuito n. º 1.
- Coloque uma ligadura simples com um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível no jejuno proximal, evitando a ligadura dos vasos mesentéricos.
- Coloque uma ligadura distal, 2 cm a ligadura proximal.
Nota: Ligaduras simples feitas com material de sutura do multifilament são colocadas ao longo do trato intestinal para criar segmentos herméticos. Uma esquema (Figura 1) descreve a localização de todas as ligaduras. Os loops consistem de uma ligadura proximal e distal, separada por 2 cm.
- Criação de interloop n. º 1.
- Coloque uma ligadura simples 0,5 cm aborally a ligadura distal de laço no. 1.
Nota: Entre loops sucessivos, existem interloops de 1 cm, ou seja, segmentos fazendo uma separação física entre os loops. Para provavelmente diminuir o risco de contaminação cruzada de um loop para outro, uma simples ligadura é colocada no meio do interloop (0,5 cm de ligadura distal e proximal de 2 loops adjacentes). Isto reduz o risco de um possível contaminante vazou de um loop para alcançar a ligadura de um loop adjacente. Esses segmentos não são obrigatórios, mas irão diminuir o risco de contaminação cruzada.
- Coloque uma ligadura simples 0,5 cm aborally a ligadura distal de laço no. 1.
- Criação de loops subsequentes e interloops.
- Repita as etapas 4.1 e 4.2 para obter o número de loops desejados.
Nota: Neste experimento, 9 loops e 8 interloops foram criados. Comprimento total ascendeu a 26 cm. O número de loops pode ser ajustado dependendo do estudo.
- Repita as etapas 4.1 e 4.2 para obter o número de loops desejados.
5. injeção de cepas de Clostridium perfringens em the Loops
- Injete com uma seringa estéril e agulha 26G o patógeno em loop no. 1. Insira cuidadosamente a agulha do lado antimesenteric do intestino em um ângulo de 45°.
Nota: Neste experimento, 0,2 mL de infusão de coração de cérebro (BHI) contendo 1 x 106 UFC (unidades formadora de Colônia), de c. perfringens em fase de crescimento log de mid foi injetado em cada loop. 5 diferentes estirpes foram injetadas em 5 loops diferentes e os 4 restantes laços foram injetados com um controlo negativo não contendo nenhuma bactéria (BHI estéril), alternando patógenos e loops BHI estéril. - Repita a etapa 5.1 para injetar todos os laços.
- Delicadamente, substitua o trato intestinal na zona dorsal da cavidade abdominal, embaixo os sacos de ar.
6. fechamento da cavidade Abdominal
- A sutura dos músculos abdominais e peritônio.
- Suture o peritônio e os músculos abdominais ao longo da pelve (feito em passo 3.3) com um padrão de sutura contínua simples usando um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível.
- Suturar o peritônio e os músculos abdominais o esterno para a cloaca (feitas na etapa 3.3. com um padrão de sutura contínua simples usando um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível.
- A sutura da pele.
- Usando um material sintético do multifilament de Poliglactina e um padrão de sutura contínua simples, feche a incisão da pele ao longo da pelve feita no passo 3.2.
- Usando o mesmo material do multifilament ligadura e um padrão de sutura contínua simples, feche a incisão da pele do esterno para a cloaca em passo 3.2.
7. conclusão
- Após os procedimentos cirúrgicos, manter o frango sob anestesia geral com uso adequado de analgésicos para minimizar a dor do animal durante o tempo de infecção. Continue a monitoração anestésica para garantir um nível adequado de anestesia.
- Após o tempo desejado infecção, humanamente euthanize a galinha por deslocamento cervical sob anestesia geral.
Nota: Para estes procedimentos, o tempo necessário para induzir lesões microscópicas com cepas patogênicas de c. perfringens foi 7 h. - Com uma lâmina de bisturi, #3, cortar um 0,5 cm para seção de longo ciclo de 1 cm e coloque-o em formol a 10% para análise durante a noite e ainda mais histopatológico de fixação.
- Com a mesma lâmina de bisturi, cortou a seção loop restantes e coloque-o em um tubo estéril microcentrifuga para o isolamento das estirpes de c. perfringens em cada análise mais bacteriológicos de loop para a sua caracterização genética.
- Repita os passos 7.2 e 7.3 para todos os loops, alterando a lâmina de bisturi entre cada loop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um esquema de 9 alças intestinais e 8 interloops é mostrado na Figura 1. Neste modelo, um total de 9 loops e 8 interloops são criados com ligaduras simples. Um ciclo consiste de ligaduras proximais e distais, espaçadas por 2 cm, medido a partir da ligadura proximal. Dois loops adjacentes são separados por um interloop de 1 cm. Para diminuir o risco de contaminação cruzada entre loops por vazamento de uma ligadura, uma ligadura interloop é colocada a meio caminho da ligadura distal e proximal ligadura de 2 loops adjacentes. O número de loops pode ser ajustado dependendo das exigências do estudo.
Figura 1: representação esquemática de loops intestinais ligados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2A (Mancha HPS) mostra a aparência microscópica de uma alça intestinal injectada com um meio estéril de controle. A borda de escova da mucosa está intacta e não há nenhum presente na seção de necrose. Leve congestão pode estar presente nas camadas intestinais (mucosa, submucosa, muscular e serosa) dos segmentos. Figura 2B (Mancha HPS) mostra necrose da mucosa 7 horas após a injeção de uma cepa patogênica de Clostridium perfringens recuperado de um caso clínico de enterite necrótica em uma granja de galinhas. Dicas de vilosidades são erodidas com enterócitos necróticos em torno das pontas de vilosidades. No material necrótico cercando as vilosidades, aglomerados de grandes bactérias bacilares são observados (setas). Estas bactérias foram mais identificadas como bactérias gram-positivas com mancha de um Twort (não mostrada). Esta constatação, combinado com o isolamento de bacteriologia de um grande número de Clostridium perfringens, indica que as lesões foram causadas por esta bactéria. Figura 2 (Mancha HPS) mostra lesões histológicas de um loop isquêmica, onde a necrose não está relacionada com a injeção de patogenicidade c. perfringens cepas, mas o resultado de mal executados procedimentos. Essa ampliação mostra necrose de coagulação grave que poderia ser interpretado como lesões causadas por Clostridium perfringens. No entanto, nenhuma bactéria é observada nesta seção. Também, os vasos sanguíneos na camada muscular são severamente dilatados pelo acúmulo de um grande número de eritrócitos degeneram (setas). Isso é indicativo de congestão vascular, e neste caso, o congestionamento foi causado por vasos mesentéricos ligados. Loops de isquemia podem ser facilmente identificadas macroscopicamente durante os procedimentos cirúrgicos; após severa congestão vascular, as membranas serosas será azul escuro em vez de sua coloração rosa-avermelhada normal.
Figura 2: infecção pós de achados histopatológicos 7 h. (A) existem sem lesões necróticas na mucosa na histopatologia após a injeção do cérebro coração infusão (BHI), um meio de cultura estéril. (B) em loops injetados com uma cepa patogênica de Clostridium perfringens, lá está marcado necrose da mucosa com inúmeros grandes bactérias gram-positivas em forma de haste cobrindo a mucosa. (C) lesões isquêmicas podem assemelhar-se lesões necróticas causadas por c. perfringens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste estudo, os laços foram injetados com um meio de cultura estéril controle (BHI) ou das cinco diferentes cepas de Clostridium perfringens recuperados de vários bandos de frango de graça aos antibióticos afetados ou não com enterite necrótica12 . Dez galinhas foram utilizadas neste estudo. Patogenicidade de cepas pode ser determinada com base na capacidade de repetidamente causam lesões compatíveis com enterite necrótica na mucosa. Enquanto estirpes recuperadas de casos clínicos de enterite necrótica, mostrou a capacidade de causar necrose da mucosa cepas de 7 h pós infecção, recuperaram de explorações agrícolas clinicamente saudáveis não induz a necrose da mucosa e da mucosa foi semelhante ao normal conclusões das malhas de controle injetadas com BHI12. Usando loops de numerosos no mesmo animal, cinco cepas de c. perfringens e quatro loops de controle podem ser usados na mesma ave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modelos de laços intestinal têm sido descritos em inúmeras espécies para estudar a interação patógeno-hospedeiro e patogénese das doenças causadas por vários patógenos intestinais, tais como o Clostridium perfringens, Clostridium difficile e Salmonella typhi7,9,13,14,15. Também tem sido usado para analisar as mucosas resposta imune16, a eficácia de anticorpos para neutralizar toxinas bacterianas excretadas pelos patógenos intestinais11 e avaliar candidatos vacinais para evitar doenças intestinais10 . No entanto, este modelo usando vários loops ligados em um único animal individual é mal descrito em galinhas e padronização da técnica é obrigatória para obter resultados válidos como manipulações inadequadas podem levar a interpretações e resultados falsos . Este manuscrito mostra a criação de 9 loops ligados sucessivas localizado no jejuno e no íleo do tracto gastro-intestinal de frango. Este estudo utilizou galinhas de masculino de Livorno patógeno específico livre (SPF) pesando entre 1,0 e 1,2 kg. O número máximo de loops permitido por esta raça com este peso tinha 9 anos, desde que 26 cm de intestino delgado pode ser facilmente exteriorized da cavidade coelomic. Não está excluído que usando outra raça e/ou um frango macho mais pesado de Livorno, o número total de loops criado pode ser diferente, nem superior a 9. Comprimento de loops intestinal também pode ser modificado, mas o comprimento de 2 cm foi considerado ideal para permitir a coleta de amostra para histopatologia e bacteriologia, enquanto estiver usando a capacidade máxima do comprimento intestinal disponível.
A técnica de alça intestinal ligados descrita neste artigo pode ser uma alternativa valiosa para os modelos atuais disponíveis para estudar a enterite necrótica em galinhas, causada por Clostridium perfringens. De acordo com os resultados descritos em um artigo anterior12, a avaliação de 5 cepas de c. perfringens 10 galinhas foi suficiente para diferenciar estirpes altamente virulentas e comensais do c. perfringens. Em comparação, outros modelos de infecção usando inoculação por sistema operacional para reproduzir enterite necrótica com c. perfringens exigirá um grande número de indivíduos para obter os mesmos resultados. Na literatura, o número de aves necessários para avaliar a virulência de c. perfringens varia de cepas de 10 para 30 frangos por grupo17,18,19 a cem hosts por grupo20. No que se refere ao princípio de refinamento para uso de animais na pesquisa, isso seria aconselhado a usar a técnica que requer o menor número de hosts para obter resultados significativos. O modelo de alça intestinal ligados descrito neste artigo é provavelmente o modelo que requer o menor número de galinhas para comparar a virulência de cepas de c. perfringens .
Desde que a contaminação por vazamento de uma ligadura pode ser avaliada somente depois de cultura de c. perfringens e caracterização por pulsada eletroforese em gel de campo (PFGE) muitos dias após os procedimentos, foi de suma importância para minimizar este risco, incluindo 1 cm interloops contendo um ligadura interloop a meio caminho entre 2 loops adjacentes. Ao tomar essas precauções, foi possível evitar uma possível contaminação. Com efeito, enquanto cepas patogênicas causaram lesões necróticas microscópicas concordantes com enterite necrótica, lá estavam sem lesões microscópicas significativas em loops adjacentes injetados com não-patogênicas cepas de c. perfringens ou o BHI cultura médio controle negativo. Isso era indicativo de que diferentes cepas podem ser injetadas com segurança em loops intestinais adjacentes da mesma galinha.
Uma das questões mais desafiadoras com este modelo foi a exteriorização do intestino sem comprometer a ventilação e vascularização intestinal. Pássaros têm um sistema respiratório diferente que mamíferos. O diafragma está ausente, e a ventilação é controlada pela airsacs, com paredes finas estruturas na cavidade abdominal. Existem 7 destes em galinhas e estão divididos no (1) cervical, torácica anterior (2), torácica posterior (2) e abdominais (2) sacos de ar. Estas estruturas de balão-como estão diretamente ligadas aos pulmões e permitam a circulação de ar no aparelho respiratório. Após a abertura da cavidade abdominal entre o esterno e a cloaca, airsacs abdominais são proeminentes e tendem a ser facilmente rompido, especialmente se a seco. Por esta razão, humidificação constante com gazes umedecido com soro fisiológico estéril é importante para facilitar a ventilação e anestesia durante os procedimentos. Além disso, pode ser difícil evitar pequenos furos no airsacs abdominal enquanto exteriorizing os intestinos fora da cavidade abdominal. É importante controlar parâmetros anestésicos, como frequência respiratória e padrão, reflexos palpebrais, frequência cardíaca e os movimentos do frango, para assegurar que o frango fique sob um plano adequado de anestesia. Pequeno vazamento de ar é menos susceptível de afectar a qualidade da anestesia, mas esse escapamento deve ser minimizado. É importante fechar hermeticamente o peritônio após os procedimentos. Isto irá restabelecer a pressão do ar interno e ventilação voltará ao normal após este passo. Após o encerramento desta estrutura, não deve haver nenhum vazamento de ar no abdômen. Isto pode ser verificado por pulverização uma pequena quantidade de solução salina estéril sobre as suturas e olhe para bolha formação indicando de ar proveniente da cavidade abdominal. Se isso acontecer, as suturas de pele simples adicionais podem ser colocadas no local de vazamento de ar.
Outro aspecto tecnicamente desafiador está relacionado com o risco de lesões isquêmicas, desenvolvendo no intestino devido a procedimentos cirúrgicos mal executados. Isquemia acontece quando há uma restrição de fornecimento de sangue para os tecidos, causando uma falta de oxigénio e outras moléculas necessárias para o metabolismo celular. Neste caso, o intestino rapidamente se tornará azul macroscopicamente escuro em vez de rosa-avermelhada, e as células da mucosa intestinais irão degenerar rapidamente. Isto causará lesões isquêmicas não relacionadas com o patógeno injetado e isso irá interferir com a interpretação histopatológica. Duas situações problemáticas podem levar a isquemia. Primeiro, ligadura dos vasos mesentéricos por inadvertência fará com esta condição. Por este motivo, é crucial olhar atentamente para a colocação das ligaduras ao longo do trato intestinal para evitar incluindo os vasos mesentéricos. Em segundo lugar, a isquemia pode acontecer se hemorragia dos vasos mesentéricos ocorrer durante os procedimentos. Estas estruturas são fina murados e frágil. Uma tensão excessiva pode levar à sua ruptura e enquanto exteriorizing manualmente os intestinos, a atenção deve ser dada à tensão sobre os vasos mesentéricos para garantir sua integridade durante esta etapa. Além disso, vasos mesentéricos hemorragia pode ocorrer se estas são perfuradas com uma agulha de sutura cirúrgica. O cirurgião deve olhar atentamente para o local que perfurou o mesentério com a agulha. Sangramento pode ser interrompido em ambas as situações, mas o processo de coagulação irá parar ou reduzir significativamente o fluxo de sangue para estes segmentos intestinais, portanto, causando lesões irreversíveis e comprometer a validade dos resultados.
Este modelo é útil para o estudo das interações patógeno-hospedeiro e patogênese de doenças intestinais causadas por agentes infecciosos. O modelo proposto pode ser adaptado dependendo do estudo, alterando o número de loops criados ou modificando o comprimento de cada loop. Antes de implementar essas alterações, é aconselhável padronizar o método para garantir resultados significativos. Limitações desta técnica são orientados a habilidade e a único pessoal adequadamente treinado deve realizar esta cirurgia em animais vivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela cadeira na pesquisa de aves de capoeira (M. Boulianne) da faculdade de medicina veterinária da Université de Montréal. Os Drs Boulianne e pai desenvolveram o modelo. Boulianne DRS e pai fez as cirurgias. Dr. Burns auxiliou no desenvolvimento do protocolo de anestesia. Dr. Parent o vídeo editado e escreveu o manuscrito. DRS Burns, Desrochers e Boulianne editado o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
