Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar i Vivo

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57554
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1, 2,3, 1, 4, 1
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

Summary

Her gir vi en demonstrasjon av inntaks blemme kutan tilbakekalling modellen. Modellen gir en enkel tilgang til studere human i vivo adaptive immunreaksjoner, for eksempel i forbindelse med vaksineutvikling.

Abstract

Kutan antigen huske modeller tillate studier av menneskelige minnet svar i vivo. Kombinert med huden sugekraft blemme (SB) induksjon, tilbyr denne modellen tilgjengelighet til sjeldne bestander av antigen-spesifikke T-celler representant for cellulær hukommelse svaret så vel som de cytokin microenvironment i situ.

Denne rapporten beskriver praktiske fremgangsmåten en cutaneous tilbakekalling, en SB induksjon og en høster av antigen-spesifikke T-celler. Du eksemplifiserer metoden, tuberkulin huden testen brukes for antigen tilbakekalling i individer som, før denne studien gjennomgikk en Bacillus Calmette-Guérin vaksinasjon mot en infeksjon med Mycobacterium tuberculosis. Til slutt, eksempler på multipleks og flyt cytometric analyser av SB er gitt, illustrerer høy fraksjoner av antigen-spesifikke polyfunctional CD4 + T-celler tilgjengelig ved denne sampling metoden sammenlignet med celler isolert fra blodet.

Metoden beskrevet her er safe og minimalt invasive, gir en unik mulighet til å studere både medfødte og adaptive immunreaksjoner i vivoog kan være nyttig for et bredt fellesskap av forskere arbeider med celle-mediert immunitet og menneskelige minne svar, i sammenheng med vaksineutvikling.

Introduction

En hud SB er en kunstig indusert blemme, som tillater høsting av celler og fluid direkte fra huden. Teknikken av heve SBs av vakuum er et velkjent verktøy innen Dermatologi brukes for studiet av huden immunologi i helse og sykdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denne rapporten viser hvordan SB teknikken kombinert med kutan antigen tilbakekalling (SB kutan tilbakekalling metode) kan gi direkte innsikt i adaptive immunreaksjoner i vivo.

Prinsippet bak SB induksjon er enkel: en lett vakuum brukes på et lite område av huden. Den negative trykket vil til slutt tvinge overhuden å skille fra dermis, opprette en lokal blemme fylt med væske og celler1,2,9. Blemme væsken kan høstes av en tynn nål aspirasjon, og innholdet kan brukes for videre studier i vitro.

I de senere årene har det vært en økende interesse i SB-metoden for å studere i vivo immunreaksjoner enn sykdommer begrenset til huden10,11. Studiet av adaptiv immunitet hos mennesker er begrenset av det faktum at cellene og cytokiner av interesse er utvalgt fra perifert blod fordi en invasiv prøvetaking lymfeknute eller mage mucosal vev kan være uakseptabelt og uetisk. Et eksempel er studiet av varige menneskelige minnet T-celle svar etter vaksinasjon12. Prøvetaking av relevante T-celler kan være en stor utfordring, fordi den relevante populasjonen av celler som megle immunitet ligger i lymfoidvev i slike prøvelser, og bare et svært begrenset antall bestemte T-celler sirkulere i perifert blod.

SB teknikken tilbyr en unik mulighet til å studere minne T-celler og andre spesifikke celle populasjoner. Etter kutan inoculation av antigen, T-celler spesifikke for antigen er rekruttert fra deres lymfoide hideaways huden og lett kan bli samplet fra SB. Den metodologi og forskning anvendelser av denne kutan tilbakekalling modellen ble beskrevet av Akbar et al. i 20132. En brukte antigen for huden tilbakekalling er kommersielt tilgjengelige renset protein derivat (PPD) av mykobakterier brukes til å utføre en tuberkulin huden test (TST)13, hvor PPD injiseres i den dermal lag av huden. I personer med en eksisterende immunologisk minne mot PPD [f.eks, personer med en Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infeksjon eller en tidligere Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaksine], antigen avsetning resulterer i en husker svar med overføring på huden og en i vivo klonal ekspansjon PPD-spesifikke CD4 + T-celler2,11,14,15. Som et resultat, høy fraksjoner av PPD-spesifikke polyfunctional CD4 + T-celler akkumuleres i huden klar for SB prøvetaking. T-celler samlet av denne metoden har vist seg for å være robust og er tilstrekkelig rikelig å være preget av en rekke immunanalyser og en langsiktig i vitro kultur15. Dermed kutan tilbakekalling modellen og SB induksjon kan være en verdifull metode for å studere i vivo T-celle svar av ex vivo analyser, og økt kunnskap om denne tilnærmingen kan dra forskere med interesser i cellulær immunologi og vaccinology.

Denne rapporten gir den første trinnvis guiden om hvordan å indusere menneskehud sugekraft blemmer i PPD-injisert huden. Kutan antigen tilbakekalling modellen er demonstrert ved hjelp av TST i BCG-vaksinert frivillige. Til slutt, relevante ex vivo analyse av celler og cytokiner isolert av SB er eksemplifisert. Phenotypical og funksjonelle kjennetegner PPD-spesifikke T-celler ved metoden SB er grundig beskrevet andre steder2,10,11,16,17, 18 , 19. denne rapporten skal diskutere de praktiske og immunologiske aspektene av metodikken å lette anvendelsen av denne teknikken av andre forskningsgrupper.

Protocol

Alle metodene beskrevet nedenfor, inkludert bruk av frivillige, har blitt godkjent av den danske Committee on Health Research etikk (H-15002988) og dansk Data Protection Agency (jr.nr. 2015-57-0102). PPD-filen må være en sertifisert produkt godkjent for menneskelig bruk og administreres i riktig dosering fra produsenten. Avvik i dosering eller administrasjonen kan kreve ytterligere etiske godkjenninger og frivillige må gi samtykke.

1. tuberkulin Skin Test

  1. Få muntlig og skriftlig samtykke fra frivillig. Før injeksjon, sikre at frivillige forstår og godtar prosedyren inkludert mulige negative virkninger.
    Merk: Inklusjonskriterier gjelder for denne protokollen er > 18 år og en dokumentert BCG vaksinasjon. Inklusjonskriterier kan variere avhengig av problemstillingen (dvs.et ekstra inkludering kriterium kan være bevis på positive TST).
  2. Bruk en ferdig løsning av PPD for menneskelig bruk [20 tuberkulin enheter (TU) /mL]. Desinfiser gummi hetten ampuller med en alkoholholdige vattpinnen.
  3. Forberede injeksjonsstedet
    1. Finn injeksjonsstedet på ventral side av de frivillige underarmen.
    2. Plasser arm palm-opp på en ren overflate, og velg et område på den øvre tredjedelen av underarmen, ca 5-10 cm fra albueleddet. Hold klar av arr, årer, eller skadet hud.
    3. Desinfiser området med en alkoholholdige vattpinnen.
  4. Forberede PPD-løsningen
    1. Bruk en 1 mL steril sprøyte med en 27-30G/kort (f.eks, 12 mm) fast nål.
    2. Forsiktig bland og aspire 0,1 mL av PPD løsningen. Kontroller at det ikke er noen synlige bobler.
  5. Intradermal PPD injeksjon
    Merk: Dette trinnet beskriver hvordan du utfører en enkelt PPD-deponering, men flere avsetninger av PPD i samme armen er mulig. Dette kan imidlertid kreve bestemte etiske godkjenning.
    1. Strekke huden og peker nålen i 5-15° vinkel til huden med skråkant vendt oppover.
    2. Stikk nålen inn i dermal lag av huden og sørge for at spissen er nesten synlig gjennom overhuden.
    3. Sakte injisere 0,1 mL PPD løsning.
      Merk: Hvis forvaltes riktig, en blek papule 6-10 mm vises umiddelbart. Papule forsvinner etter ca 10 min.
    4. Når to eller flere depositions, mål for en maksimal separasjon (5-10 cm) av injeksjon nettsteder samtidig i en god avstand fra området albuen og håndleddet.
      Merk: Dette hindrer en potensiell samløpet av huden test respons og tillater uavbrutt plasseringen av inntaks kinesere.

2. evaluering av huden reaksjon - dag 3

  1. Etter 48-72 h, merk størrelsen på hud reaksjonen. Måle indurasjon (hevelse) og ikke erytem (rødhet) av reaksjonen.
  2. Palpate hard hevelse bruker fingrene og deretter merke kantene på indurasjon bruker en kulepenn. Bruk en linjal til å måle indurasjon diameter og Merk resultatet i mm.
    Merk: En lesning av indurasjon størrelsen kan lede valg av orifice diameter for sugekraft kammeret.

3. enkel sugeevnen blemme induksjon - dag 7

  1. Samle sugeinnretning enheten.
    Merk: Sugekraft enheten enheter er vakuumpumper med vedlagte kamre for sugekraft blemme induksjon. Enheten brukes i denne demonstrasjonen er gjort, men sugeinnretning enheter er også tilgjengelige. Pumpen må justeres innenfor området av 20 til-40 kPa og gi en stabil og pålitelig negative trykket. Regionale etiske godkjenning skal hentes før gjennomfører eksperimenter ved hjelp av denne metoden.
    1. Først forberede sugekraft kammeret ved montering orifice bunnplaten og vinduet plate med kammer og koble slangen. Fest kammer-koble slangen tett vakuumpumpe.
      Merk: Kamrene bør inneholde en bunnplaten med hull for blemme induksjon, som bør være egnet for den menneskelige huden, og en topp plate med et vindu, slik at for visuell overvåking av blæren.
  2. Finne optimal orifice diameter orifice platen i forhold til hud reaksjonen; Jo større størrelsen på munnstykket, jo større blemme.
  3. Desinfiser orifice platen og huden av frivillig bruker alkohol vattpinner.
  4. Fest sugekoppen kammeret til huden.
    1. Kontroller at de frivillige arm hviler komfortabelt.
    2. Kontroller at hullet i bunnplaten av inntaks kammeret ligger over PPD reaksjonen slik at midten av hud reaksjonen er synlig.
    3. Sikre kammeret løst med stropper: Når negative trykket er brukt, kammeret vil holde seg til huden og beholde sin.
  5. Aktivere sugeinnretning og justere trykket for-20 kPa.
  6. Etter 30 min, øke det negative presset til-25 kPa.
  7. Etter 60 minutter, ytterligere øke det negative presset til-30 kPa.
  8. Holde trykket ved-30 kPa til en blemme er fullt dannet. Kontroller at negative presset i denne protokollen er spesifikke for en tilpasset instrument. Det kan være nødvendig å justere presset litt når protokollen i andre innstillinger.
    Merk: Blemme induksjon fasen varierer fra 60 til 180 min (1-3 h) med faktiske blemme dannelsen forekommer i de siste 30 min. Blistering er ofte forbundet med en kløende følelse. Blemmer kan oppstå som ett eller flere flette blemmer. Hvis blemme brudd eller blødning oppstår, det anbefales å avslutte blemme induksjon av sakte slippe presset.
  9. Etter blemme er fullt dannet, slipp trykket, og nøye fjerne sugekraft kammeret fra huden uten rupturing blemme.
  10. Bruk en myk dressing på hud området og Legg en vanskelig cap (f.eksfra et 50 mL plastrør) over blemme.
  11. Sikre lokket med Allergikervennlige kirurgisk tape etterfulgt av en myk elastisk bandasje.
  12. Instruere frivillig å unngå overdreven belastning på blemme området for neste 12-24 h.

4. harvest blemme væske - dag 8

  1. 8th dag, forsiktig fjerne den beskyttende bandasjen og desinfisere blemme med huden desinfeksjon spray.
  2. Bruk en 2 mL steril sprøyte med en 23G nål for å høste blemme innholdet. Sette inn nålen inn i toppen/lateral siden av blemme taket og sakte Sug opp væske. Unngå å berøre gulvet i hulrom, men sørg for å høste alle væsken.
  3. Bruk en dressing skjult blemme.
  4. Overføre blemme væske til et sterilt rør. Merk volumet.
  5. Spinne blemme væsken ned 600 x g ved hjelp av en tabletop sentrifuge for 4 min.
  6. Overføre nedbryting til en annen tube og resuspend celle pellet i 500 µL av cellen medium.
    Merk: Cellene er nå klar for telling og ytterligere analyse. Supernatants kan lagres på 20 til-80 ° C før bruk.

5. analyser av sug blemme celler og væsker

NOTE Instruksjoner for analyse av celler og væske fra huden sugekraft blemmer er ikke innenfor denne protokollen. Men for å gi representant resultater for denne rapporten, ble intracellulær stain flow cytometri og multipleks analyser utført. Metodene er beskrevet kort nedenfor.

  1. Flowcytometri
    1. Stimulere suspensjoner 1 x 105 friske celler isolert fra sugekraft blisters fra 1 BCG-vaksinert frivillig med 10 µg/mL PPD og ruge cellene på 37 ° C og 5% CO2. Inkluder unstimulated celler for en parallell inkubasjon.
    2. Stimulere suspensjoner 1 x 106 PBMCs innhentet fra 1 BCG-vaksinert frivillig med 10 µg/mL PPD og ruge blandingen på 37 ° C og 5% CO2. Inkluder unstimulated celler for en parallell inkubasjon.
    3. Etter 2 h, behandle alle celler med Brefaldin A og monensin og ruge dem for 6 h 37° C.
    4. Stain cellene med en Live/Dead-flekk-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 og anti-IL-2-FITC.
    5. Omfatte FMO kontroller i PBMC-panelet.
    6. Utføre en flyt cytometric analyse med en flyt cytometer og analysere resultatene med relevant programvare.
    7. Gate på produksjon av cytokin CD3 + CD4 + CD8-delsettene ved hjelp av følgende gating strategien: singleter - > levedyktig CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + eller IL-2 +.
    8. Gate på effektor minne celle populasjoner ved hjelp av følgende gating strategien: singleter - > levedyktig CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.
    9. Beregne personlige cytokin-profiler som bruker boolske gating.
  2. Cytokin utgivelsen demonstrasjoner
    1. For en demonstrasjon av et cytokin utgivelse i vivo, bruke en multiplex analyse for å kvantifisere nivåer av IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 og IL-13 i tinte sugekraft blemme væske fra 4 frivillige.
    2. For en demonstrasjon av en cytokin utgivelse av celler Hentet fra sugekraft blemmer ex vivo, bruk frisk sugekraft blemme celler og PBMCs Hentet fra 1 BCG-vaksinert frivillig.
    3. Infisere PBMC og enkel sugeevnen blemme celler med 100 colony-forming enheter (CFU) av Mtb H37Rv og ruge dem i 4 dager.
    4. Bruke en multiplex analyse for å kvantifisere nivåer av IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 og IL-13 i alle kultur supernatants.
    5. Justerer du målene over analysen beregning området øvre beregning grensen.

Representative Results

Åtte friske voksne frivillige (median alder: 30 år, varierer: 26-43 år) med en dokumentert tidligere BCG vaksinasjon (gjennomsnittlig tid fra BCG-vaksine: 5,5 år, rekkevidde: 1-30 år) ble inkludert. Deltakerne ble utfordret intradermally med 2 TU av PPD etterfulgt av en TST evaluering på dag 3. SBs ble indusert på dag 7 og høstes på dag 8, og alle blemmer ble reist med 10 mm orifice diameter inntaks blemme kamre. Syv personer fikk 2 separat PPD vaksinering samtidig i samme armen etterfulgt av 2 parallelle SB inductions (se merknad om flere PPD depositions under trinn 1.4 i protokollen). Perifert blod ble trukket på dag 7 plasma og en PBMCs isolering av tetthet gradert sentrifugering. Plasma og væske supernatants fra SBs ble lagret på 20 ° C. Frisk SB celler (SBCs) ble regnet nigrosine flekken og mikroskopi.

Den kliniske TST svar og SBC avkastning presenteres i figur 1. Median størrelsen på TST-indurations var 10.25 mm (område: 0 - 20 mm) og median celle per blemme var 50.000 (område: 15.000-210 000 celler, antall blemmer: 15). To av frivillige hadde ingen kliniske svar i en av de 2 TSTs og en tilsvarende lav total-celle ytelse på 15.000 celler/blemme. Cellen avkastningen var assosiert med mener kliniske svar TST (Spearman's r = 0.643, p = 0.094).

Figure 1
Figur 1 : Sugekraft blemme celle avkastning. (en) dette panelet viser en representant mikroskopi nigrosine-farget celler isolert fra SBs hevet 7 dager innlegg-TST. (b) dette panelet viser forholdet mellom de mener TST indurasjon (mm) og mener celle avkastningen (n/blister) i 8 BCG-vaksinert frivillige (antall blemmer = 15). Prikkene representerer mener enkeltmål. Vær oppmerksom på at 2 prikker er overlappende som 2 frivillige begge hadde en TST indurasjon 0 mm og en celle avkastning på 15.000. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å demonstrere flyt cytometric SB karakterisering, SBC ble innhentet fra 43 år gammel frivillig som hadde vært BCG-vaksinert 30 år tidligere og hadde ingen kjente eksponering for Mtb. The SBCs ble isolert etter induksjon av en enkelt blemme ( indurasjon: 1,4 mm/100.000 SBCs). Figur 2 viser representant tomter intracellulær cytokin farging av den SBCs versus PBMCs.

I denne frivillig, brøkdel av CD3 + CD4 + CD8-SBCs økt fra 67% i unstimulated celler til > 90% på en PPD i vitro restimulation, mens brøkdel av CD3 + CD4 + CD8-PBMCs forble konstant (~ 51%, figur 2). Over 92% av den i vitro PPD-, samt unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBC, var av effektor minnetype (CCR7 - CD45RA-, data ikke vist). Generelle fraksjoner av bestemte CD3 + CD4 + CD8-celler av PPD-stimulering var høyere i SBC sammenlignet med PBMCs (33.1 vs. 0,2%, unstimulated prøver trukket). I PBMCs var fraksjoner av polyfunctional PPD-spesifikke CD3 + CD4 + CD8-celler alle < 0,05%.

Figure 2
Figur 2 : Representant flyt cytometri tomter SBCs versus PBMCs. Paneler en og b Vis representant tetthet tomter CD8 + og CD4 + populasjoner i (en) unstimulated vs. PPD-stimulert PBMCs og (c) SBCs. paneler b og d langsom tomter av intracellulær cytokin farging i PPD-stimulert CD3 + CD4 + CD8-celler for (b) PBMCs og (d) SBCs. Vennligst klikk her for å vise en større versjonen av dette tallet.

Som forventet, var CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktivert i vivo, illustrert av en høy andel av cellene flekker for upregulated cytokiner (12%), med dominerende cytokiner TNF-α og IFN-γ. Men på PPD-stimulering, flyttet cytokin sekresjon celler mot en trippel - eller dobbel-positiv IFN-γ + TNF-α + IL-2 + (17%) og IFN-γ + TNF-α + (15%) profil (figur 3b, PBMC profiler fra samme donor er inkludert for sammenligning i Figur 3a). Cytokin uttrykket profiler for PPD-stimulert effektor minne CD4 + T-celle delsett (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) var sammenlignes med CD3 + CD4 + CD8-befolkningen i tall 2 og 3 (data ikke vist).

Figure 3
Figur 3: cytokin profiler for CD4 + PPD-stimulert og unstimulated SBCs versus PBMCs.  Disse sidene vise individuelle profiler for produksjon av cytokin (en) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs celler og (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Bars forestiller fraksjoner av antigen-spesifikke cytokin profiler i unstimulated celler (hvit barer) og en i vitro stimulering med PPD (fargede søyler).

For å utforske SB væsken som en kilde til informasjon på cytokin microenvironment på stedet av huden testing, ble cytokin nivåer målt i væske høstet fra SBs indusert 7 dager innlegg-TST (figur 4a). Median nivåer av IFN-γ TNF-α og IL-2 var 339 pg/mL, 19 pg/mL og 1 pg/mL, henholdsvis (n = 6). Plasmanivåer var generelt svært lav. Celler isolert fra SBs produsert høye nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner ex vivo (figur 4b). Titrations av SBC fra 1 frivillig ble kultivert for 4 dager i nærvær av virulente M. tuberkulose ± autologous PBMCs. Den IFN-γ nivåer > 30-fold høyere i kulturer som inneholder SBCs, uavhengig av tilstedeværelsen av PBMCs.

Figure 4
Figur 4 : Cytokin nivåer i SB fluid, plasma, og MTB -infisert kultur supernatants. (en) dette panelet viser cytokin nivåer i SB fluid supernatants og plasma fra 6 BCG-vaksinert frivillige. Bars forestiller median cytokin nivåer; feilfeltene representerer området. (b) dette panelet viser cytokin nivåene i supernatants fra 4 parallelle 600 µl ex vivo 4-dagers kulturer 1 x 106 PBMCs (stenger), 1.75 x 105 SBCs (hvit barer) og 1 x 106 PBMCs tilsatt 0,5 eller 1.75 x 10 5 SBCs (grå barer) infisert med Mtb. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette manuskriptet beskriver en praktisk fremgangsmåte for studiet av menneskelig immun minne svar i vivo, ved hjelp av kutan antigen tilbakekalling og cellen høsting ved inntaks blemme induksjon. TST ble brukt som et eksempel på intradermal antigen avsettelse og BCG-vaksine tilbakekalling. Til slutt, et eksempel på SB prøven karakterisering av flyt cytometric og multipleks cytokin analyse ble gitt, viser at om lag en tredjedel av SB cellene var antigen-spesifikke polyfunctional T-celler av effektor minne fenotypen.

De avgjørende skritt i denne protokollen inkludere intradermal injeksjon teknikken, suge blemme induksjon, og blister punktering. Først krever en riktig intradermal avsettelse opplært personale. En feil deponering kan føre til suboptimal resultater. PPD er vanligvis en velkjent og sikker kutan antigen, men komposisjonen kan variere mellom produsenter, begrense sammenlignbarheten13,20. Denne rapporten inneholder instruksjoner for en enkelt intradermal avsettelse av 2 TU, og eventuelt to parallelle avsetninger (2 x 2 TU), som kan kreve ekstra etiske godkjenning. Men har andre studier brukt 10 TU, som øker sannsynligheten for en sterk hud reaksjonen10,21. Under SB induksjon trinn reduseres liten gradvis økning i negative trykket risikoen for blødning, og blister ruptur. Sjansene for forurensning med røde blodceller eller leukocytter fra blodet er generelt lavt2. Unngå kontakt mellom nålen punktering og dermal blemme gulvet reduserer urenheter rusk eller bosatt hudceller aseptiske punktering teknikken hindrer mikrobiell forurensning. Men foretrekker noen forskere å høste SB fluid ved å bruke et rullende trykk punktert blemme10. Det kan være nødvendig å punktere septa innen blemme. SB teknikken selv er minimal invasiv; skjulte SBs leges uten arrdannelse og infeksjoner er svært sjeldne. 2 men noen grad av hypo-pigmentering oppstå og SB induksjon bør antagelig unngås folk med en historie med kolloid arrdannelse.

Tekniske begrensninger omfatter lav total-celle avkastning og derfor begrensede muligheter for langtidslagring. Relasjoner mellom leucocyte avkastningen, klinisk TST svar, blemme størrelse og røde blodlegemer forurensning er grundig beskrevet andre steder2,10. BCG-tilbakekalling eksperimentene presenteres her (figur 1) var den median totale avkastningen fra hver blister 50.000, antyder en småskala eksperimentelle set-up bruker disse cellene, spesielt hvis SBCs studerte alene15. Imidlertid overskrider bestemte T-celle befolkningen i en SB prøve det meste det som er funnet i PBMC prøver i både relative og absolutte celletall. I eksemplet i figur 2, var antall trippel-positive PPD-spesifikke T-celler i 100.000 SB celler mer enn 2 x større enn antallet i 1 x 106 PBMCs fra samme donor (data ikke vist). En visuell scoring av TST reaksjonen er den vanligste kliniske metoden for vurdering av M. tuberkulose minne. Av notatet, underliggende adaptive immunologiske reaksjonen ikke topp samtidig som klinisk hud reaksjonen2,21. Ikke alle BCG-vaksinert eller Mtb-utsatt enkeltpersoner vil utvikle sterke TST reaksjoner og strategier for klassifisering og en håndtering av prøver fra TST ikke-respondere, samt en forhåndsdefinert mycobacterial sensibilisering i studien befolkningen, må vurderes før du starter en tilbakekalling prøveversjon benytter denne metoden. Også i både SB prøvetaking og visuelle scoring, det er et potensial for en teoretisk skjevhet i personer med redusert huden svar på grunn av global eller hud-relaterte nedsatt immunitet sett, for eksempel i HIV-infeksjon og bestemte aldersgrupper2, 13,18,20. I tillegg er en immunologiske styrking av TST reaksjon med gjentatte testing kjente20,22. SB celle fenotyper beholdes imidlertid ganske konstant når TSTs gjentatte10. Denne observasjonen støtter rollen SB tilbakekalling longitudinelle studier av mobilnettet immunreaksjoner.

T-celle immunologists lar SB tilbakekalling for innhøsting av høy fraksjoner av antigen-spesifikke celler. Men er timingen av SB for et utvalg fra en PPD-deponering kritisk som både mobilnettet sammensetningen og cytokin microenvironment endres over tid. I denne protokollen, blemmer ble indusert 7-dagers post utfordring og isolert cellene var hovedsakelig CD4 + effektor minne T-celler inkludert høy fraksjoner av celler med en co uttrykk IFN-γ, TNF-α og IL-2. Disse observasjonene er i tråd med tidligere studier som beskriver hvordan T-celle aktivering, spredning og differensiering forekommer i PPD-primet huden2,15,21. Kinetisk SB studier i PPD-sensitivisert individer tyder på at tidlig huden svaret er uspesifikke; imidlertid allerede i de første dagene etter PPD-utfordringen, svaret blir dominert av CD4 + T-celler (både sentrale minne og effektor minne fenotyper har vært beskrevet), og etter 3 dager, svaret er dominert av høye fraksjoner PPD-spesifikke cytokin produsere CD4 + T-celler,2,,8,,10,,15,,21. Dette tilpasningsdyktige cytokin svaret forblir synlig i mer enn 2 uker2,8,10,23. Dag 7 innlegg-TST synes å være det mest optimale tidspunktet for innsamling av cytokin produsere minne CD4 + T-celler2. Men kan andre tidspunkt selvfølgelig være relevante avhengig av antigen og svar av interesse. Av notatet, i en studie, har tilpasset PPD svaret blitt rapportert til topp litt tidligere med en nedgang i pro-inflammatoriske cytokin utskillelsen allerede på 5 dager innlegg-TST10.

SB fluid inneholder høye nivåer av både pro-inflammatoriske cytokiner og andre proteiner vist å være representativt for huden microenvironment15,24. Kinetics studier har vist at TNF-α og IFN-γ nivåer i SB fluid topp etter 3 dager mens IL-2 nivåer topp etter 7 dager2,10, sannsynligvis gjenspeiler dominans av adaptive svar på dette senere tidspunktet. Fordi SB celler har vært aktivert i vivo, viser de en høy spontan cytokin utgivelse som et potensial for en spesifikk løslate på restimulation (Figur 3 og 4).

Denne rapporten fokuserer på CD4 + T celler immunitet. Som vist i figur 2, fleste av de isolerte T-cellene var faktisk CD4 +, mens det var nesten ingen CD8 + T-celler i inntaks blemme væske. Dette er i tråd med andre SB PPD-tilbakekalling studier lav proporsjoner og en mindreverdig vandrende kapasitet på CD8 + T-celler sammenlignet med CD4 + T celler2,8,10,23. Ytterligere karakteristikk av CD8 + bidrag ville være å foretrekke; men er dette utenfor omfanget av denne rapporten.

T-celler blir ansett som viktig for immun kontroll av Mtb; imidlertid har det vært vanskelig å identifisere en pålitelig relateres til beskyttelse i adaptive immunrespons blod25,26. Dette veisperring hinder alvorlig for utviklingen av nye TB vaksiner, som det er for øyeblikket ikke noe alternativ til stor og kostbar effekt studier27. TB vaksine utviklere bestemme vaksinen immunogenisitet ved å vurdere små og forbigående endringer i vaksine-spesifikke T-celle populasjoner i blod28,29. Imidlertid er det tvilsomt om brøkdel av sirkulerende antigen-spesifikke T-celler finnes i blodet er relevante (dvs.i stand til å migrere til området av en infeksjon og representant for T-celle-rike microenvironment kontrollere Mtb) 27 , 30 , 31 .

Basert på tidligere studier og dataene som presenteres her, representerer SB kutan tilbakekalling modellen en uutnyttet potensial for studiet av vaksine-spesifikke T-celler. Ikke bare aktiveres modellen en tilbakekalling av en vaksine svar som genereres tiår siden, den likeledes innrømmer evalueringen av ekte minnet i vev-spesifikke sammenheng15,18,19,21. Roman, bestemt huden tester, som inkluderer antigener også består av kandidaten delenhet TB vaksiner, foreslår nye muligheter for vaksine evaluering bruker modell28,32. Videre transcriptomic analyser foreslår at en celle - mediated-immunrespons generert i PPD-utfordret huden ligner på svaret i Mtb-infisert lunge18.

Mens hud punch biopsies også tillate en celle høst fra huden og gi romlig informasjon, sammenlignet med SB prøvetaking, metoden er mer invasiv og krever enzymatisk eller mekanisk behandling å forberede encellede suspensjoner33. Målinger av cytokiner og celle markører er sammenlignbar mellom de to metoder2,10.

Metoden sugekraft blemme er allerede brukt i mange områder av medisinsk forskning foruten Dermatologi, enten alene eller i kombinasjon med en systemisk eller lokale hud utfordring. Eksempler omfatter studier av sepsis, Epstein - Barr virus-assosiert lymphoproliferative sykdom, diabetisk nevropati, glukokortikoid inntak effekter og menneskelige studier testing terapeutiske antistoffer eller modeller for T-celle-målrettet terapi10 ,34,35,36,37,38.

Fra et terapeutisk synspunkt, metoden SB kutan tilbakekalling tilbyr unike fordeler for å studere sentrale T-celle minnet potensielle og -fra både en biologisk og teknisk synspunkt-hud synes å gi relevante prøvetaking seksjon2, 15,18,19,21. Spesielt sammenlignet med tradisjonelle, passive prøvetaking av sirkulerende PBMCs, SB kutan tilbakekalling metoden gjør studiet av T-celler som har vist evnen til å migrere fra lymfeknute svar til deres aktuelle antigen, og fullføre lokalt ekspansjon og differensiering i vev-spesifikke i vivo sammenheng15,18,19,21.

I konklusjonen, vist modellen her kan være relevant for forskere innen human adaptiv immunitet og T-celle målretting agenter (dvs.i infeksjonssykdommer vaccinology eller kreft forskning). TST modellen brukes i denne protokollen er, selvfølgelig, spesielt relevant innen TB vaccinology. Det grunnleggende konseptet av denne modellen er imidlertid svært aktuelt i andre felt av forskning.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Mads Radmer Jensen for sin praktiske og akademiske råd; Lau Lindqvist og Kaare Svejstrup for å gi teknisk ekspertise; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt og Solveig W. Harpøth for deres kundestøtte; personalet på Gentofte TB poliklinikk for trening i PPD administrasjon; og alle frivillige for å delta i studien. Dette prosjektet er finansiert av European Commission H2020 programmet [bevilgning nummer TBVAC2020 643381], og vi vil gjerne takke consortium partnere for de fruktbare diskusjonene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340 (2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 138 enkel sugeevnen blemme immunologi tilbakekalling hud utfordring antigen T-celle minne T-celle PPD tuberkulin huden test vaksiner i vivo svar tuberkulose
En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar <em>i Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M.,… More

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter