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Immunology and Infection

Vivo में मानव टी सेल याद प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक चूषण छाला प्रोटोकॉल

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57554
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1, 2,3, 1, 4, 1
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

Summary

यहाँ, हम सक्शन छाला त्वचा का एक प्रदर्शन मॉडल प्रदान करते हैं । मॉडल एक सरल का उपयोग करने के लिए vivo अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में मानव अध्ययन की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए टीके के विकास के संदर्भ में.

Abstract

त्वचा के ऊपर प्रतिजन-याद मॉडल vivo मेंमानव स्मृति प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । जब त्वचा चूषण छाला के साथ संयुक्त (SB) प्रेरण, इस मॉडल की दुर्लभ आबादी के लिए पहुँच प्रदान करता है प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं सेलुलर स्मृति प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीटू मेंcytokine microenvironment.

यह रिपोर्ट एक चमड़े का एक याद, एक SB प्रेरण, और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की फसल की व्यावहारिक प्रक्रिया का वर्णन है । विधि उदाहरण देना करने के लिए, ट्यूबरकुलिन त्वचा परीक्षण के व्यक्तियों, जो इस अध्ययन से पहले में प्रतिजनी याद के लिए प्रयोग किया जाता है, Guérin तपेदिक के साथ एक संक्रमण के खिलाफ एक बैसिलस Calmette-माइकोबैक्टीरियम टीकाकरण से गुजरा । अंत में, मल्टीप्लेक्स और SB नमूनों के प्रवाह cytometric विश्लेषण के उदाहरण प्रदान की जाती हैं, प्रतिजन-विशिष्ट polyfunctional CD4 + टी कोशिकाओं के उच्च भागों के illustrating इस नमूना विधि द्वारा उपलब्ध कोशिकाओं के साथ तुलना में रक्त से अलग ।

विधि यहां वर्णित सुरक्षित और ंयूनतम इनवेसिव है, एक अनूठा को vivo मेंदोनों जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है, और शोधकर्ताओं सेल के साथ काम कर रहे एक व्यापक समुदाय के लिए लाभप्रद हो सकता है मध्यस्थता प्रतिरक्षा और मानव स्मृति प्रतिक्रियाओं, टीके के विकास के संदर्भ में ।

Introduction

एक त्वचा SB एक कृत्रिम रूप से प्रेरित छाला है, जो कोशिकाओं और तरल पदार्थ की फसल के लिए सीधे त्वचा से अनुमति देता है । वैक्यूम द्वारा SBs स्थापना की तकनीक स्वास्थ्य और रोग में त्वचा इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया त् वचा के क्षेत्र के भीतर एक प्रसिद्ध उपकरण है1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. इस रिपोर्ट को प्रदर्शित करता है कि कैसे sb तकनीक के साथ संयुक्त त्वचा संबंधी प्रतिजनी याद (sb त्वचा याद विधि) vivo मेंअनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

SB प्रेरण के पीछे सिद्धांत सरल है: एक प्रकाश निर्वात त्वचा के एक छोटे से क्षेत्र के लिए लागू किया जाता है । नकारात्मक दबाव अंततः एपिडर्मिस को dermis से अलग करने के लिए बाध्य करेगा, एक स्थानीय तरल पदार्थ और कोशिकाओं1,2,9से भरा छाला बनाने । छाला तरल पदार्थ एक ठीक सुई आकांक्षा द्वारा काटा जा सकता है और सामग्री आगे के अध्ययन के लिए इन विट्रो मेंइस्तेमाल किया जा सकता है ।

हाल के वर्षों में, वहां के अध्ययन के लिए SB विधि में एक बढ़ती हुई रुचि है vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अलावा अंय रोगों त्वचा के लिए प्रतिबंधित10,11। मानव में अनुकूली उन्मुक्ति के अध्ययन तथ्य यह है कि कोशिकाओं और साइटोकिंस ब्याज की परिधीय रक्त से नमूना है क्योंकि लिम्फ नोड या जठरांत्र श्लैष्मिक ऊतक के एक इनवेसिव नमूना अस्वीकार्य और अनैतिक हो सकता है द्वारा सीमित है । एक उदाहरण टीकाकरण12के बाद लंबे समय तक मानव स्मृति टी-सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन है । इस तरह के परीक्षणों में, प्रासंगिक टी कोशिकाओं के नमूने एक बड़ी चुनौती हो सकती है, क्योंकि कोशिकाओं की प्रासंगिक आबादी है कि प्रतिरक्षा मध्यस्थता लसीकावत् ऊतक में रहता है, और केवल विशिष्ट टी की एक बहुत सीमित संख्या-कोशिकाओं परिधीय रक्त में प्रसारित.

SB तकनीक स्मृति टी कोशिकाओं और अंय विशिष्ट कोशिका आबादी के अध्ययन के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है । प्रतिजन के चमड़े के नीचे टीका के बाद, टी कोशिकाओं प्रतिजन के लिए विशिष्ट उनके लसीकावत् hideaways से त्वचा के लिए भर्ती कर रहे हैं और आसानी से SB से नमूना लिया जा सकता है । इस त्वचा विज्ञान याद मॉडल की कार्यप्रणाली और अनुसंधान अनुप्रयोगों अकबर एट अल द्वारा वर्णित किया गया । में २०१३2. एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया प्रतिजन त्वचा याद के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध प्रोटीन व्युत्पंन (पीपीडी) आइसोलेटों के लिए एक ट्यूबरकुलिन त्वचा परीक्षण (TST)13है, जहां पीपीडी त्वचा के चमड़े का परत में इंजेक्ट किया जाता है प्रदर्शन करते थे । पीपीडी के प्रति एक मौजूदा प्रतिरक्षा स्मृति के साथ व्यक्तियों में [जैसे, एक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) संक्रमण या एक पूर्व बैसिलस Calmette-Guérin (बीसीजी) टीकाकरण के साथ व्यक्तियों], प्रतिजन जमाव एक में परिणाम त्वचा के लिए प्रवास के साथ प्रतिक्रिया याद और vivo में पीपीडी-विशिष्ट CD4 + टी कोशिकाओं2,11,14,15के क्लोनल विस्तार । नतीजतन, पीपीडी-विशिष्ट polyfunctional CD4 + टी कोशिकाओं के उच्च भागों SB नमूने के लिए तैयार त्वचा में जमा । टी-इस विधि द्वारा एकत्र की कोशिकाओं को मजबूत साबित किया है और पर्याप्त प्रचुर मात्रा में immunoassays की एक सीमा के द्वारा और एक दीर्घकालिक द्वारा विशेषता हो सकता है इन विट्रो संस्कृति15। इस प्रकार, त्वचा के नीचे की ओर याद मॉडल और SB प्रेरण vivo टी में अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान विधि साबित हो सकता है, पूर्व vivo विश्लेषण द्वारा सेल प्रतिक्रियाओं, और इस दृष्टिकोण की वृद्धि हुई ज्ञान सेलुलर इम्यूनोलॉजी में हितों के साथ शोधकर्ताओं को लाभ हो सकता है और vaccinology ।

यह रिपोर्ट कैसे पीपीडी-इंजेक्शन त्वचा में मानव त्वचा चूषण फफोले प्रेरित करने के लिए पर पहली stepwise गाइड प्रदान करता है । त्वचा के ऊपर प्रतिजन याद मॉडल बीसीजी-टीका लगाए स्वयंसेवकों में TST का उपयोग कर प्रदर्शन किया है । अंत में, संबंधित पूर्व की कोशिकाओं और साइटोकिंस SB द्वारा पृथक की गई vivo विश्लेषण उदाहरण है। SB विधि द्वारा प्राप्त पीपीडी-विशिष्ट टी-कोशिकाओं के Phenotypical और कार्यात्मक विशेषताओं को पूरी तरह से2,10,11,16,17, और कहीं वर्णित हैं 18 , 19. इस रिपोर्ट का उद्देश्य अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा इस तकनीक के आवेदन को सुगम बनाने के लिए कार्यप्रणाली के व्यावहारिक एवं प्रतिरक्षा पहलुओं पर चर्चा करना है.

Protocol

मानव स्वयंसेवकों के उपयोग सहित नीचे वर्णित सभी तरीकों, स्वास्थ्य अनुसंधान नैतिकता (एच-१५००२९८८) और डेनिश डेटा संरक्षण एजेंसी (jr.nr. 2015-57-0102) पर डेनिश समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । पीपीडी एक प्रमाणित उत्पाद मानव उपयोग के लिए अनुमोदित होना चाहिए और निर्माता द्वारा प्रदान की सही खुराक के भीतर प्रशासित । खुराक या प्रशासन में किसी भी विचलन अतिरिक्त नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है और स्वयंसेवकों सूचित सहमति देना चाहिए.

1. ट्यूबरकुलिन त्वचा परीक्षण

  1. स्वयंसेवक से मौखिक और लिखित सूचित सहमति प्राप्त करें । इंजेक्शन से पहले, सुनिश्चित करें कि स्वयंसेवक समझता है और संभव प्रतिकूल प्रभाव सहित प्रक्रिया को स्वीकार करता है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट समावेशन मानदंड आयु > 18 वर्ष और एक प्रलेखित बीसीजी टीकाकरण है । समावेशन मानदंड अनुसंधान प्रश्न के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (यानी, एक अतिरिक्त समावेशन मापदंड सकारात्मक TST का सबूत हो सकता है).
  2. मानव उपयोग के लिए पीपीडी के तैयार समाधान का उपयोग [20 ट्यूबरकुलिन यूनिट (TU)/mL] । एक शराब झाड़ू का उपयोग कर एक शीशी के रबर टोपी को संक्रमित ।
  3. इंजेक्शन साइट तैयार
    1. स्वयंसेवक की प्रकोष्ठ के ventral ओर इंजेक्शन साइट का पता लगाएँ ।
    2. एक सादे सतह पर हाथ पाम-अप प्लेस और बांह की हथेली के ऊपरी तीसरे पर एक क्षेत्र का चयन, कोहनी संयुक्त से लगभग 5-10 सेमी । निशान, नसों, या क्षतिग्रस्त त्वचा के स्पष्ट रहो ।
    3. एक शराबी झाड़ू का उपयोग कर क्षेत्र को संक्रमित ।
  4. पीपीडी-समाधान तैयार करें
    1. एक 27-30G/कम (जैसे, 12 मिमी) तय सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का प्रयोग करें ।
    2. धीरे मिश्रण और आकांक्षा पीपीडी समाधान के ०.१ मिलीलीटर । सुनिश्चित करें कि कोई दृश्यमान बुलबुले हैं ।
  5. Intradermal पीपीडी इंजेक्शन
    नोट: यह चरण एक एकल पीपीडी जमाव करने के लिए कैसे का वर्णन करता है, लेकिन एक ही बांह में पीपीडी के एकाधिक जमाव संभव है । हालांकि, यह विशिष्ट नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है ।
    1. त्वचा को खिंचाव और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ बेवल के साथ त्वचा के लिए एक 5-15 ° कोण पर सुई बिंदु ।
    2. त्वचा की चमड़े की परत में सुई की नोक डालें और सुनिश्चित करें कि टिप लगभग एपिडर्मिस के माध्यम से दिखाई दे रहा है ।
    3. धीरे पीपीडी समाधान के ०.१ मिलीलीटर सुई ।
      नोट: यदि सही ढंग से प्रशासित, 6-10 mm का एक पीला papule तुरंत दिखाई देगा । papule लगभग 10 मिनट के बाद गायब हो जाता है ।
    4. जब दो या अधिक जमाव बनाने, इंजेक्शन साइटों की एक अधिकतम जुदाई (5-10 सेमी) के लिए उद्देश्य है, जबकि कोहनी और कलाई क्षेत्र से एक अच्छी दूरी में रखते हुए ।
      नोट: यह त्वचा परीक्षण प्रतिक्रिया के एक संभावित संगम रोकता है और दो सक्शन चैंबर की निर्बाध स्थिति की अनुमति देता है ।

2. त्वचा की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन-3 दिवस

  1. ४८-७२ h के बाद, त्वचा की प्रतिक्रिया के आकार पर ध्यान दें । इस अवधि को मापने (सूजन) और नहीं पर्विल (लालिमा) प्रतिक्रिया की ।
  2. टटोलना कठिन उंगलियों का उपयोग कर सूजन और फिर एक बॉलपेन पेन का उपयोग कर अवधि के किनारों निशान । एक शासक का उपयोग करने के लिए उंचे व्यास को मापने और मिमी में परिणाम नोट ।
    नोट: अवधि के आकार के पढ़ने सक्शन चैंबर के लिए छिद्र व्यास के विकल्प का मार्गदर्शन कर सकते हैं ।

3. सक्शन छाला प्रेरण-7 दिवस

  1. सक्शन डिवाइस इकाई को इकट्ठा ।
    नोट: सक्शन डिवाइस इकाइयों सक्शन छाला प्रेरण के लिए संलग्न कक्षों के साथ वैक्यूम पंप हैं । इस प्रदर्शन में इस्तेमाल किया डिवाइस कस्टम बनाया है, लेकिन सक्शन डिवाइस इकाइयों को भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । पंप की सीमा के भीतर समायोज्य होने की जरूरत है-20-४० केपीए और एक स्थिर और विश्वसनीय नकारात्मक दबाव प्रदान करते हैं । इस विधि का उपयोग करते हुए प्रयोगों को संचालित करने से पूर्व क्षेत्रीय नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए ।
    1. सबसे पहले, नीचे छिद्र प्लेट और चैंबर और जोड़ने नली के साथ खिड़की की थाली कोडांतरण द्वारा सक्शन चैंबर तैयार करते हैं । चैंबर संलग्न वैक्यूम पंप करने के लिए कसकर नली जोड़ने ।
      नोट: कक्षों में छाले प्रेरण, जो मानव त्वचा के साथ संपर्क के लिए उपयुक्त होना चाहिए के लिए एक छेद के साथ एक नीचे की थाली शामिल करना चाहिए, और एक खिड़की के साथ एक शीर्ष प्लेट, छाला के दृश्य की निगरानी के लिए अनुमति देता है ।
  2. त्वचा की प्रतिक्रिया के आकार के सापेक्ष छिद्र प्लेट के इष्टतम छिद्र व्यास का निर्धारण; छिद्र का बड़ा आकार, बड़ा छाला ।
  3. छिद्र थाली और शराब झाड़ू का उपयोग स्वयंसेवक की त्वचा को संक्रमित ।
  4. त्वचा के लिए सक्शन चैंबर संलग्न ।
    1. सुनिश्चित करें कि स्वयंसेवक की बांह आराम से आराम कर रही है ।
    2. सुनिश्चित करें कि सक्शन चैंबर के नीचे थाली में छेद पीपीडी प्रतिक्रिया पर स्थित है ताकि त्वचा की प्रतिक्रिया के केंद्र दिखाई दे रहा है ।
    3. ढीला पट्टियों का उपयोग चैंबर सुरक्षित: जब नकारात्मक दबाव लागू किया जाता है, चैंबर त्वचा के लिए पालन और अपनी स्थिति को बनाए रखने होगा ।
  5. सक्शन डिवाइस चालू करें और दबाव को समायोजित करने के लिए-20 केपीए.
  6. 30 मिनट के बाद, नकारात्मक दबाव को बढ़ाने के लिए-25 केपीए ।
  7. ६० मिनट के बाद, आगे नकारात्मक दबाव को बढ़ाने के लिए-30 केपीए ।
  8. एक छाला पूरी तरह से बनाई है जब तक-30 केपीए पर दबाव रखें । सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए नकारात्मक दबाव एक स्वनिर्धारित साधन के लिए विशिष्ट हैं । यह दबाव थोड़ा समायोजित जब अंय सेटिंग्स में प्रोटोकॉल लागू करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    नोट: छाले प्रेरण चरण ६० से १८० मिनट (1-3 एच) वास्तविक छाला पिछले 30 मिनट के भीतर होने वाली गठन के साथ पर्वतमाला । छाले अक्सर एक खुजली सनसनी के साथ जुड़ा हुआ है । फफोले एकल या एकाधिक विलय फफोले के रूप में हो सकता है. यदि छाला टूटना या रक्तस्राव होता है, यह धीरे दबाव जारी करके छाले प्रेरण समाप्त करने की सलाह दी है ।
  9. छाला पूरी तरह से गठन के बाद, दबाव जारी है, और ध्यान से rupturing छाला के बिना त्वचा से चूषण चैंबर को दूर ।
  10. लागू एक नरम आसपास के त्वचा क्षेत्र पर ड्रेसिंग और जगह एक हार्ड कैप (उदाहरणके लिए, एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब से) छाला पर ।
  11. एक नरम खिंचाव पट्टी के बाद गैर एलर्जी सर्जिकल टेप के साथ टोपी सुरक्षित ।
  12. स्वयंसेवक के लिए अगले 12-24 एच के लिए छाले क्षेत्र पर अत्यधिक शारीरिक तनाव से बचने के निर्देश ।

4. छाला द्रव की फसल-8 दिवस

  1. 8वें दिन, धीरे सुरक्षात्मक ड्रेसिंग को हटाने और त्वचा संक्रमण स्प्रे के साथ छाला को संक्रमित ।
  2. एक 23G सुई के साथ एक 2 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग करने के लिए छाला सामग्री फसल । छाला की छत के ऊपर/पार्श्व में सुई डालें और धीरे से द्रव महाप्राण । गुहा के फर्श को छूने से बचें लेकिन सभी तरल पदार्थ फसल के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. लागू एक ड्रेसिंग ढह छाला पर ।
  4. एक बाँझ ट्यूब करने के लिए छाला तरल पदार्थ स्थानांतरण । वॉल्यूम नोट करें ।
  5. 4 मिनट के लिए एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक का उपयोग कर ६०० x g पर छाले द्रव नीचे स्पिन ।
  6. एक और ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और सेल माध्यम के ५०० µ एल में सेल गोली resuspend ।
    नोट: कक्ष अब गिनती और आगे विश्लेषण के लिए तैयार हैं । Supernatants-20 करने के लिए-८० ° c उपयोग तक संग्रहित किया जा सकता है ।

5. सक्शन छाला कोशिकाओं और तरल पदार्थ का विश्लेषण

नोट: त्वचा चूषण फफोले से प्राप्त कोशिकाओं और द्रव के विश्लेषण के लिए निर्देश प्रदान करना इस प्रोटोकॉल के दायरे के भीतर नहीं है । हालांकि, इस रिपोर्ट के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करने के क्रम में, intracellular दाग प्रवाह cytometry और मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्रदर्शन किया गया । कार्यप्रणाली का वर्णन नीचे संक्षेप में किया गया है ।

  1. प्रवाह cytometry
    1. 1 एक्स 105 ताजा कोशिकाओं से सक्शन फफोले से पृथक से अलग करने के निलंबन को उत्तेजित 1 बीसीजी-टीका लगाने वाले स्वयंसेवक के साथ 10 µ जी/पीपीडी के एमएल और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह 2 पर कोशिकाओं की मशीन। एक समानांतर मशीन के लिए उत्तेजित कोशिकाओं को शामिल करें ।
    2. निलंबन को उत्तेजित 1 x 106 PBMCs से प्राप्त 1 बीसीजी-टीका लगाने वाले स्वयंसेवक के साथ 10 µ g/एमएल पीपीडी और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह 2 पर मिश्रण गर्मी। एक समानांतर मशीन के लिए उत्तेजित कोशिकाओं को शामिल करें ।
    3. 2 घंटे के बाद, Brefaldin एक और monensin के साथ सभी कोशिकाओं का इलाज और उंहें 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए गर्मी ।
    4. जीवित/मृत-दाग-BV510, विरोधी CD4-AF780 के एक पैनल के साथ कोशिकाओं दाग, एंटी-CD3-BV421, एंटी-सीडी 8-PerCP-cy 5.5, एंटी-CCR7-पे, एंटी-CD45RA-BV786, एंटी-IFN-γ-AF700, एंटी-TNF-α-पे-Cy7, और एंटी-आईएल-2-FITC ।
    5. PBMC कक्ष में FMO नियंत्रण शामिल करें ।
    6. एक प्रवाह के साथ एक प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन cytometer और प्रासंगिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण ।
    7. cytokine पर गेट-उत्पादन CD3 + CD4 + सीडी 8-सबसेट निंनलिखित गेटिंग रणनीति का उपयोग: singlets-> व्यवहार्य CD3 +-> CD4 + सीडी 8-> IFN-γ +, TNF-α +, या आईएल-2 + ।
    8. प्रभाव स्मृति सेल पर गेट निंनलिखित गेटिंग रणनीति का उपयोग कर आबादी: singlets-> व्यवहार्य CD3 +-> CD4 + सीडी 8--> CCR7-CD45RA-।
    9. बूलियन गेटिंग का उपयोग करके व्यक्तिगत cytokine प्रोफ़ाइल परिकलित करें ।
  2. Cytokine जारी प्रदर्शनों
    1. vivo मेंएक cytokine रिलीज़ के एक प्रदर्शन के लिए, il-2, IFN-γ, TNF-α, il-10, और il-13 गल सक्शन छाला तरल पदार्थ 4 स्वयंसेवकों से प्राप्त में के स्तर को बढ़ाता है के लिए एक मल्टीप्लेक्स विश्लेषण का उपयोग करें ।
    2. सक्शन फफोले पूर्व vivoसे प्राप्त कोशिकाओं द्वारा एक cytokine रिहाई के एक प्रदर्शन के लिए, ताजा चूषण छाला कोशिकाओं और PBMCs 1 बीसीजी-टीके लगाए स्वयंसेवक से प्राप्त का उपयोग करें ।
    3. एमटीबी H37Rv के १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के साथ PBMC और चूषण छाला कोशिकाओं को संक्रमित और 4 दिनों के लिए उन्हें गर्मी ।
    4. सभी कल्चरल supernatants में आईएल-2, IFN-γ, TNF-α, आईएल-10, और आईएल-13 के स्तरों को लगाने के लिए एक मल्टीप्लेक्स विश्लेषण का उपयोग करें ।
    5. ऊपरी परिकलन सीमा के लिए परख परिकलन श्रेणी के ऊपर माप समायोजित करें ।

Representative Results

आठ स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों (माध्य आयु: 30 वर्ष, सीमा: 26-43 वर्ष) के साथ एक प्रलेखित पिछले बीसीजी टीकाकरण (औसत समय से बीसीजी-टीकाकरण: ५.५ वर्ष, सीमा: 1-30 वर्ष) शामिल थे. प्रतिभागियों 3 दिन पर एक TST मूल्यांकन के बाद पीपीडी के 2 TU के साथ intradermally चुनौती दी गई । एसबीएस 7 दिन पर प्रेरित किया और 8 दिन पर काटा गया, और सभी फफोले 10 मिमी छिद्र व्यास के साथ सक्शन छाला कक्षों का उपयोग कर उठाया गया । सात व्यक्तियों को 2 अलग पीपीडी टीकाकरण एक ही हाथ में 2 समानांतर SB प्रेरण द्वारा पीछा दिया गया था (कृपया प्रोटोकॉलमें १.४ कदम नीचे एकाधिक पीपीडी बयान के बारे में नोट को देखें) । परिधीय रक्त प्लाज्मा के लिए 7 दिन पर तैयार की और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा एक PBMCs अलगाव था । एसबीएस से प्लाज्मा और द्रव supernatants-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया । ताजा SB कोशिकाओं (SBCs) nigrosine दाग और माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर गिना रहे थे ।

नैदानिक TST प्रतिक्रियाएं और SBC यील्ड चित्रा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । TST की अवधियों का औसत आकार १०.२५ मिमी (रेंज: 0-20 मिमी) था और प्रति छाला औसत सेल संख्या ५०,००० था (सीमा: १५,०००-२१०,००० कोशिकाओं, फफोले की संख्या: 15). स्वयंसेवकों के दो या तो 2 TSTs और एक इसी कम कुल १५,००० कोशिकाओं के सेल उपज में से कोई नैदानिक प्रतिक्रिया/ कोशिका उपज TST का मतलब नैदानिक प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ था (स्पीमरन के आर = ०.६४३, पी = ०.०९४) ।

Figure 1
चित्रा 1 : सक्शन छाला कोशिका उपज । (क) इस पैनल के एक प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी से पता चलता है nigrosine-सना हुआ SBs से पृथक कोशिकाओं 7 दिनों के बाद उठाया TST । (ख) इस पैनल का मतलब TST की अवधि के बीच संबंधों को दर्शाता है (मिमी) और मतलब कोशिका उपज (एन/blister) 8 बीसीजी में टीका लगाने वाले स्वयंसेवकों (फफोले की संख्या = 15). डॉट्स व्यक्तिगत मतलब माप का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया ध्यान दें कि 2 डॉट्स के रूप में अतिव्यापी है 2 स्वयंसेवकों दोनों एक TST की अवधि 0 मिमी और १५,००० की एक कोशिका उपज था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रवाह cytometric SB लक्षण वर्णन प्रदर्शित करने के लिए, SBCs एक ४३ वर्षीय स्वयंसेवक जो बीसीजी-30 साल पहले टीका लगाया गया था और एमटीबी के लिए कोई ज्ञात जोखिम था से प्राप्त किए गए थे । SBCs एक भी छाला के प्रेरण निंनलिखित अलग थे ( अवधि: १.४ mm/100000 SBCs) । चित्रा 2 PBMCs बनाम SBCs के intracellular cytokine दाग के प्रतिनिधि भूखंडों से पता चलता है ।

इस स्वयंसेवक में, CD3 के अंश + CD4 + सीडी 8-SBCs को उत्तेजित कोशिकाओं में ६७% से बढ़ > ९०% में एक पीपीडी पर इन विट्रो पुनः उत्तेजना, जबकि CD3 के अंश + CD4 + सीडी 8-PBMCs स्थिर बनी (~ ५१%, चित्रा 2) । में ९२% से अधिक इन विट्रो पीपीडी-, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजित CD3 + CD4 + सीडी 8-SBCs, के थे प्रभाव स्मृति प्रकार (CCR7-CD45RA-, डेटा नहीं दिखाया गया है) । विशिष्ट CD3 के समग्र अंश + CD4 + सीडी 8-पीपीडी-उत्तेजना से प्रेरित कोशिकाओं SBCs (३३.१ बनाम०.२%, उत्तेजित नमूनों में घटाया) की तुलना में अधिक थे... PBMCs में, polyfunctional पीपीडी-विशिष्ट CD3 + CD4 + सीडी 8-कक्षों के भिंन सभी < ०.०५% थे ।

Figure 2
चित्रा 2 : SBCs के प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंड बनाम PBMCs । पैनलों एक और बी शो प्रतिनिधि घनत्व सीडी 8 के भूखंड + और CD4 + में आबादी (एक) बनामउत्तेजित पीपीडी-उत्तेजित PBMCs और (ग) SBCs. पैनलों बी और डी धीमी intracellular के भूखंडों cytokine में दाग पीपीडी-उत्तेजित CD3 + CD4 + सीडी 8-कोशिकाओं के लिए (ख) PBMCs और (घ) SBCs. कृपया यहां क्लिक करें एक बड़ा देखने के लिए इस आंकड़े का संस्करण ।

जैसा कि उंमीद थी, CD3 + CD4 + सीडी 8-SBCs vivo मेंसक्रिय किया गया, कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात द्वारा सचित्र के लिए धुंधला हो जाना साइटोकिंस (12%), प्रमुख साइटोकिंस जा रहा है TNF-α और IFN-γ के साथ । हालांकि, पर पीपीडी-उत्तेजना, cytokine स्रावित कोशिकाओं एक ट्रिपल-या डबल पॉजिटिव IFN-γ + TNF-α + आईएल-2 + (17%) और IFN-γ + TNF-α + (15%) प्रोफाइल (चित्र 3 बी, PBMC प्रोफाइल एक ही दाता से तुलना के लिए शामिल है की ओर स्थानांतरित चित्र 3ए) । पीपीडी-उत्तेजित प्रभाव स्मृति CD4 के लिए cytokine अभिव्यक्ति प्रोफाइल + टी सेल उपसमुच्चय (CD3 + CD4 + सीडी 8-CCR7-CD45RA-) CD3 + CD4 + सीडी 8-जनसंख्या आंकड़े 2 और 3 में प्रस्तुत करने के लिए तुलनीय थे (नहीं दिखाया गया डेटा) ।

Figure 3
चित्रा 3: CD4 + पीपीडी के लिए Cytokine प्रोफाइल-उत्तेजित और उत्तेजित SBCs बनाम PBMCs ।  इन पैनलों cytokine उत्पादन के लिए व्यक्तिगत प्रोफाइल दिखाने के (क) CD3 + CD4 + सीडी 8-PBMCs कोशिकाओं और (ख) CD3 + CD4 + सीडी 8-SBCs । सलाखों के अंश का प्रतिनिधित्व प्रतिजन-विशिष्ट cytokine प्रोफाइल में उत्तेजित कोशिकाओं (सफेद सलाखों) और पर एक इन विट्रो उत्तेजना पीपीडी (रंगीन सलाखों) के साथ ।

cytokine microenvironment पर जानकारी के त्वचा परीक्षण के स्थल पर एक स्रोत के रूप में SB द्रव का पता लगाने के लिए, cytokine के स्तर पर एसबीएस प्रेरित 7 दिनों के बाद TST (4a) से काटा द्रव में मापा गया । IFN-γ, TNF-α, और IL-2 के माध्य स्तरों ३३९ स्नातकोत्तर/एमएल, 19 स्नातकोत्तर/एमएल, और 1 स्नातकोत्तर/एमएल, क्रमशः (n = 6) थे । प्लाज्मा स्तर आम तौर पर बहुत कम थे । SBs से पृथक कक्ष समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस ex vivo (चित्रा 4b) के उच्च स्तर का उत्पादन किया । Titrations 1 स्वयंसेवी से SBCs के विषमय एम तपेदिक ± ऑटोलॉगस PBMCs की उपस्थिति में 4 दिनों के लिए संस्कृति थे । IFN-γ के स्तर थे > 30-SBCs युक्त संस्कृतियों में उच्च गुना, PBMCs की उपस्थिति की परवाह किए बिना ।

Figure 4
चित्र 4 : SB द्रव, प्लाज्मा में Cytokine स्तर, और एमटीबी -संक्रमित संस्कृति supernatants । (क) यह पैनल 6 बीसीजी-टीका लगाने वाले स्वयंसेवकों से एसबी द्रव supernatants और प्लाज्मा में cytokine स्तर दिखाता है. सलाखों के औसत cytokine स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं; त्रुटि पट्टियां श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख) इस पैनल से supernatants में cytokine स्तरों से पता चलता है 4 समानांतर ६०० µ एल पूर्व vivo 4 दिन की संस्कृतियों की 1 x 106 PBMCs (काली पट्टियां), १.७५ x 105 SBCs (सफेद सलाखों), और 1 x 106 PBMCs या तो ०.५ या १.७५ x 10 के साथ नुकीला 5 SBCs (ग्रे सलाखों) एमटीबीसे संक्रमित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यह पांडुलिपि vivo मेंमानव प्रतिरक्षा स्मृति प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया का वर्णन है, त्वचा संबंधी प्रतिजन याद और चूषण छाला प्रेरण द्वारा कोशिका फसल का उपयोग कर । TST का एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया intradermal प्रतिजन जमाव और बीसीजी-वैक्सीन याद है. अंत में, cytometric और मल्टीप्लेक्स cytokine विश्लेषण द्वारा sb नमूना लक्षण वर्णन का एक उदाहरण प्रदान किया गया था, का प्रदर्शन है कि मोटे तौर पर sb कोशिकाओं के एक तिहाई प्रतिजन-विशिष्ट polyfunctional टी कोशिकाओं प्रभाव स्मृति phenotype के थे ।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम intradermal इंजेक्शन तकनीक, सक्शन छाला प्रेरण, और छाला पंचर शामिल हैं । सबसे पहले, एक सही intradermal जमाव प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है । एक गलत जमाव के लिए उपयुक्त परिणाम हो सकते हैं । पीपीडी आम तौर पर एक प्रसिद्ध और सुरक्षित त्वचा के नीचे प्रतिजन है, लेकिन इसकी संरचना निर्माताओं के बीच भिन्न हो सकते हैं, तुलना13,20सीमित. इस रिपोर्ट में 2 टू के एक एकल intradermal जमाव के लिए निर्देश प्रदान करता है, और वैकल्पिक रूप से दो समानांतर जमाव (2 एक्स 2 टू), जो अतिरिक्त नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, अंय अध्ययनों से 10 TU, जो एक मजबूत त्वचा प्रतिक्रिया10,21की संभावना में वृद्धि का इस्तेमाल किया है । एसबी प्रेरण कदम के दौरान, नकारात्मक दबाव में छोटे stepwise बढ़ जाती है नकसीर और छाला टूटना का खतरा कम हो जाएगा । खून से लाल रक्त कोशिकाओं या leucocytes के साथ संक्रमण की संभावना आम तौर पर कम2रहे हैं । अपूतित पंचर तकनीक माइक्रोबियल संक्रमण से बचाता है और पंचर सुई और चमड़े का छाला फर्श के बीच संपर्क से बचने के मलबे या निवासी त्वचा कोशिकाओं की अशुद्धियां कम कर देता है । हालांकि, कुछ शोधकर्ताओं ने पंचर छाला10के लिए एक रोलिंग दबाव लागू करने से SB द्रव फसल को पसंद करते हैं । यह छाले के भीतर सेपता पंचर करने के लिए आवश्यक हो सकता है । एसबी तकनीक ही न्यूनतम इनवेसिव है; ढह SBs जख्म और संक्रमण के बिना चंगा बहुत दुर्लभ हैं । 2 हालांकि, hypo के कुछ डिग्री-रंजकता हो सकता है और SB प्रेरण शायद colloid scarring के इतिहास के साथ लोगों में से बचा जाना चाहिए ।

तकनीकी सीमाओं कम कुल सेल पैदावार और फलस्वरूप लंबी अवधि के भंडारण के लिए सीमित विकल्प शामिल हैं । leucocyte उपज, नैदानिक TST प्रतिक्रियाओं, छाला आकार, और एरिथ्रोसाइट संदूषण के बीच संबंधों को अच्छी तरह से2,10कहीं वर्णित किया गया है । में बीसीजी-याद प्रयोगों यहां प्रस्तुत (1 चित्रा), प्रत्येक छाला से औसत कुल उपज ५०,००० था, एक छोटे पैमाने पर प्रायोगिक सेट इन कोशिकाओं का उपयोग कर, खासकर अगर SBCs15अकेले अध्ययन कर रहे हैं । हालांकि, एक SB नमूने में विशिष्ट टी सेल जनसंख्या ज्यादातर जो दोनों रिश्तेदार और निरपेक्ष सेल गिनती में PBMC नमूनों में पाया जाता है से अधिक है । चित्र 2में प्रस्तुत उदाहरण में, १००,००० SB कोशिकाओं के एक नमूने में ट्रिपल-पॉजिटिव पीपीडी-विशिष्ट टी-कोशिकाओं की संख्या एक ही दाता (डेटा नहीं दिखाया गया है) से 1 x 106 PBMCs में पाई गई संख्या से अधिक 2x से अधिक थे । TST प्रतिक्रिया का एक दृश्य स्कोरिंग M. तपेदिक स्मृति के मूल्यांकन के लिए सबसे आम नैदानिक विधि है । ध्यान दें, अंतर्निहित अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नैदानिक त्वचा प्रतिक्रिया2,21के रूप में एक ही समय में चोटी नहीं है । नहीं सभी बीसीजी टीका या एमटीबीउजागर व्यक्तियों मजबूत TST प्रतिक्रियाओं और वर्गीकरण के लिए रणनीतियों का विकास होगा, और TST गैर से नमूनों की हैंडलिंग-जवाब, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन जनसंख्या में एक मौजूदा माइक्रोबैक्टीरियल संवेदीकरण, इस विधि का उपयोग कर एक याद परीक्षण आरंभ करने से पहले विचार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, दोनों SB नमूना और दृश्य स्कोरिंग में, एक सैद्धांतिक पूर्वाग्रह के लिए कम त्वचा प्रतिक्रियाओं के साथ व्यक्तियों में वैश्विक या त्वचा के कारण बिगड़ा प्रतिरक्षा संबंधित के रूप में देखा, उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण और कुछ आयु समूहों में2, 13,18,20. इसके अलावा, दोहराया परीक्षण के साथ TST प्रतिक्रिया के एक प्रतिरक्षा बढ़ाने अच्छी तरह से20,22जाना जाता है । हालांकि, TSTs10दोहराया जाता है जब SB सेल phenotypes नहीं बल्कि लगातार रहते हैं । इस अवलोकन सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अनुदैर्ध्य अध्ययन में SB याद की भूमिका का समर्थन करता है ।

T-cell immunologists के लिए, SB स्मरण antigen-विशिष्ट कक्षों के उच्च अंशों की कटाई के लिए अनुमति देता है । हालांकि, एक पीपीडी-जमाव से एक नमूने के लिए SB के समय दोनों सेलुलर संरचना और cytokine microenvironment परिवर्तन के रूप में महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में, छाले 7 दिन बाद चुनौती प्रेरित थे और अलग कोशिकाओं को मुख्य रूप से CD4 + प्रभाव स्मृति टी कोशिकाओं के एक सह के साथ कोशिकाओं के उच्च अंशों सहित IFN-γ, TNF-α, और आईएल-2 थे । इन टिप्पणियों पिछले कैसे टी सेल सक्रियण, प्रसार का वर्णन अध्ययनों के साथ लाइन में हैं, और भेदभाव पीपीडी में होता है-प्रधान त्वचा2,15,21। पीपीडी में काइनेटिक एसबी अध्ययन-संवेदी व्यक्तियों बहुत जल्दी त्वचा प्रतिक्रिया विशिष्ट है कि सुझाव देते हैं; हालांकि, पहले पहले दिन के भीतर पीपीडी-चैलेंज के बाद, प्रतिक्रिया CD4 द्वारा प्रभुत्व हो जाता है + टी कोशिकाओं (दोनों केंद्रीय स्मृति और प्रभाव स्मृति phenotypes वर्णित किया गया है) और, 3 दिनों के बाद, प्रतिक्रिया के उच्च भागों का प्रभुत्व है पीपीडी-विशिष्ट cytokine उत्पादक CD4 + टी-कोशिकाओं2,8,10,15,21. यह अनुकूली cytokine प्रतिक्रिया 2 सप्ताह से अधिक 2,8,10,23के लिए detectable रहता है । 7 दिन के बाद TST cytokine उत्पादन स्मृति CD4 + टी कोशिकाओं2के संग्रह के लिए सबसे इष्टतम समय बिंदु प्रतीत होता है । हालांकि, अंय समय अंक, ज़ाहिर है, प्रतिजन और ब्याज की प्रतिक्रिया के आधार पर प्रासंगिक हो सकता है । नोट की, एक अध्ययन में, अनुकूली पीपीडी प्रतिक्रिया एक छोटे से पहले पहले से ही 5 दिनों के बाद-TST10में समर्थक भड़काऊ cytokine स्राव में कमी के साथ पीक करने के लिए सूचित किया गया है ।

SB द्रव दोनों समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस और अन्य प्रोटीन के उच्च स्तर शामिल त्वचा microenvironment15,24के प्रतिनिधि होने के लिए दिखाया गया है । कैनेटीक्स अध्ययनों से पता चला है कि TNF-α और IFN-γ स्तर SB द्रव शिखर में 3 दिनों के बाद, जबकि आईएल-2 स्तर 7 दिनों के बाद चोटी2,10, शायद इस बाद के चरण में अनुकूली प्रतिक्रियाओं के प्रभुत्व को प्रतिबिंबित । क्योंकि SB कोशिकाओं vivo मेंसक्रिय किया गया है, वे एक उच्च सहज cytokine रिहाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 3 और 4) उत्तेजना पर एक विशिष्ट रिहाई के लिए एक संभावित प्रदर्शन ।

यह रिपोर्ट CD4 + टी-सेल प्रतिरक्षा पर केंद्रित है । के रूप में चित्र 2में प्रदर्शन किया, अलग टी कोशिकाओं के बहुमत वास्तव में CD4 + थे, जबकि सक्शन छाला तरल पदार्थ में लगभग कोई सीडी 8 + टी कोशिकाओं थे । यह अंय SB पीपीडी-याद अध्ययन कम अनुपात और सीडी 8 के एक अवर प्रवासी क्षमता + टी कोशिकाओं CD4 + टी कोशिकाओं2,8,10,23की तुलना में रिपोर्टिंग के साथ लाइन में है । सीडी 8 का एक और लक्षण वर्णन + योगदान बेहतर होगा; हालांकि, यह इस रिपोर्ट के दायरे से बाहर है ।

टी कोशिकाओं एमटीबीके प्रतिरक्षा नियंत्रण के लिए आवश्यक माना जाता है; हालांकि, यह रक्त25,26से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में प्रतिबिंबित सुरक्षा के एक विश्वसनीय सहसंबंधी की पहचान करने के लिए मुश्किल हो गया है । इस अंधी गली गंभीर रूप से नए टीबी टीकों के विकास में बाधा, के रूप में वहां वर्तमान में बड़े और बहुत महंगा प्रभावकारिता परीक्षण27के लिए कोई विकल्प नहीं है । टीबी वैक्सीन डेवलपर्स वैक्सीन-विशिष्ट टी सेल में रक्त28,29में आबादी छोटे और क्षणिक परिवर्तन का आकलन करके वैक्सीन immunogenicity निर्धारित करते हैं । हालांकि, यह संदिग्ध है कि क्या प्रतिजन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं के रक्त में पाया घूम के छोटे अंश प्रासंगिक है (यानी, एक संक्रमण और टी के प्रतिनिधि की साइट के लिए पलायन करने में सक्षम-सेल संपंन microenvironment नियंत्रित एमटीबी) 27 , 30 , 31 .

पिछले अध्ययनों और यहां प्रस्तुत आंकड़ों के आधार पर, SB त्वचा संबंधी याद मॉडल वैक्सीन के अध्ययन के लिए एक अप्रयुक्त क्षमता विशिष्ट टी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । न केवल मॉडल एक टीका प्रतिक्रिया की एक याद सक्षम करता है दशकों पहले उत्पंन, यह भी एक ऊतक में सच स्मृति क्षमता का मूल्यांकन विशिष्ट संदर्भ15,18,19,21की अनुमति देता है । उपंयास, विशिष्ट त्वचा परीक्षण, जो भी शामिल एंटीजन उंमीदवार उपइकाई टीबी के टीके के शामिल, वैक्सीन मूल्यांकन के लिए नए अवसरों का सुझाव इस मॉडल का उपयोग कर28,३२। इसके अलावा, transcriptomic विश्लेषण सुझाव है कि एक कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पीपीडी-चैलेंज्ड त्वचा में उत्पन्न एमटीबी-संक्रमित फेफड़े18में पाया प्रतिक्रिया के समान है ।

जबकि त्वचा पंच बायोप्सी भी त्वचा से एक सेल फसल के लिए अनुमति देते है और स्थानिक जानकारी प्रदान करते हैं, SB नमूना के साथ तुलना में, विधि अधिक आक्रामक है और एंजाइमी या मैकेनिक प्रसंस्करण एकल सेल निलंबन३३तैयार करने की आवश्यकता है । साइटोकिंस और सेल मार्कर के माप दो तरीकों2,10के बीच तुलनीय हैं ।

सक्शन छाला विधि पहले से ही त्वचा विज्ञान के अलावा चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में लागू किया गया है, या तो अकेले या एक प्रणालीगत या स्थानीय त्वचा चुनौती के साथ संयोजन में । उदाहरण पूति, Epstein-बर्र वायरस से जुड़े lymphoproliferative रोग, मधुमेही न्यूरोपैथी, glucocorticoid सेवन प्रभाव, और मानव परीक्षण चिकित्सकीय एंटीबॉडी या टी के लिए मॉडल-सेल-लक्षित चिकित्सा के परीक्षण के अध्ययन शामिल10 ,३४,३५,३६,३७,३८।

देखने के एक चिकित्सकीय बिंदु से, SB त्वचा की याद विधि अद्वितीय लाभ प्रदान करता है मध्य टी सेल स्मृति क्षमता का अध्ययन करने के लिए और-दोनों को देखने का एक जैविक और तकनीकी बिंदु से-स्किन एक प्रासंगिक नमूना डिब्बे2प्रदान करने के लिए लगता है, 15,18,19,21. विशेष रूप से, पारंपरिक, परिसंचारी PBMCs के निष्क्रिय नमूना की तुलना में, SB त्वचा संबंधी याद विधि टी कोशिकाओं है कि उनके प्रासंगिक प्रतिजन के जवाब में लिम्फ नोड से माइग्रेट करने की क्षमता साबित कर दिया है के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और स्थानीय पूरा विस्तार और एक ऊतक में भिंनता-vivo संदर्भ में विशिष्ट15,18,19,21।

अंत में, मॉडल यहां प्रदर्शित मानव अनुकूली उन्मुक्ति और टी के क्षेत्र के भीतर शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक हो सकता है सेल लक्ष्यीकरण एजेंटों (यानी, संक्रामक रोग vaccinology या कैंसर अनुसंधान में) । इस प्रोटोकॉल में लागू TST मॉडल, ज़ाहिर है, टीबी vaccinology के क्षेत्र में विशेष प्रासंगिकता का है । हालांकि, इस मॉडल की मूल अवधारणा अनुसंधान के अंय क्षेत्रों में अत्यधिक लागू है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनकी व्यावहारिक और अकादमिक सलाह के लिए Mads Radmer जेंसेन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे; तकनीकी विशेषज्ञता प्रदान करने के लिए लाऊ Lindqvist और काञे Svejstrup; हेलेन Bæk Juel, जोनाथन Filskov, हस्ताक्षर टी. श्मिट, और Solveig उनके तकनीकी सहायता के लिए डब्ल्यू Harpøth; पीपीडी प्रशासन में उनके प्रशिक्षण के लिए Gentofte टीबी पेशेंट क्लिनिक में स्टाफ; और अध्ययन में भाग लेने के लिए सभी स्वयंसेवकों । इस परियोजना के यूरोपीय आयोग H2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है [अनुदान संख्या TBVAC2020 ६४३३८१], और हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए संघ के भागीदारों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

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