Summary
このプロトコルでは、マウスの前立腺へのウイルスの配信の新しく設立されたメソッドについて説明します。CRISPR/Cas9 の技術、遺伝子の過剰発現、Cre リコンビナーゼ配信のいずれかを使用して、技術は同所性同種遺伝子発現の変化をことができ、前立腺癌新規マウスモデルを実装します。
Abstract
前立腺がんの増加率と腫瘍の新しいドライバーまたは変調器の識別は重要です。前立腺癌の遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) は、腫瘍の不均一性とその複雑な進化ダイナミクスによって妨げています。従来の前立腺癌マウス モデルは、他の中で、生殖、条件付きノックアウト、トランスジェニック発現遺伝子、および異種移植モデル。これらのモデルのde novoの突然変異の生成は、複雑な時間のかかる、高価です。さらに、ひと前立腺癌細胞の小さなサブセットだけで孤立したイベントとして進化を知られているに対し、従来のモデルのほとんどは前立腺の上皮の大半を目標します。貴重なモデルでは、前立腺癌の開始だけでなく、高度な病気への進行をシミュレートする必要があります。
ここでウイルス粒子によって伝達細胞によって前立腺上皮で少数の細胞をターゲットにする方法をについて説明します。マウスの前立腺への組み換えウイルスの配信は、前立腺の上皮細胞での遺伝子発現の変化をことができます。ウイルスの型と量癌の開始の少数の細胞と遺伝子治療のため多くの細胞の伝達によって遺伝子の変化のための標的細胞の数を定義いたします。前葉、尿トラックから遠位部の手術に基づく注射を通してこのモデルで腫瘍を動物の尿の機能を損なうことがなく展開できます。また、前立腺上皮細胞のサブセットのみをターゲットに技術は腫瘍の栄養系拡張を有効、したがって基底膜を侵略と同様、人間の腫瘍の発生、進行を模倣します。
この手法は、生理学的な関連性の向上と強力な前立腺癌モデルを提供します。動物の苦しみは限られていると、追加の繁殖が不要なため、全体的に個体数が減少します。同時に新しい候補者の遺伝子の経路解析は加速され、効率的なより多くの費用があります。
Introduction
最後の 10 年間で、前立腺癌の発見・治療が大幅に向上します。それでも、平均寿命以下、前立腺癌の発生が増えています。症例、推定 110 万新しい世界、男性1の癌関連死の最も一般的な原因の中でです。前立腺癌は、その開発に遅いですが、予後は限られた治療の選択肢のため貧乏癌は、高度な転移状態に進んでいると。これまでに少数の遺伝子だけは、このがんの一般的なドライバーとして識別されているし、不均質性と multifocality バイオ マーカーと対象疾患ドライバー2,3の検出を阻害します。
生成 GEMMs の古典的な手法にはしばしば複雑さ、タイムリーな費用、コスト、障害します。条件付きノックアウト モデルは、胚性致死4生殖細胞で不活性化するときに発生する前立腺がんの候補者の遺伝子の研究に広く使用されています。最も一般的なモデルは、変更された Probasin5のいずれかによって駆動される前立腺特異 Cre リコンビナーゼまたは追加の交配によって、ジェム、統合されて PSA6プロモーターを含みます。これらのモデルでは興味の遺伝子は動物の尿路機能7を損なう可能性があります全体の臓器で増殖を生成する前立腺の上皮細胞の大半で対象となります。
マウス前立腺の前葉注入による Cre タンパク質のウイルスの伝達は、のみいくつかのセル8をターゲットにこの問題を解決できます。研究所の技術的な前提条件、専門知識、および目標を考慮に入れるの可能なバリエーションの広い範囲からメソッドの利点。アデノ ウイルスJunBとPten9やレンチ ウイルスPtenおよびTrp5310のターゲットをターゲットを活用した成功のアプローチは、他の中で示されています。ウイルスの構造または、ジェムなど、ルシフェラーゼの遺伝子を追加することが生物発光イメージング11を介して病気の進行の非侵襲的モニタリングとさらに有効にします。
ゲノム編集 CRISPR/Cas9 技術に基づく体ノックアウト12の急速な生成によってがんを研究する新たな機会を明らかにします。マウス前立腺の前葉にシングル ガイド Rna (sgRNAs) のウイルスの伝達は、前立腺癌のより関連する生理学的モデルを確立します。これにより、選択した突然変異を運ぶ単一のセルは膨張・侵略のことができるクローンを形成できます。さらに、複数のターゲット遺伝子の Rna ガイドの使用異なった遺伝子の変化と細胞クローンが生成されます。これは、癌の進行は、各遺伝子の改変や優性メカニズムの重要性を明らかにすることができますに腫瘍の不均一性と自然淘汰の圧力が許可されます。
遺伝子発現の変化のマウスの前立腺にウイルス粒子を配布する方法をご紹介します。小さな腹部切開によるマウスの前立腺前葉は公開され、葉にウイルス粒子を注入します。前立腺がんは 8 週間後から分析できるし、5 日間手術後、外科用クリップを皮膚から削除できます。全体的にみて、これはマウスにほとんど影響を持ってより大きい腫瘍マウスを損なうことがなく開発することができます迅速かつコスト効率の高いプロシージャです。
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Protocol
このプロトコルには、実験用マウスで手術が含まれます。すべての動物実験は、個別に審査し、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 承認する必要があります。アプローチは、動物の回復と生存率に基づいている、すべての時に適切な麻酔、疼痛管理、無菌の手術環境を確認します。手術中や麻酔から回復まで低体温症を防ぐために加熱パッドを使用します。
1. 開始の考慮事項
- 使用されるウイルス、に応じて異なる価要件が適用されます。ウイルスを適宜希釈します。
注: この例で PBS で希釈したアデノ随伴ウイルスは 1 x 1012 IU/mL の抗体価で注入されます。ウイルスは、血清型 9 でガイド RNA Ptenと Cre タンパク質ユビキチン プロモーター (図 1) の下での表現が含まれています。Ptenの損失は pAKT13前立腺腺上皮細胞の増殖を増加しました。 - 十分な前立腺開発を確保するため、手術の時に 8 週の年齢で雄マウスを使用します。
注: マウスの実験で示されている、Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ノッキン マウス c57bl/6 j バック グラウンド12 (図 1)。 - 新鮮な全身麻酔のミックスを準備し、可能であれば無菌に保つため。
注: より良い動物回復手術後、麻酔解毒剤は強くお勧めします。- 麻酔 5 mL の容量をミックスを準備するには、0.25 mL ブトルファノール (10 mg/mL)、0.4 mL (5 mg/mL)、ミダゾラム 0.15 mL 塩酸メデトミジン (1 mg/mL) 4.2 ml 滅菌生理食塩水水。
注: 制度上のアニマル ・ ケアのガイドラインに従って吸入イソフルランなどの代替の麻酔方法を使用できます。 - 塩酸メデトミジン術後の効果を反転、4.9 ml 滅菌生理食塩水水 0.1 mL アチパメゾール (5 mg/mL) をミックスします。
- 麻酔 5 mL の容量をミックスを準備するには、0.25 mL ブトルファノール (10 mg/mL)、0.4 mL (5 mg/mL)、ミダゾラム 0.15 mL 塩酸メデトミジン (1 mg/mL) 4.2 ml 滅菌生理食塩水水。
- 適切な消毒と滅菌によって無菌手術環境を準備します。使用する前に手術器具をオートクレーブ。
2. マウスの前立腺へのウイルス配信
- 1 mL の滅菌シリンジと針 27 x ½"腹腔内投与による動物を麻酔します。0.01 mL/g 体重の麻酔用量を使用します。プロシージャは 30 分以上続く、麻酔を注射することによって維持投与量の 1/3 開始の 30 分毎。
- 麻酔の深さを確認するには、筋肉の弛緩、ペダルの撤退・眼瞼反射を評価します。反射の損失が観察されるとき、動物の下腹部を剃る。
- 動物の目にかぶせて獣医眼科用軟膏角膜反射の欠如による失明を防ぐために滅菌綿棒を使用して慎重に。
- 外科領域を消毒する 70% エタノール、10% ポビドン ヨードと坊主の腹部を拭きます。外周方向へ外科領域の中心から外科領域をスクラブします。
- 滅菌手術用ハサミを使用した約 1 cm の低腹部正中線で縦皮膚切開を行います。
- 下に敷設している臓器の損傷を防ぐために細かい点の鉗子を用いた腹膜を持ち上げます。慎重に腹膜を介して手術用のはさみを使用して < 8 mm の切開を行います。
注: 齧歯動物の前立腺の人間とは対照的は 4 つの別々 の葉を装備されています。前葉は、精嚢に添付されます。 - そっと精液小胞を明らかに脇の脂肪を移動します。リング鉗子を使用して慎重に持ち上げ精液小胞, 前立腺ができるまで識別される (図 1)。
- 30 x 8 mm 針で 0.5 mL インスリン注射器を使用して、前立腺上皮で 30 μ L のウイルス (3 x 1010ウイルス粒子) ソリューションの総容積を注入します。漏れを最小限にし、小さな気泡を形成する組織内で流体を吸収します。腹腔内に戻って、精嚢を配置します。
- 13 mm、3/8 円、テーパー ポイント針と 6-0 吸収性縫合糸を用いた 2-3 簡単な中断されたステッチで腹膜を縫合します。
- 3 滅菌 4.8 x 6.5 mm クリップ腹膜を損傷しないようにピンセットで皮膚を持ち上げると皮膚を定番します。
- 良い回復のため滅菌 1 mL 注射器と針 27 x ½"を使用して腹腔内投与によって 0.01 mL/g 体重の投与量で麻酔解毒剤を適用します。慎重にその檻の中で裏では動物を配置します。
3. 手術後の手順
- 手術 1 時間加熱パッドが完全に回復するまでは低体温を防ぐために、手順の後のマウスにケージを維持します。解毒剤を適用した場合、動物は、注入後数分に目がさめているはずです。
- 適切な創傷治癒や痛みの徴候のために毎日動物を監視します。必要に応じて、制度上のアニマル ・ ケアのガイドラインに従って追加の鎮痛剤を管理します。
- 傷口が閉じられると、4-5 日後皮膚クリップを削除します。
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Representative Results
マウスの前立腺へのウイルスの配信を評価するために、手術後 3ヶ月を行なった。Rosa26-LSL-Cas9-EGFP マウス12は、ウイルスによって表現される Cre 蛋白質にさらされている細胞での GFP を表現します。前立腺のサンプルを GFP 信号 (図 2 a) の領域を識別する蛍光顕微鏡で調べた。Gfp は、前立腺の上皮がかどうか遺伝子編集が誘導されていない CRISPR ガイドによる Cre アクティビティを示します。免疫組織学的セクションは、 Pten13の喪失を示す (図 2 b)、pAKT の発現と細胞の焦点領域を示した。蛍光染色 pAKT と GFP の二重陽性細胞 (図 2) が識別されます。これはアデノ随伴ウイルスによって前立腺細胞のトランスフォーメーションを確認しました。全体的にみて、これらの結果アデノ随伴ウイルスおよび Rosa26-LSL-Cas9-EGFP マウスを使用して、前立腺上皮でin vivo CRISPR/Cas9 遺伝子編集が実行されることができることを示します。
図 1: プロシージャの図。プロシージャはプラットらによって生成される Rosa26-LSL-Cas9-EGFP マウスで実施します。12 (AP) の前方の前立腺精嚢 (SV) にアタッチされます。ガイド RNA と Cre の蛋白質を表現するウイルス粒子は、遺伝子発現を変更する前の前立腺に注入されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 同所性同種ウイルス配信を介してマウス前立腺の遺伝子の改変します。7 週齢雄 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP マウスは、 Ptenの Cre 蛋白質のためのコーディング ガイド RNA を含むアデノ随伴ウイルスを注入しました。ウイルス注入後 3 ヵ月を行なった。前方の前立腺の (A) GFP 蛍光イメージング。(B) 組織切片 (4 μ m) pAKT (ブラウン) のステンド グラスは、 Pten発現の損失とクローンの領域をマークします。破線のボックスは、高倍率に提出をマークします。(C) 蛍光染色 (緑) GFP と pAKT (赤)。核の酸は、DAPI でよごれていた。左: GFP または pAKT の信号を示さない非注入前葉の染色。右: 染色 (細胞質染色) GFP と pAKT (細胞膜局在化) の共局在を示す注入された葉。(D) Ptenflox/floxマウス Cre を発現アデノ ウイルスを注入します。H & E 染色組織切片 (4 μ m) の前葉のウイルス配信後 6 ヶ月です。点線の楕円は、ハイグレード前立腺上皮内腫瘍の領域をマークします。詳細参照9を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは前立腺癌 (図 2) のための強力な新しいマウス モデルを作成するウイルス注入によるマウス前立腺の前葉に遺伝子発現を変更する方法を説明します。アデノ ウイルスの成功の管理最初、2005年8: leow/らによって記述されていた。我々 は以前に Cre リコンビナーゼ蛋白質のアデノ ウイルス コーディングによって組織固有の削除9 (図 2 D) Cre 遺伝子の時間のかかる交配を置き換えることができます。ウイルス感染するといくつかのセル9、以来このモデルはクローン性増殖14,15の人間のシナリオを模倣し、癌研究 (図 2 b) に最適です。
CRISPR/Cas9 技術の発見は、生体内で遺伝子を編集するための新しい機会をオープンしました。コスト削減と時間効率の良い方法でこのというヘテロな癌の非常に貴重な技術を提供する今、同時に複数の遺伝子を変更することが可能です。動物モデルを用いた研究、生殖細胞のみならず成体組織遺伝子変異の生成の利点から寄与します。さらに、Cas9 発現マウスの開発は Cre sgRNAs (図 1) のウイルスの配信を許可します。ガイドは、Cas9 式なしゲノムに影響はない、このウイルスとの仕事は非危険物です。
アデノ随伴ウイルスが非常に低い免疫応答を誘導して、ウイルスは生体内でノックアウト研究16にとって望ましいは、ホストのゲノムに統合されていませんにもかかわらず、存在の年まで。このコンテキストで異なる血清型が異なる組織型の伝達効率に影響を与える可能性を注意しなければなりません。したがって、対象となる組織の最適化は高効率を達成するために重要であります。レンチ ウイルスのゲノムの統合を使用してその一方で長期的な癌遺伝子式10を許可できます。
ひと前立腺が明確な葉に分離されていません、ひと前立腺を表す最高のマウス前立腺の葉が議論されています。外側の葉を提案し、有意差が示されてない腫瘍開始9,17,18,19に関して異なる葉の間。ウイルス配信のもう一つの重要な側面は、体内の他の細胞の感染の可能性です。我々 は、導入されている前立腺間質細胞を観察しています。血管を避け、注入しながら漏れを防止する同所性同種配信処理中に、リスクを最小化できます。さらに前立腺特異的プロモーター、Probasin プロモーターと血清型などを含むウイルス デザインは細胞特異性を増加できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
氏は、デンマークの癌学会 (R146-A9394-16-S2) から奨学金によって賄われていた。MFB と MKT AUFF ノヴァ (AUFF-E-2015-FLS-9-8) によって資金を供給されました。氏と MFB 共同大学院, 健康, AU によって資金を供給されました。E.F.W. 研究所は、経済 (SAF2015 70857、共同 ERDF EU によって資金を供給) と、ERC の助成 (741888 - CSI 楽しい) を高度なスペイン語省からの補助金によってサポートされます。
リリアナ ファハルド メラー (遺伝子、開発と病気に感謝したいです。国立がん研究センター) 原稿の重要な読書のため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
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