Summary
Questo protocollo descrive un metodo neoformato per la consegna di virus alla prostata murina. Utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, sovraespressione genica o consegna di Cre ricombinasi, la tecnica permette di orthotopic alterazione dell'espressione genica e implementa nuovi modelli murini per carcinoma della prostata.
Abstract
Con una crescente incidenza di carcinoma della prostata, identificazione di nuovi driver di tumore o modulatori è fondamentale. Modelli murini geneticamente (GEMM) per carcinoma della prostata sono ostacolati dalla eterogeneità del tumore e delle sue dinamiche complesse microevoluzione. Modelli di mouse tradizionale del carcinoma della prostata includono, tra gli altri, germinale e condizionale Ko, transgenici espressione di oncogeni e di modelli di xenotrapianto. Generazione di mutazioni de novo in questi modelli è complesso, lungo e costoso. Inoltre, la maggior parte dei modelli tradizionali di destinazione la maggior parte dell'epitelio della prostata, considerando che ben nota ad evolversi come un evento isolato in solo un piccolo sottoinsieme delle cellule umane del cancro della prostata. Preziosi modelli bisogno di simulare non solo l'inizio del cancro della prostata, ma anche la progressione di malattia avanzata.
Qui descriviamo un metodo per indirizzare alcune cellule nell'epitelio della prostata di cellule di trasduzione di particelle virali. La consegna di un virus artificiale alla prostata murina consente l'alterazione dell'espressione genica negli epiteli della prostata. Quantità e tipo di virus definirà dichiara il numero delle cellule mirati per alterazione del gene di trasdurre poche cellule per l'inizio del cancro e molte cellule per la terapia genica. Attraverso iniezione a base di chirurgia nel lobo anteriore, distale dal tratto urinario, il tumore in questo modello può espandersi senza alterare la funzione urinaria dell'animale. Inoltre, prendendo di mira solo un sottoinsieme delle cellule epiteliali della prostata la tecnica consente l'espansione clonale del tumore e quindi imita l'inizio del tumore umano, progressione, come pure invasione attraverso la membrana basale.
Questa tecnica novella fornisce un modello potente del cancro della prostata con maggiore rilevanza fisiologica. Sofferenza animale è limitata, e poiché nessun allevamento aggiuntivo è richiesto, conteggio nel complesso animale è ridotto. Allo stesso tempo, analisi di nuovi geni candidati e pathways sono accelerato, che a sua volta è più conveniente.
Introduction
Rilevamento e trattamento di carcinoma della prostata hanno migliorato significativamente nell'ultimo decennio. Ancora, l'incidenza di carcinoma della prostata è in aumento, a seguito di aspettativa di vita. Con 1,1 milioni nuovi casi stimati in tutto il mondo, è tra le cause più comuni di morte per cancro in uomini 1. Carcinoma della prostata è lento nel suo sviluppo, ma quando il tumore è progredito ad uno stato metastatico avanzato, la prognosi è sfavorevole a causa di limitate opzioni di trattamento. Finora, solo pochi geni sono stati identificati come driver comuni in questo tipo di tumore, e ostacola la sua eterogeneità e la multifocalità rilevazione di biomarcatori e indirizzabile malattia driver2,3.
Tecniche classiche di generazione GEMM sono spesso alterati dalla loro complessità, tempestive spese e costi. Modelli di knockout condizionale sono stati ampiamente usati per lo studio di geni candidati di carcinoma della prostata, che si traducono in mortalità embrionale quando inattivato in germline4. Modelli più comuni coinvolgono un ricombinasi Cre di prostatico specifico guidato da uno un probasina modificato5 o un promotore PSA6 integrato nella GEMM da ulteriori incroci. In questi modelli, il gene di interesse sarà mirato nella maggior parte delle cellule epiteliali della prostata, generando l'iperplasia nell'intero organo, che può compromettere apparato urinario funzione7 dell'animale.
Consegna virale della proteina Cre tramite iniezione nel lobo anteriore della prostata murina può risolvere il problema prendendo di mira solo poche cellule8. Prerequisiti tecnici laboratori, competenze e obiettivi tenendo conto, i benefici di metodo da una vasta gamma di possibili variazioni. Approcci di successo utilizzando Adenovirus targeting JunB e Pten9 o Lentivirus targeting Pten e Trp5310 sono stati indicati tra gli altri. L'aggiunta di transgeni, quali luciferasi, il costrutto virale o la GEMM permetterà inoltre monitoraggio non invasivo della progressione della malattia tramite bioluminescenza11di imaging.
L'editing genomico basato sulla tecnologia CRISPR/Cas9 rivela una nuova e rapida possibilità di studiare cancro attraverso la rapida generazione di Knockout somatico12. Consegna virale del RNA guida singola (sgRNAs) diretto al lobo anteriore della prostata murino stabilisce un modello fisiologicamente più rilevante di carcinoma della prostata. Con questo mezzo, singole cellule portatrici di mutazioni selezionate possono formare cloni che sono in grado di espansione e di invasione. Inoltre, uso di guida RNAs per più geni bersaglio genererà cloni delle cellule con alterazioni in geni differenti. Ciò consentirà eterogeneità del tumore e una pressione di selezione naturale sulla progressione del cancro, che può rivelare l'importanza di ogni alterazione genica o meccanismi epistatiche.
Qui presentiamo un metodo per fornire le particelle virali alla prostata murina per alterazione dell'espressione genica. Da una piccola incisione addominale, murino lobo anteriore della prostata è esposta e le particelle virali sono iniettate nel lobo. Cinque giorni dopo l'intervento, chirurgico clip possono essere rimossi dalla pelle e il cancro prostatico può essere analizzato da 8 settimane dopo. Nel complesso, questa è una procedura rapida ed economica, che ha poco impatto sul mouse e permette più grande tumore a sviluppare senza compromettere il mouse.
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Protocol
Questo protocollo comporta una procedura chirurgica nei topi di laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere individualmente esaminati e approvati da un istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC). Come l'approccio si basa sulla sopravvivenza e il recupero degli animali, garantire adeguata anestesia, gestione del dolore e ambiente chirurgico asettico a tutto il tempo. Utilizzare una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia durante la chirurgia e fino al recupero dall'anestesia.
1. considerazioni di partenza
- A seconda del virus utilizzato, possono essere applicati diversi titolo requisiti; diluire il virus di conseguenza.
Nota: In questo esempio, un virus Adeno-associato, diluito in PBS viene iniettato ad un titolo di 1 x 1012 UI/mL. Il virus ha sierotipo 9 e contiene RNA Guida di Pten e l'espressione della proteina Cre sotto un promotore di ubiquitin (Figura 1). Perdita di Pten aumentata pAKT e proliferazione dell' epitelio prostatico13. - Utilizzare il topo maschio ad un'età di 8 settimane al momento della chirurgia per garantire l'adeguato sviluppo della prostata.
Nota: Illustrati in questo esperimento i topi sono topi knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP su C57BL/6J sfondo12 (Figura 1). - Appena preparare un mix di anestesia generale e se possibile mantenerlo sterile.
Nota: Per recupero animali meglio dopo l'intervento chirurgico, un antidoto di anestesia è altamente raccomandato.- Per preparare un volume totale di 5 mL di anestetico, mescolare 0,15 mL medetomidina cloridrato (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) e butorfanolo 0,25 mL (10 mg/mL) con 4,2 mL di acqua salina sterile.
Nota: I metodi di anestesia Alternative, ad esempio inalabile isoflurano, possono essere utilizzati secondo le linee guida istituzionali cura degli animali. - Per invertire l'effetto della medetomidina cloridrato post-chirurgia, mescolare atipamezolo 0,1 mL (5 mg/mL) con 4,9 mL acqua salina sterile.
- Per preparare un volume totale di 5 mL di anestetico, mescolare 0,15 mL medetomidina cloridrato (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) e butorfanolo 0,25 mL (10 mg/mL) con 4,2 mL di acqua salina sterile.
- Preparare un ambiente asettico chirurgico corretta disinfezione e sterilizzazione. Strumenti chirurgici autoclave prima dell'uso.
2. virus-consegna alla prostata murina
- Anestetizzare l'animale tramite l'iniezione intraperitoneale con una siringa sterile da 1 mL e un ago 27 x ½". Utilizzare una dose di anestesia di peso corporeo 0,01 mL/g. Se la procedura dura più di 30 min, mantenere l'anestesia iniettando 1/3 di partenza della dose ogni 30 min.
- Esaminare la profondità anestetica valutando il rilassamento del muscolo, pedale ritiro e riflessi palpebrali. Quando si osserva la perdita dei riflessi, radere il basso addome dell'animale.
- Coprire con attenzione gli occhi dell'animale con veterinario unguento oftalmico utilizzando un tampone di cotone sterile per prevenire la cecità dovuta alla mancanza di riflesso corneale.
- Pulire l'addome rasato con 70% di etanolo e il 10% di povidone iodio per disinfettare l'area chirurgica. Strofinare l'area chirurgica dal centro della zona chirurgica verso la periferia.
- Eseguire un'incisione cutanea verticale al midline basso-addominale di circa 1 cm, utilizzando una forbice chirurgica sterile.
- Sollevare il peritoneo utilizzando una pinza a punta fine per evitare di danneggiare gli organi che gettano sotto. Attentamente e fare un'incisione di < 8mm utilizzando forbici chirurgiche attraverso il peritoneo.
Nota: A differenza di umani, ghiandola di prostata di un roditore comprende quattro lobi separati. Il lobo anteriore è fissato alla vescichetta seminale. - Spostare delicatamente il tessuto adiposo da parte di scoprire la vescichetta seminale. Utilizzando una pinza anello, sollevare attentamente la vescichetta seminale fino a quando la prostata anteriore può essere identificato (Figura 1).
- Iniettare un volume totale di 30 µ l di soluzione di virus (3 x 1010 particelle virali) nell'epitelio della prostata anteriore utilizzando una siringa da insulina 0,5 mL con ago 30 x 8 mm. Ridurre al minimo perdite e assicurare che il liquido viene assorbito all'interno del tessuto, formando una piccola bolla. Posizionare la vescicola seminale indietro nella cavità addominale.
- Suturare il peritoneo con 2-3 semplici punti interrotti utilizzando suture assorbibili 6-0 con un 13 mm, 3/8 cerchio e un ago a punta conica.
- Fiocco la pelle con 3 clip sterile 4.8 x 6.5 mm, sollevare la pelle con pinze per evitare di danneggiare il peritoneo.
- Per il migliore recupero, è necessario applicare l'antidoto di anestesia in una dose del peso corporeo 0,01 mL/g tramite l'iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa sterile da 1 mL e un ago 27 x ½". Posizionare delicatamente il retro degli animali nella sua gabbia.
3. post-chirurgia
- Mantenere la gabbia con i topi che hanno subito la chirurgia su un rilievo di riscaldamento per 1 h dopo la procedura, per prevenire l'ipotermia fino a completamente recuperato. Se viene applicato l'antidoto, l'animale dovrebbe essere sveglio pochi minuti dopo l'iniezione.
- Monitorare gli animali ogni giorno per indicazioni di dolore e guarigione di appropriata della ferita. Se necessario, somministrare antidolorifici aggiuntive secondo le linee guida istituzionali cura degli animali.
- Rimuovere le graffe di pelle dopo 4-5 giorni, una volta che la ferita è chiusa.
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Representative Results
Per valutare la consegna di virus alla prostata murina, i campioni sono stati analizzati tre mesi dopo l'intervento chirurgico. Il Rosa26-LSL-Cas9-EGFP topi12 esprimono GFP in cellule che sono stati esposti alla proteina Cre espressa dal virus. I campioni della prostata sono stati esaminati con un microscopio a fluorescenza per identificare le aree con segnale GFP (Figura 2A). Il segnale GFP indica l'attività del Cre in epitelio prostatico ma non se gene editing è stata indotta dalla guida CRISPR. Sezioni di Immunohistochemical ha mostrato zone focali delle cellule con alta espressione di pAKT (Figura 2B), che indica perdita di Pten13. Un co-immunofluorescenza di pAKT e GFP identificato cellule positive doppie (Figura 2). Questo ha confermato la trasformazione delle cellule prostatiche dal virus Adeno-associato. Nel complesso, questi risultati indicano che in vivo CRISPR/Cas9 gene editing possono essere eseguite nell'epitelio della prostata utilizzando il virus Adeno-associato e il mouse Rosa26-LSL-Cas9-EGFP.
Figura 1: illustrazione della procedura. La procedura è eseguita nel topo Rosa26-LSL-Cas9-EGFP generato da Platt et al. 12 la prostata anteriore (AP) è attaccata alla vescichetta seminale (SV). Esprimendo la guida RNA e una proteina Cre le particelle del virus sono iniettate nella prostata anteriore per alterare l'espressione genica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: alterazione del Gene nella prostata murina attraverso la consegna di virus ortotopico. 7-settimana-vecchio maschio Rosa26-LSL-Cas9-EGFP topi sono stati iniettati con virus Adeno-associato contenente una guida RNA per Pten che codifica per una proteina Cre. I campioni sono stati analizzati 3 mesi dopo l'iniezione di virus. (A) GFP imaging di fluorescenza della prostata anteriore. (B) sezione istologica (4 µm) colorati per pAKT (marrone) segna l'area clonale con perdita di espressione di Pten . La casella tratteggiata segna l'alto ingrandimento archiviato. (C) immunofluorescenza che macchia per GFP (verde) e pAKT (rosso). Acidi nucleari erano macchiati con DAPI. A sinistra: la macchiatura del lobo anteriore iniettato non mostrando nessun segnale per GFP o pAKT. A destra: la macchiatura del lobo iniettato risultati co-localizzazione di GFP (colorazione citoplasmatica) e pAKT (localizzazione della membrana delle cellule). (D) Ptenflox/flox topi iniettati con l'Adenovirus che esprimono Cre. H & E colorazione di una sezione istologica (4 µm) del lobo anteriore 6 mesi dopo la consegna di virus. Ellisse punteggiato segna l'area di neoplasia intraepiteliale prostatica dell'alto grado. Per ulteriori informazioni vedere riferimento 9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, descriviamo un metodo per alterare l'espressione genica nel lobo anteriore della prostata murina mediante iniezione di virus, creando un potente nuovo modello murino per carcinoma della prostata (Figura 2). La riuscita amministrazione di un Adenovirus in primo luogo è stato descritto da Leow et al. 20058. Precedentemente abbiamo indicato come un Adenovirus che codifica per una proteina di ricombinasi Cre può sostituire richiede tempo incroci di un allele di Cre per tessuto-specifica eliminazione 9 (Figura 2D). Poiché il virus infetta alcune cellule9, questo modello imita lo scenario umano di espansione clonale14,15 ed è ottimo per gli studi del cancro (Figura 2B).
La scoperta della tecnologia CRISPR/Cas9 ha aperto nuove opportunità per l'editing di gene in vivo . Ora è possibile modificare i geni multipli simultaneamente, fornendo una tecnica molto importante per questo tipo di tumore eterogeneo in maniera sia risparmio di costi e tempo efficiente. Ricerca utilizzando modelli animali gode il vantaggio di generare alterazioni del gene non solo nella linea germinale, ma anche nei tessuti adulti. Inoltre, lo sviluppo dei topi esprimenti Cas9 permette virale consegna del Cre e sgRNAs (Figura 1). Come le guide non hanno alcun impatto sul genoma senza espressione Cas9, il lavoro con questo virus è non pericoloso.
Virus adeno-associato di indurre risposte immunitarie molto basse, e anche se presente per fino ad un anno, il virus non si integra nel genoma ospite, che lo rende preferibile per in vivo studi knockout16. In questo contesto, si deve constatare che diversi sierotipi possono influenzare l'efficienza di trasduzione in tipi di tessuto distinti. Pertanto, ottimizzazione per il tessuto bersaglio è fondamentale per ottenere alta efficienza. Utilizzando l'integrazione di genoma Lentivirus, d'altra parte può consentire a lungo termine di espressione dell'oncogene10.
La prostata umana non è separata nei lobi distinti e si è discusso che i lobi della prostata murini migliori rappresenta la prostata umana. Mentre il lobo laterale è stato proposto, nessuna differenza significativa è stata indicata fra i lobi diversi rispetto al tumore iniziazione9,17,18,19. Un altro aspetto critico della consegna virus è la possibile infezione di altre cellule nel corpo. Abbiamo osservato le cellule dello stroma della prostata che sono state trasdotte. Il rischio può essere minimizzato durante la procedura di consegna di orthotopic, evitando i vasi sanguigni e prevenire perdite durante l'iniezione. Progettazione di virus compreso un promotore specifico della prostata, come il promotore probasina e sierotipo, potrebbe aumentare ulteriormente la cella-specificità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
MR è stato finanziato da una borsa di studio dalla Danish cancer society (R146-A9394-16-S2). MFB e MKT sono stati finanziati da AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). MR e MFB sono stati co-finanziati dalla Graduate School, salute, AU. Il laboratorio E.F.W. è supportato da sovvenzioni dal Ministero spagnolo dell'economia (SAF2015-70857, co-finanziato dal FESR-UE) e un ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Vogliamo ringraziare Liliana Fajardo Mellor (geni, lo sviluppo e la malattia; National Cancer Research Center) per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
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