Summary
Här ger vi en demonstration av sug blister kutan minns modellen. Modellen ger en enkel tillgång till studera mänskliga i vivo adaptiva immunsvar, exempelvis i samband med utvecklingen av vaccin.
Abstract
Kutana antigen-recall modeller möjliggör studier av människans minne Svaren i vivo. Kombination med huden sug blister (SB) induktion, erbjuder denna modell tillgänglighet till sällsynta populationer av antigen-specifika T-celler representant av cellulärt minne svaret samt den cytokin närmiljön i situ.
Denna rapport beskriver det praktiska förfarandet en kutan minns, SB induktion och en skörd av antigen-specifika T-celler. För att exemplifiera metoden, tuberkulinprov används för antigena minns i individer som före studien genomgick en Bacillus Calmette-Guérin vaccination mot en infektion med Mycobacterium tuberculosis. Slutligen finns exempel på multiplex och flöde flödescytometrisk analyser av SB exemplar, som illustrerar hög fraktioner av antigen-specifika Polyfunktionella CD4 + T-celler finns tillgängliga genom denna provtagningsmetod jämfört med celler som isolerats från blod.
Den metod som beskrivs här är säker och minimalinvasiv, ger en unik möjlighet att studera både medfödd och adaptiv immunsvar i vivooch kan vara fördelaktigt att en bred gemenskap av forskare som arbetar med cell-medierad immunitet och mänskliga minne svaren, i samband med utvecklingen av vaccin.
Introduction
En hud SB är ett artificiellt inducerad blister, vilket möjliggör skörden av cellerna och vätska direkt från huden. Tekniken att höja SBs av vakuum är ett välkänt verktyg inom dermatologi används för studier av huden immunologi i hälsa och sjukdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denna rapport visar hur den SB teknik kombinerat med kutan antigena recall (SB kutan recall metod) kan ge direkta insikter adaptiva immunsvaret i vivo.
Principen bakom SB induktion är enkel: ett lätt vakuum används till ett litet område av huden. Det negativa trycket kommer att så småningom tvinga epidermis att separera från dermis, att skapa en lokal blåsa fylld med vätska och celler1,2,9. Blister vätskan kan skördas av en fin nål aspiration och innehållet kan användas för ytterligare undersökning in vitro.
Under de senaste åren har det skett ett ökat intresse i SB-metoden för att studera i vivo immunsvar än sjukdomar begränsade till huden10,11. Studien av adaptiv immunitet hos människa är begränsad av det faktum att cellerna och cytokiner sevärdheter provtas från perifert blod eftersom en invasiv provtagning av lymfkörtel eller gastrointestinala slemhinnor vävnad kan vara oacceptabelt och oetiskt. Ett exempel är studiet av långlivade människans minne T-cell svar efter vaccinering12. I sådana prövningar, provtagning av relevanta T-celler kan vara en stor utmaning, eftersom populationen av celler som medla immunitet är bosatt i den lymfoida vävnaden, och endast ett mycket begränsat antal specifika T-celler som cirkulerar i perifert blod.
Den SB-tekniken erbjuder en unik möjlighet att studera minne T-celler och andra specifika cellpopulationer. Efter kutan inympning av antigen, T-celler specifika för antigenet rekryteras från deras lymfoida gömställen på huden och kan enkelt avnjutas från SB. Metodik och forskning tillämpningar av kutan minns modellen beskrevs av Akbar o.a. i 20132. Ett vanligt förekommande antigen för hud minns är det kommersiellt tillgängliga renade proteinderivatet (PPD) av mykobakterier som används för att utföra ett tuberkulin hudtest (TST)13, där PPD injiceras i det dermala lagret av huden. Hos individer med en befintlig immunologiskt minne mot PPD [e.g., individer med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion eller en tidigare Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccination], antigen nedfall resulterar i en minns svar med migration på huden och en i vivo klonal expansion av PPD-specifika CD4 + T-celler2,11,14,15. Som ett resultat, hög fraktioner av PPD-specifika Polyfunktionella CD4 + T-celler ansamlas i huden redo för SB provtagning. T-celler som samlas in av denna metod har visat sig vara robust och är tillräckligt att präglas av en rad immunanalyser och en långsiktig i vitro kultur15. Således kutana minns modellen och SB induktion kan visa sig vara en värdefull metod att studera i vivo T-cell svar genom ex vivo analyser, och ökad kunskap om denna strategi kan få forskare med intressen i cellulär immunologi och vaccinologi.
Denna rapport innehåller den första stegvisa guiden om hur att inducera human hud sug blåsor i PPD-injiceras hud. Kutana antigen minns modellen demonstreras med hjälp av TST hos BCG-vaccinerade frivilliga. Den relevanta ex vivo analysen av celler och cytokiner som isolerats av SB är slutligen exemplifieras. Fenotypiska och funktionella egenskaper av PPD-specifika T-celler genom metoden SB är noggrant beskrivs på andra ställen2,10,11,16,17, 18 , 19. denna rapport syftar till att diskutera de praktiska och immunologiska aspekterna av metoden för att underlätta tillämpningen av denna teknik av andra forskargrupper.
Protocol
Alla metoder som beskrivs nedan, inklusive användning av frivilliga försökspersoner, har godkänts av den danska kommittén för hälsa forskningsetik (H-15002988) och danska dataskyddsverket (jr.nr. 2015-57-0102). PPD-filen måste vara en certifierad produkt godkänd för humant bruk och administreras inom rätt dos som tillhandahålls av tillverkaren. Eventuella avvikelser i dosering eller administration kan kräva ytterligare etiska godkännanden och volontärer måste ge sitt informerade samtycke.
1. tuberkulinprov
- Erhålla muntliga och skriftliga samtycke från volontären. Före injektionen, säkerställa att volontären förstår och godtar förfarandet även de möjliga skadeverkningarna.
Obs: Inklusionskriterier som är specifika för detta protokoll är ålder > 18 år och en dokumenterad BCG-vaccination. Inklusionskriterier kan variera beroende på forskningsfrågan (dvs.ett ytterligare integration kriterium kan vara bevis för positiva TST). - Använd en färdig lösning för PPD för humant bruk [20 tuberkulin enheter (TU) /mL]. Desinficera gummi locket av en injektionsflaska med en spritsudd.
- Förbered injektionsstället
- Leta upp injektionsstället på volontärens underarmens ventrala sida.
- Placera den arm palm-upp på en slät yta och välj ett område på den övre tredjedelen av underarmen, ca 5-10 cm från armbågsleden. Bo på ärr, vener eller skadad hud.
- Desinficera området med en alkoholhaltiga kompress.
- Förbereda PPD-lösningen
- Använd en 1 mL steril spruta med en 27-30G/kort (t.ex., 12 mm) fast nål.
- Blanda försiktigt och aspire 0,1 mL av PPD-lösningen. Kontrollera att det finns inga synliga bubblor.
- Intrakutan PPD-injektion
Obs: Detta steg beskriver hur du utför en enda PPD nedfall, men flera nedfall av PPD i samma arm är möjligt. Detta kan dock kräva specifika etiskt godkännande.- Sträck ut huden och peka huden med nålen i 5-15° vinkel med den fasade kanten uppåt.
- Sätt spetsen på nålen i det dermala lagret av huden och se till att spetsen är nästan synligt genom epidermis.
- Injicera långsamt 0,1 mL av PPD-lösning.
Obs: Om administreras korrekt, en blek papule 6-10 mm visas omedelbart. Papule försvinner efter cirka 10 min. - När du gör två eller fler depositioner, eftersträva en maximal separation (5-10 cm) av injektionsställena samtidigt hålla i en bra bit från området armbåge och handled.
Obs: Detta förhindrar en potentiell sammanflödet av hudtest svar och tillåter oavbruten placeringen av två sug kammare.
2. utvärdering av hudreaktionen - dag 3
- Efter 48-72 h, notera storleken på hudreaktionen. Mäta induration (svullnad) och inte erytem (rodnad) av reaktionen.
- Palpera hård svullnad med fingrar och sedan markera kanterna på den induration med hjälp av en kulspetspenna. Använd en linjal för att mäta induration diameter och notera resultatet i mm.
Obs: En läsning av induration storlek kan styra valet av orifice diameter för sugkammaren.
3. sug Blister induktion - dag 7
- Montera enheten suganordning.
Obs: Sug-enheter är vakuumpumpar med bifogade kammare för sug blister induktion. Den anordning som används i denna demonstration är skräddarsydd, men sug-enheter också är kommersiellt tillgängliga. Pumpen behöver vara justerbar inom intervallet -20-40 kPa och ger en stadig och pålitlig undertryck. Regionala etiskt godkännande bör erhållas före genomföra experiment med denna metod.- Först förbereda sugkammaren av montering öppning bottenplattan och fönster plattan med kammaren och de anslutande slang. Fäst kammare-ansluter slangen tätt vakuumpumpen.
Obs: Avdelningar bör omfatta en bottenplatta med ett hål för blister med induktion, som bör vara lämplig för kontakt med människors hud, och en övre plattan med ett fönster, vilket möjliggör visuell övervakning av blister.
- Först förbereda sugkammaren av montering öppning bottenplattan och fönster plattan med kammaren och de anslutande slang. Fäst kammare-ansluter slangen tätt vakuumpumpen.
- Avgöra optimal öppning diameter orifice plattan i förhållande till hudreaktionen; Ju större storleken på öppningen, ju större blistret.
- Desinficera orifice plattan och huden på volontären använder spritkompresser.
- Fäst sugkammaren huden.
- Kontrollera att den frivilligarbetande personens arm vilar bekvämt.
- Kontrollera att hålet i sugkammaren bottenplatta ligger över PPD reaktionen så att mitten av hudreaktionen är synlig.
- Säkra kammaren löst med hjälp av remmar: när undertrycket appliceras, kammaren kommer att fästa på huden och behålla sin position.
- Aktivera suganordningen och justera trycket till-20 kPa.
- Efter 30 min, öka undertrycket till-25 kPa.
- Efter 60 min, ytterligare öka undertrycket till-30 kPa.
- Hålla trycket vid-30 kPa tills en blåsa bildas helt. Se till att den negativa påverkan som avses i detta protokoll är specifika för ett anpassat instrument. Det kan vara nödvändigt att justera trycket något när tillämpa protokollet i andra inställningar.
Obs: Blister induktionsfasen varierar från 60 till 180 min (1-3 h) med faktiska blister bildandet som inträffar inom den sista 30 min. Blistering förknippas ofta med en kliande känsla. Blåsorna kan förekomma som enstaka eller flera fusionerande blåsor. Om blisterförpackningen bristning eller blödning uppstår, det rekommenderas att avsluta blister induktion genom att sakta släppa trycket. - När blåsan är fullt bildats, släpp trycket och ta försiktigt bort sugkammaren från huden utan spricker blåsan.
- Applicera ett mjukt förband på området kring huden och placera ett hårt lager (t.ex., från en 50 mL plaströr) över blåsan.
- Säkra den gemensamma jordbrukspolitiken med icke allergiframkallande kirurgisk tejp följt av en mjuk stretchig bandage.
- Instruera volontären att undvika överdriven fysisk påfrestning på området blister för nästa 12-24 h.
4. skörden av Blister vätska - dag 8
- Den 8: e dagen, försiktigt ta bort det skyddande förbandet och desinficera blåsan med hud desinfektion spray.
- Använd en 2 mL steril spruta med en 23-G nål för att skörda blister innehållet. Stick in nålen i toppen/laterala sidan av blister taket och aspirera långsamt vätskan. Undvik att vidröra golvet i hålrummet men se till att skörda alla vätskan.
- Applicera en dressing på kollapsade blistret.
- Överföra blister vätskan till ett sterilt rör. Notera volymen.
- Snurra blister vätskan ner vid 600 x g använder en bordsskiva centrifug för 4 min.
- Överför supernatanten till en annan röret och återsuspendera cellpelleten i 500 µL av cell medium.
Obs: Cellerna är nu redo för inventering och ytterligare analyser. Supernatanterna kan förvaras vid -20 till-80 ° C fram till användning.
5. analyser av sug Blister celler och kroppsvätskor
Obs: Att ge instruktioner för analys av celler och vätska som erhålls från sug hudblåsor är inte omfattas av detta protokoll. Men för att ge representativa resultat för detta betänkande, utfördes intracellulära fläcken flöde flödescytometri och multiplex analyser. Metoden som beskrivs i korthet nedan.
- Flödescytometri
- Stimulera suspensioner av 1 x 105 färska celler isolerade från sug blåsor från 1 BCG-vaccinerade volontär med 10 µg/mL för PPD och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2. Inkludera ostimulerade celler för en parallell inkubation.
- Stimulera suspensioner 1 x 106 PBMC erhållits från 1 BCG-vaccinerade volontär med 10 µg/mL för PPD och inkubera blandningen vid 37 ° C och 5% CO2. Inkludera ostimulerade celler för en parallell inkubation.
- Efter 2 h, behandla alla celler med Brefaldin A och monensin och inkubera dem i 6 timmar vid 37° C.
- Färga celler med en panel av Live/Dead-fläck-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 och anti-IL-2-FITC.
- Inkludera FMO kontroller på panelen PBMC.
- Utföra en flöde flödescytometrisk analys med en flödescytometer och analysera resultaten med relevant programvara.
- Grind på cytokin-producerande CD3 + CD4 + CD8-delmängder använder följande Usenets strategi: undertröjor - > livskraftig CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + eller IL-2 +.
- Gate på effektor minne cellpopulationer med följande Usenets strategi: undertröjor - > livskraftig CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.
- Beräkna enskilda cytokin-profiler som använder booleska gating.
- Cytokin release demonstrationer
- För en demonstration av en cytokin release i vivo, använda en multiplex analys för att kvantifiera nivåerna av IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 och IL-13 i tinade sug blister vätska erhålls från 4 volontärer.
- För en demonstration av en cytokinfrisättning av celler som erhållits från sug blåsor ex vivo, Använd färska sug blister celler och PBMC erhållits från 1 BCG-vaccinerade volontär.
- Infektera PBMC och sug blister celler med 100 kolonibildande enheter (CFU) av Mtb H37Rv och inkubera dem i 4 dagar.
- Använda en multiplex analys för att kvantifiera nivåerna av IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 och IL-13 i alla cellkulturer.
- Justera måtten ovan den assay Beräkningsområde till övre beräkning gränsen.
Representative Results
Åtta vuxna friska frivilliga (medianålder: 30 år, intervall: 26-43 år) med en dokumenterad tidigare BCG-vaccination (Mediantiden från BCG-vaccination: 5,5 år, intervall: 1-30 år) ingår. Deltagarna utmanades intradermalt med 2 TU PPD följt av en TST utvärdering på dag 3. SBs var inducerad på dag 7 och skördats på dag 8, och alla blåsor höjdes med sug blister chambers med 10 mm öppning diametrar. Sju personer fick 2 separata PPD vaccinationer samtidigt i samma arm följt av 2 parallella SB induktioner (hänvisas till Not angående flera PPD depositioner nedan steg 1.4 i protokollet). Perifert blod drogs på dag 7 för plasma och en PBMC isolering densitet gradient centrifugering. Plasma och vätska supernatanterna från SBs förvarades vid-20 ° C. Färsk SB celler (SBCs) räknades med Nigrosin fläcken och mikroskopi.
Den kliniska TST respons och SBC avkastning presenteras i figur 1. De TST indurations median storlek var 10,25 mm (intervall: 0 - 20 mm) och median cell varje blisterkarta var 50.000 (sortiment: 15 000-210 000 celler, antal blåsor: 15). Två av frivilliga hade ingen kliniskt svar i någon av de 2 TSTs och motsvarande låga totala cell kapacitet på 15 000 celler/blister. Cell avkastningen var associerade med den genomsnittliga kliniska reaktionen av TST (Spearman's r = 0.643, p = 0.094).
Figur 1 : Sug blister cell avkastning. (en) denna panel visar en representant mikroskopi av Nigrosin-färgade celler isolerade från SBs 7 dagar post-TST. (b) i denna panel visas förhållandet mellan den genomsnittliga TST induration (mm) och genomsnittlig cell avkastningen (n/blister) i 8 BCG-vaccinerade volontärer (antal blåsor = 15). Prickarna representerar individuella genomsnittliga mätningar. Observera att 2 prickar överlappar 2 frivilliga båda hade en TST induration 0 mm och en cell avkastning 15.000. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att Visa flödet flödescytometrisk SB karakterisering, SBCs erhölls från en 43-årig volontär som hade varit BCG-vaccinerade 30 år tidigare och hade ingen känd exponering för Mtb. The SBCs isolerades efter induktion av en enda blister ( induration: 1,4 mm/100.000 SBCs). Figur 2 visar representativa tomter den intracellulära cytokin färgning av den SBCs kontra PBMC.
I detta volontär, fraktionen av CD3 + CD4 + CD8-SBCs ökat från 67% i ostimulerade celler > 90% vid en PPD i vitro restimulering, medan fraktionen av CD3 + CD4 + CD8-PBMC förblev konstant (~ 51%, figur 2). Mer än 92% av de i vitro PPD-, såväl som de ostimulerade CD3 + CD4 + CD8-SBCs, var av typ av effektor-minne (CCR7 - CD45RA-, data som inte visas). De övergripande fraktionerna av specifika CD3 + CD4 + CD8-celler induceras av PPD-stimulering var högre i SBC jämfört med PBMC (33,1 vs. 0,2%, ostimulerade prover subtraheras). I PBMC var fraktioner av Polyfunktionella PPD-specifika CD3 + CD4 + CD8-celler alla < 0,05%.
Figur 2 : Representativa flöde flödescytometri tomter av SBCs jämfört med PBMC. Paneler en och b visar representativa densitet tomter av CD8 + och CD4 + populationer i (en) ostimulerade vs. PPD-stimulerade PBMC och (c) SBCs. paneler b och d långsam tomter av intracellulära cytokin färgning i PPD-stimulerad CD3 + CD4 + CD8-celler för (b), PBMC och (d) SBCs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Som förväntat, var CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktiverat i vivo, illustrerad av en hög andel av cellerna färgning för uppreglerad cytokiner (12%), med den dominerande cytokiner som TNF-α och IFN-γ. Emellertid, vid PPD-stimulering, en cytokin som utsöndrar celler skiftat mot en trippel - eller dubbel-positiva IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) och IFN-γ + TNF-α + (15%) profil (figur 3b, PBMC profiler från samma givare ingår för jämförelse i Figur 3a). Cytokin uttryck profilerna för PPD-stimulerad effektor minne CD4 + T-cell undergrupper (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) var jämförbara med CD3 + CD4 + CD8-befolkningen presenteras i figurerna 2 och 3 (inga data anges).
Figur 3: cytokin profiler för CD4 + PPD-stimuleras och ostimulerade SBCs kontra PBMC. Dessa paneler Visa enskilda profiler för cytokin produktion (en) CD3 + CD4 + CD8-PBMC celler och (b), CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Staplarna representerar fraktioner av antigen-specifika cytokin profiler i ostimulerade celler (vita staplar) och vid en in vitro- stimulering med PPD (färgade fält).
För att utforska den SB vätskan som en informationskälla på den cytokin mikromiljö vid platsen för den hudtester, mättes cytokin nivåerna i vätska som skördas från SBs inducerad 7 dagar post-TST (figur 4a). Median nivåerna av IFN-γ, TNF-α och IL-2 var 339 pg/mL, 19 pg/mL och 1 pg/mL, respektive (n = 6). Plasmanivåerna var generellt mycket låg. Celler som isolerats från SBs producerat höga nivåer av proinflammatoriska cytokiner ex vivo (figur 4b). Titreringar av SBCs från 1 volontär odlades i 4 dagar i närvaro av virulent M. tuberculosis ± autolog PBMC. IFN-γ nivåerna var > 30 gånger högre i kulturer som innehåller SBCs, oavsett förekomsten av PBMC.
Figur 4 : Cytokin nivåer i SB vätska, plasma, och MTB -infekterade cellkulturer. (en) i denna panel visas cytokin nivåer i SB vätska supernatanterna och plasma från 6 BCG-vaccinerade volontärer. Staplarna representerar medianen cytokin nivåer; felstaplar representera spänna. (b) denna panel visar cytokin i supernatanterna från 4 parallella 600 µl ex vivo 4-dagars kulturer av 1 x 106 PBMC (svarta staplar), 1,75 x 105 SBCs (vita staplar) och 1 x 106 PBMC spetsade med antingen 0,5 eller 1,75 x 10 5 SBCs (grå staplar) infekterade med Mtb. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta manuskript beskriver praktiska förfarandet för studiet av mänskliga immunologiskt minne Svaren i vivo, med kutan antigen recall och cellen skörd genom sug blister induktion. TST användes som ett exempel på intradermala antigen nedfall och BCG-vaccin recall. Slutligen var ett exempel på SB preparatet karakterisering av Flödesanalys flödescytometrisk och multiplex cytokin förutsatt, visar att ungefär en tredjedel av SB cellerna var antigen-specifika Polyfunktionella T-celler av effektor minne fenotypen.
De kritiska steg i detta protokoll inkluderar intradermal injektionstekniken, sug blister induktion och blister punkteringen. För det första kräver en rätt intradermala nedfall utbildad personal. En felaktig nedfall kan leda till suboptimala resultat. PPD är i allmänhet en välkända och säkra kutan antigen, men dess sammansättning kan variera mellan tillverkare, begränsa jämförbarhet13,20. Denna rapport innehåller instruktioner för en enda intradermala nedfall av 2 TU och eventuellt två parallella depositioner (2 x 2 TU), vilket kan kräva ytterligare etisk godkännande. Men har andra studier använt 10 TU, vilket ökar sannolikheten för att en stark hud reaktion10,21. Under SB induktion steg, kommer att små stegvis ökning av det negativa trycket minska risken för blödning och blistret bristning. Risken för kontaminering med röda blodkroppar eller leukocyter från blodomloppet är generellt låg2. Den aseptiska punktering-tekniken förhindrar mikrobiell kontamination och att undvika kontakt mellan punktering nålen och dermal blister golvet minskar orenheter av skräp eller bosatta hudceller. Vissa forskare föredrar dock att skörda SB vätska genom att tillämpa en rullande tryck till punkterad blister10. Det kan vara nödvändigt att punktera septa inom blistret. Den SB-tekniken själv är minimalt invasiva; kollapsade SBs läker utan ärrbildning och infektioner är mycket sällsynta. 2 dock viss grad av hypo-pigmentering kan uppstå och SB induktion bör nog undvikas hos personer med en historia av colloid ärrbildning.
Tekniska begränsningar inkluderar låg summacell avkastning och följaktligen begränsade alternativ för långsiktig lagring. Relationer mellan leukocytbefriade avkastningen, kliniska TST svaren, blister storlek och erytrocyt kontaminering har varit grundligt beskrivs på andra ställen2,10. I BCG-recall experiment presenteras här (figur 1) var medianvärdet totala avkastningen från varje blister 50 000, vilket innebär en småskalig experimental set-up med dessa celler, särskilt om SBCs är studerade ensam15. Specifik T-cells befolkningen i en SB prov överstiger dock mestadels vad som finns i PBMC prover i både relativa och absoluta blodkroppar. I exemplet presenteras i figur 2, var antalet triple-positiv PPD-specifika T-celler i ett prov av 100.000 SB celler mer än 2 x större än det nummer i 1 x 106 PBMC från samma givare (inga data anges). En visuell scoring av TST reaktionen är den vanligaste kliniska metoden för utvärdering av M. tuberculosis minne. Notera, underliggande adaptiv immunologiska reaktionen inte topp samtidigt som den kliniska hud reaktion2,21. Inte alla BCG-vaccinerade eller Mtb-exponerade individer kommer att utveckla starka TST reaktioner och strategier för klassificering och en hantering av prover från TST icke-responders, liksom en redan existerande mykobakteriella sensibilisering i studiepopulationen, måste beaktas innan en recall rättegång med denna metod. Också, i både SB provtagning och visuella gjorde, det finns en potential för en teoretisk partiskhet hos individer med nedsatt hudreaktioner på grund av globala eller hud-relaterade nedsatt immunitet som sett, exempelvis i HIV-infektion och vissa åldersgrupper2, 13,18,20. Dessutom är en immunologisk öka TST reaktion med upprepad testning välkänd20,22. De SB cell fenotyperna dock ganska konstant när TSTs är upprepad10. Denna observation stöder rollen av SB minns i longitudinella studier av cellulära immunsvaret.
För T-cell Immunologer möjliggör SB recall skörden av hög fraktioner av antigen-specifika celler. Tidpunkten för SB för en provtagning från ett PPD-nedfall är dock kritisk som både cellulära sammansättningen och den cytokin mikromiljö förändras över tid. I detta protokoll, var blåsor inducerad 7-dagars efter utmaning och isolerade celler var primärt effektor minne CD4 + T-celler inklusive hög fraktioner av celler med en samtidig uttryck av IFN-γ, TNF-α och IL-2. Dessa iakttagelser är i linje med tidigare studier som beskriver hur T-cells aktivering, proliferation och differentiering sker i PPD-primade hud2,15,21. Kinetic SB studier PPD-sensibiliserade individer tyder på att mycket tidigt hud svar är Ospecifikt; dock redan inom de första dagarna efter PPD-utmaningen, svaret blir domineras av CD4 + T-celler (båda centrala minne och effektor minne fenotyper har beskrivits) och, efter 3 dagar, svaret domineras av höga fraktioner av PPD-specifika cytokin produktion av CD4 + T-celler2,8,10,15,21. Detta adaptiva cytokin svar urskilj för mer än 2 veckor2,8,10,23. Dag 7 inlägg-TST verkar vara den mest optimala tidpunkten för insamling av cytokin produktion minne CD4 + T-celler2. Andra tidpunkter kan, naturligtvis, dock relevanta beroende på antigen och svar av intresse. Att notera, i en studie, har den adaptiva PPD-reaktionen rapporterats till topp lite tidigare med en minskning i den pro-inflammatorisk cytokin sekretionen redan på 5 dagar post-TST10.
SB vätska innehåller höga halter av både pro-inflammatoriska cytokiner och andra proteiner som visat sig vara representant för huden mikromiljö15,24. Kinetik studier har visat att TNF-α och IFN-γ nivåer i SB flytande topp efter 3 dagar medan IL-2 maximal efter 7 dagar2,10, förmodligen återspeglar herravälden av adaptiv svaren i detta senare skede. Eftersom SB celler har varit aktiverad i vivo, uppvisar de en hög spontana cytokinfrisättning samt en potential för en specifik utgåva vid restimulering (figur 3 och 4).
Denna rapport fokuserar på CD4 + T-cell immunitet. Vilket visas i figur 2, verkligen var majoriteten av de isolerade T-cellerna CD4 +, medan det fanns nästan inga CD8 + T-celler i sugningen blister vätska. Detta är i linje med andra SB PPD-recall studier rapportering låga proportioner och en sämre flyttande kapacitet av CD8 + T-celler jämfört med CD4 + T celler2,8,10,23. En ytterligare karakterisering av CD8 + bidrag skulle vara att föredra; Detta är dock utanför ramen för denna rapport.
T-celler anses väsentliga för immun kontroll av Mtb; Det har dock varit svårt att identifiera en tillförlitlig korrelat av det skydd som återspeglas i det adaptiva immunsvaret från blod25,26. Denna vägspärr hindrar allvarligt utvecklingen av nya TB vacciner, som det för närvarande finns inget alternativ till stora och mycket kostsamma effekt prövningar27. TB vaccin utvecklare avgöra vaccinet immunogenicitets genom att bedöma små och övergående förändringar i vaccin-specifik T-cells populationer i blod28,29. Det är dock tveksamt om bråkdel av cirkulerande antigen-specifika T-celler i blodet är relevanta (dvs.kan migrera till platsen av en infektion och företrädare för T-cell-rika mikromiljö kontrollera Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baserat på tidigare studier och de data som presenteras häri, representerar SB kutan minns modellen outnyttjad potential för studiet av vaccinet-specifika T-celler. Inte bara ger modellen ett återkallande av ett vaccin svar genereras decennier sedan, det låter också utvärderingen av sanna minnet potential i en vävnad-specifika sammanhang15,18,19,21. Roman, specifika hudtester, bland annat antigener som också består av kandidat subenhet TB vacciner, föreslå nya möjligheter för vaccin utvärdering med hjälp av denna modell28,32. Dessutom transcriptomic analyser tyder på att en cell – medlad immunsvar som genereras i PPD-utmanas hud är liknande till svaret i det Mtb-infekterade lung18.
Medan huden punch biopsier också möjliggöra en cell skörd från huden och ge rumslig information, jämfört med SB provtagning, metoden är mer invasiv och kräver enzymatiska eller mekanisk bearbetning att förbereda encelliga suspensioner33. Mätningar av cytokiner och cell markörer är jämförbara mellan de två metoder2,10.
Metoden sug blistret har redan tillämpats i många områden av medicinsk forskning förutom dermatologi, antingen ensamt eller i kombination med en systemisk eller lokal hud utmaning. Exempel är studier av sepsis, Epstein - Barr-virus-associerade lymfoproliferativa sjukdomar, diabetesneuropati, glukokortikoid intag effekter och mänskliga försök testning terapeutiska antikroppar eller modeller för T-cell-riktade terapier10 ,34,35,36,37,38.
Från en terapeutisk synvinkel, metoden SB kutan recall erbjuder unika fördelar för att studera det centrala T-cellen minnet potentiella och -från både en biologisk och teknisk synpunkt-huden verkar ge en relevant provtagning fack2, 15,18,19,21. Särskilt möjliggör jämfört med traditionella, passiv provtagning av cirkulerande PBMC, SB kutan recall metoden studiet av T-celler som har visat förmågan att migrera från lymfkörteln som svar på deras relevanta antigen och slutföra lokalen expansion och differentiering i en vävnadsspecifika i vivo sammanhang15,18,19,21.
Sammanfattningsvis visade modellen här kan vara relevanta för forskare inom området mänsklig adaptiv immunitet och T-cells inriktning ombud (dvs.i infektionssjukdomar vaccinologi eller cancer forskning). TST modellen tillämpas i detta protokoll är, naturligtvis, av särskild betydelse i fältet TB vaccinologi. Grundtanken med denna modell är dock mycket tillämpliga inom andra forskningsområden.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mads Radmer Jensen för hans praktiska och akademiska råd; Lau Lindqvist och Kaare Svejstrup för att tillhandahålla teknisk expertis; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt och Solveig W. Harpøth för deras tekniskt stöd. Personalen på Gentofte TB öppenvårdsmottagningar för sin utbildning i PPD administration; och alla frivilliga för att delta i studien. Detta projektet finansieras av Europeiska kommissionen H2020-programmet [grant nummer TBVAC2020 643381], och vi vill tacka konsortiepartner för de fruktbara diskussionerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
| Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
| Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
| PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
| Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
| Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
| Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
| Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
| Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
| Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
| Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
| Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
| 2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
| Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
| Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
| Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |
References
- Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
- Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
- Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
- Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
- Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
- Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
- Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
- Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
- Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
- Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
- CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
- Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
- Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
- Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
- Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
- Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).
- Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
- Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
- Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
- Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
- Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
- Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
- Flynn, J. L., Chan, J.
- Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
- García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
- Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
- Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340 (2014).
- Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
- Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).
- Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
- He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
- Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
- Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
- Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
- Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
- Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).
