Summary
Det här protokollet beskriver en nyligen etablerade metod för virus leverans till murina prostatan. Använder antingen CRISPR/Cas9-teknik, gen överuttryck eller Cre recombinase leverans, tekniken tillåter ortotop ändring av genuttryck och implementerar en ny musmodell för prostatacancer.
Abstract
Med en ökande incidens av prostatacancer är identifiering av nya tumör drivrutiner eller modulatorer avgörande. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) för prostatacancer hämmas av tumör heterogenitet och dess komplexa mikroevolution dynamics. Traditionella prostatacancer mus-modeller, bland andra, könsceller och villkorlig knockouts, transgena uttrycket av onkogener och xenograft-modeller. Generation av de novo -mutationer i dessa modeller är komplexa, tidskrävande och kostsamma. Dessutom rikta de flesta av traditionella modeller majoriteten av prostata epitelet, mänsklig prostatacancer är väl känt att utvecklas som en isolerad händelse i endast en liten delmängd av celler. Värdefulla modeller behöver simulera inte bara prostatacancer initiering, men också progression till avancerad sjukdom.
Här beskriver vi en metod för att rikta några celler i prostata epitlet av transducing celler av viruspartiklar. Leverans av en konstruerad virus till murina prostata tillåter ändring av genuttryck i de prostata epitel. Virustyp och kvantitet kommer härmed definiera antalet riktade celler för gen ändring av transducing några för cancer initiering och många celler för genterapi. Genom kirurgi-baserat injektion i den främre loben, distala från urinvägarna spåret, kan tumören i denna modell expandera utan att försämra funktionen urin av djuret. Dessutom genom att rikta en delmängd av prostata epitelceller tekniken möjliggör klonal expansion av tumören, och därför härmar mänskliga tumör initiering, progression, samt invasion genom basala membranet.
Denna nya teknik ger en kraftfull prostatacancer modell förbättrade fysiologiska betydelse. Djurplågeri är begränsad, och eftersom det krävs inga ytterligare avel, övergripande djur räknas minskas. Samtidigt, är analys av nya kandidatgener och vägar snabbare, vilket i sin tur är mer kostnadseffektiva.
Introduction
Upptäckt och behandling av prostatacancer har avsevärt förbättrats under det senaste decenniet. Incidensen av prostatacancer ökar fortfarande, efter förväntad livslängd. Med uppskattningsvis 1,1 miljoner nya fall i hela världen är det bland de vanligaste orsakerna till cancerrelaterad död i män 1. Prostatacancer är långsam i dess utveckling, men när cancern har utvecklats till en avancerad metastaserande stat, prognosen är dålig på grund av begränsade behandlingsalternativ. Hittills har endast ett fåtal gener har identifierats som vanliga förare i denna cancer, och dess heterogenitet och multifocality försvårar identifiering av biomarkörer och targetable sjukdom förare2,3.
Klassiska tekniker av generera GEMMs är ofta nedsatt av sin komplexitet, lägligt utgifter och kostnader. Villkorliga knockout modeller har använts att studera prostatacancer kandidatgener, som resulterar i embryonal dödlighet när inaktiverat i könsceller4. Vanligaste modellerna innebär en prostataspecifikt Cre recombinase drivs av antingen en modifierad Probasin5 eller PSA6 främjare integrerad i GEMM genom ytterligare korsning. I dessa modeller riktas genen av intresse i majoriteten av prostata epitelceller, generera hyperplasi i hela orgeln, som kan försämra djurets urinvägarna funktion7.
Viral leverans av proteinet Cre genom injektion i den främre loben av murina prostata kan lösa problemet genom att bara rikta några celler8. Hänsyn laboratorier tekniska förutsättningar, expertis och målen, metoden fördelarna från ett brett spektrum av möjliga variationer. Framgångsrika metoder utnyttja Adenovirus inriktning JunB och Pten9 eller Lentivirus inriktning Pten och Trp5310 har visats bland annat. Att lägga till transgener, såsom luciferas, den virala konstruktionen eller att GEMM kommer dessutom aktivera icke-invasiv övervakning av sjukdomsprogression via Mareld imaging11.
Gen editering baserat på tekniken CRISPR/Cas9 avslöjar en ny och snabb möjlighet att studera cancer genom snabb generering av somatiska knockouts12. Viral leverans av samma guide RNAs (sgRNAs) riktad till den främre loben av murina prostata upprättar en fysiologiskt mer relevant modell för prostatacancer. Detta sätt kan enstaka celler bär valt mutationer bildar kloner som klarar av expansion och invasion. Dessutom genererar användning av guide RNAs för flera målgener cell kloner med förändringar i olika gener. Detta gör att tumör heterogenitet och ett naturligt urval tryck på cancer progression, som kan avslöja vikten av varje gen ändring eller epistatic mekanismer.
Här presenterar vi en metod för att leverera viruspartiklar till murina prostata för ändring av genuttryck. Genom ett litet snitt för buk, den murina främre prostata loben är utsatt och viruspartiklar injiceras i LOB. Fem dagar efter kirurgi, kirurgiska klipp kan tas bort från huden och prostatic cancer kan analyseras från 8 veckor efter. Sammantaget är detta ett snabbt och kostnadseffektivt förfarande, som har liten inverkan på musen och tillåter större tumör att utveckla utan att kompromissa med musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll innebär ett kirurgiskt ingrepp i laboratoriemöss. Alla djurförsök måste individuellt granskas och godkännas av en institutionell djur vård och användning kommittén (IACUC). Som metoden bygger på djur återhämtning och överlevnad, säkerställa lämplig anestesi, smärtlindring och en aseptiska kirurgiska miljö hela tiden. Använda en värmedyna för att förhindra hypotermi under operation och tills återhämtning från anestesi.
1. Starta överväganden
- Beroende på det virus som används, kan olika titer krav gälla; Späd viruset med detta.
Obs: I det här exemplet en Adeno-associerade virus utspätt i PBS injiceras på en titer 1 x 1012 IU/mL. Viruset har serotyp 9 och innehåller guide RNA att Pten och uttryck av Cre protein under en ubiquitin promotor (figur 1). Förlust av Pten ökade pAKT och spridning av prostatahyperplasi epitel13. - Använd hanmöss vid en ålder av 8 veckor vid tidpunkten för kirurgi för att säkerställa adekvat prostata utveckling.
Obs: Möss visat i detta experiment är Rosa26-LSL-Cas9-andra knockin möss på C57BL/6J bakgrunden12 (figur 1). - Nymalen förbereda en narkos mix och om möjligt hålla den sterila.
Obs: För bättre djur återhämtning efter kirurgi, antidot anestesi rekommenderas.- För att förbereda en total volym på 5 mL bedövningsmedel, blanda 0,15 mL Medetomidin hydroklorid (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) och 0,25 mL butorfanol (10 mg/mL) med 4,2 mL steril salthaltigt vatten.
Obs: Alternativa anestesi metoder, såsom inandningsbar isofluran, kan användas enligt riktlinjerna som institutionella djurvård. - För att vända effekten av Medetomidin hydroklorid efter operationen, blanda 0,1 mL atipamezol (5 mg/mL) med 4,9 mL steril salthaltigt vatten.
- För att förbereda en total volym på 5 mL bedövningsmedel, blanda 0,15 mL Medetomidin hydroklorid (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) och 0,25 mL butorfanol (10 mg/mL) med 4,2 mL steril salthaltigt vatten.
- Förbereda en aseptiska kirurgiska miljö genom korrekt desinfektion och sterilisation. Autoklav kirurgiska instrument före användning.
2. virus-leverans till murina prostata
- Söva djuret av intraperitoneal injektion med en steril 1 mL-spruta och injektionsnål 27G x ½ ”. Använda en anestesi dos 0,01 mL/g kroppsvikt. Om förfaranden som varar längre än 30 min, underhålla anestesi genom att injicera 1/3 av start dos varje 30 min.
- Undersöka det anestetiska djupet genom att bedöma muskelavslappning, pedal tillbakadragande och palpebrala reflexer. När förlust av reflexer observeras, raka nedre delen av magen på djuret.
- Noggrant täcka djurets ögon med veterinärmedicinska oftalmologiska salva med en steril bomullspinne för att förhindra blindhet på grund av brist på hornhinnan reflex.
- Torka rakad buken med 70% etanol och 10% povidon jod att desinficera det kirurgiska området. Skrubba kirurgiska området från mitten av det kirurgiska området mot periferin.
- Utföra en vertikal huden snitt vid låg-buk mittlinjen av ca 1 cm med hjälp av en steril kirurgisk sax.
- Lyft med en fin punkt pincett för att förhindra skada de organ som lägger under bukhinnan. Noggrant gör ett < 8 mm snitt med kirurgisk sax genom bukhinnan.
Obs: Till skillnad från människa, en gnagares prostatakörteln omfattar fyra separata lober. Den främre loben bifogas seminal vesikel. - Flytta försiktigt fettvävnad undan för att avslöja seminal vesikel. Använda en ring pincett, lyft försiktigt seminal vesikel förrän främre prostatan kan identifieras (figur 1).
- Injicera en total volym av 30 µL virus (3 x 1010 viruspartiklar) lösning i främre prostata epitelet med en spruta med 0,5 mL i insulin med en 30G x 8 mm nål. Minimerar läckage och se till att vätskan absorberas i vävnaden, bildar en liten bubbla. Placera seminal vesikel tillbaka i bukhålan.
- Sutur bukhinnan med 2-3 enkla avbrutna stygn med 6-0 resorberbara suturer med en 13 mm, 3/8 cirkel och en Kona punkt nål.
- Häfta huden med 3 sterila 4.8 x 6,5 mm clips lyfta huden med pincett att undvika att skada bukhinnan.
- För bättre återhämtning, applicera anestesi motgiftet i en dos av 0,01 mL/g kroppsvikt av intraperitoneal injektion med hjälp av en steril 1 mL-spruta och injektionsnål 27G x ½ ”. Placera försiktigt animaliska baksidan i sin bur.
3. efter ingrepp
- Håll buren med möss som opererades på en värmedyna för 1 h efter ingreppet, att förhindra hypotermi tills återhämtat sig helt. Om motgiftet används, bör djuret vara vaken några minuter efter injektionen.
- Övervaka djuren dagligen för lämpliga såret läka och smärtan indikationer. Vid behov administrera ytterligare smärtstillande enligt institutionella djurvård riktlinjer.
- Ta bort huden klipp efter 4-5 dagar, när såret är stängt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma virus leverans till murina prostata, analyserades prover tre månader efter operationen. Rosa26-LSL-Cas9-andra möss12 uttrycker GFP i celler som har exponerats för Cre protein uttryckt av virus. De prostata proverna undersöktes med en fluorescensmikroskopi att identifiera områden med GFP signal (figur 2A). GFP signalen indikerar Cre aktivitet i prostata epitelet men inte om genen redigering har inducerats av CRISPR guide. Immunhistokemisk sektioner visade fokal områden av celler med hög uttryck för pAKT (figur 2B), som indikerar förlust av Pten13. Ett immunofluorescens Co färgning av pAKT och god Jordbrukarsed identifierade dubbel positiva celler (figur 2 c). Detta bekräftat omvandlingen av prostata celler av Adeno-associerade virus. Dessa resultat visar sammantaget att i vivo CRISPR/Cas9 gen redigering kan utföras i prostata epitel med hjälp av Adeno-associerade virus och Rosa26-LSL-Cas9-andra musen.
Figur 1: Illustration av förfarandet. Proceduren utförs i Rosa26-LSL-Cas9-andra musen genereras av Platt o.a. 12 främre prostatan (AP) bifogas seminal vesikel (SV). Viruspartiklar uttrycker guide RNA och ett Cre protein injiceras i främre prostatan att ändra genuttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: gen ändring i murina prostatan genom ortotop virus leverans. 7 veckor gamla manliga Rosa26-LSL-Cas9-andra möss injicerades med Adeno-associerade virus som innehåller en guide RNA för Pten och kodar för ett protein som Cre. Proverna analyserades 3 månader efter virus injektionen. (A), GFP fluorescens imaging främre prostatacancer. (B) histologiska avsnitt (4 µm) färgas för pAKT (brun) markerar området klonal förlust av Pten uttryck. En streckad ruta markerar hög förstoring arkiverat. (C) immunofluorescens färgning för god Jordbrukarsed (grön) och pAKT (röd). Nukleära syror var fläckade av DAPI. Vänster: färgning av den icke-injiceras främre loben visar ingen signal för god Jordbrukarsed eller pAKT. Höger: färgning av den injicerade loben visar samtidig lokalisering av god Jordbrukarsed (cytoplasmisk färgning) och pAKT (cellmembranet lokalisering). (D) Ptenflox/flox möss injiceras med Cre-uttryckande Adenovirus. H & E färgning av en histologisk avsnitt (4 µm) av den främre loben 6 månader efter virus leverans. Prickade ellips markerar området av höggradig prostatisk intraepitelial neoplasi. För detaljer se referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en metod för att förändra genuttryck i den främre loben av murina prostata genom virus injektion, att skapa en kraftfull ny musmodell för prostatacancer (figur 2). Framgångsrik förvaltning av ett Adenovirus beskrevs först av Leow et al. 20058. Vi har tidigare visat hur ett Adenovirus som kodar för ett protein som Cre recombinase kan ersätta tidskrävande korsning av en Cre-allelen för vävnadsspecifika radering 9 (figur 2D). Eftersom viruset infekterar några celler9, denna modell härmar mänskliga scenariot klonal expansion14,15 och är optimal för cancer studier (figur 2B).
Upptäckten av CRISPR/Cas9-teknik har öppnat nya möjligheter för i vivo gen redigering. Det är nu möjligt att ändra flera gener samtidigt, som ger en värdefull teknik för denna heterogen cancer på ett både kostnads- och tidseffektivt sätt. Forskning med hjälp av djurmodeller har fördelen att generera gen förändringar inte bara i könsceller, men också i vuxna vävnader. Dessutom tillåter utvecklingen av Cas9 uttrycker möss viral leverans av både Cre och sgRNAs (figur 1). Som guider har ingen inverkan på genomet utan Cas9 uttryck, är arbetet med detta virus ofarliga.
Adeno-associerade virus inducerar mycket låg immunsvar, och även om det är närvarande för upp till ett år, viruset integrera inte värd genomet, vilket gör det bättre för i vivo knockout studier16. I detta sammanhang måste det noteras att olika serotyper kan påverka transduktion effektivitet i olika vävnadstyper. Optimering för riktade vävnaden är därför avgörande för att uppnå hög effektivitet. Med hjälp av genomet-att integrera Lentivirus kan å andra sidan långsiktiga onkogen uttryck10.
Mänsklig prostatacancer är inte separeras i olika lober och det har diskuterats vilken av murina prostata loberna bästa representerar human prostatacancer. Medan den laterala loben föreslogs, visats ingen signifikant skillnad mellan de olika loberna med avseende på tumör inledande9,17,18,19. En annan viktig aspekt av virus leverans är möjligt infektionen av andra celler i kroppen. Vi har observerat prostata stroma celler som har varit sensorik. Risken kan minimeras under förfarandet ortotop-leverans, undvika blodkärl och att förhindra läckage medan du injicerar. Ytterligare kunde virus design inklusive en prostata specifika promotorn, såsom Probasin promotorn och serotyp, öka cell-specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Herr finansierades av ett stipendium från den danska Cancerfonden (R146-A9394-16-S2). MFB och MKT finansierades av AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Herr och MFB var medfinansieras av Graduate School, hälsa, AU. E.F.W. laboratoriet stöds genom bidrag från det spanska ministeriet för ekonomi (SAF2015-70857, medfinansieras av ERUF-EU) och ett ERC advanced grant (741888 - CSI-roligt).
Vi vill tacka Liliana Fajardo Mellor (gener, utveckling och sjukdom; National Cancer Research Center) för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
