Summary
ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス データを取得するためのプロトコルについて述べる。この情報は、組成やプラント関連の微生物群集の多様性を調査するため、植物種の広い範囲での使用に適しています。
Abstract
植物宿主と病原性菌の親密な相互作用は植物の適応度を決定する上で重要な非生物的ストレスや病気に対する耐性を改善を促進することができます。工場マイクロバイは、非常に複雑な低コストにすることができます、私アンプリコン ベース 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定など高スループット方法が多いその微生物の組成と多様性を特徴付けるため。しかし、そのような実験を行う際の適切な方法の選択は、難しい分析とサンプルと研究間の比較を行うことができますバイアスを減らすため重要です。このプロトコルは、コレクション、土壌、根圏、およびルート サンプルからの DNA の抽出のための標準化された方法論を詳しく説明します。さらに、我々 はこれらのサンプルの細菌群集組成の調査は、確立された 16S rRNA 増幅シーケンス パイプラインを強調表示し、他のマーカー遺伝子のため簡単に適応することができます。このパイプラインは、ソルガム、トウモロコシ、小麦、イチゴ、アガベを含む植物種の様々 な検証されている、植物細胞小器官からの汚染に関連する問題を克服するを助けることができます。
Introduction
プラント関連内細菌叢解析は細菌、古細菌、ウイルス、菌類および他の真核微生物から成る動的で複雑な微生物群集から成っています。よく研究植物の病気の原因ではなく、植物共生微生物できますも積極的に影響を与える植物の健康によって生物的・非生物的ストレス耐性の向上、栄養アベイラビリティを推進・強化による植物の成長植物ホルモンの生産。このため、特定の関心は植物根 endospheres、根圏、周辺土壌と関連付ける分類群を特徴付けるに存在します。一方、いくつかの微生物は、生成されたメディアを研究室で分離培養することができます、多くはできない、他の微生物と共生関係に依存している場合がありますので、一部非常にゆっくり育つまたはラボ環境では再現できない条件を必要とします。栽培の必要性を回避できますので、比較的安価な高スループット シーケンスを用いた系統プロファイリング環境とホスト関連付けられている微生物サンプルの微生物群集を試金するため最寄り方法となっています。組成物。
次世代シークエンシング (NGS) のプラットフォーム1各種によって提供される適切なシーケンス テクノロジーの選択は、重要な要因を含むユーザーのニーズに依存して: 必要なカバレッジ、私アンプリコン長さ予想コミュニティ多様性と同様、誤り率、読み取りの長さ、および、コスト-あたり-実行/megabase のシーケンスします。私アンプリコン ベースのシーケンス実験で考慮する必要があるもう一つの変数がどのような遺伝子が増幅され、どのようなプライマーが使用されます。設計またはプライマーを選択するとき、研究者は結果の産物から達成可能な増幅の普遍性と分類学的解像度のトレードオフを作るを強いられる。このため、研究のこれらのタイプは、しばしばプライマーと、マイクロバイの特定のサブセットを選択的にターゲット マーカーを選んだ。細菌群集組成の評価は一般的に細菌の 16S rRNA 遺伝子2,3の超可変領域の 1 つ以上のシーケンスで実行します。本研究では、私アンプリコン ベースについて述べるシーケンス プロトコルはそのターゲット、500 bp V3 V4 の領域に十分な可変性を提供しながら細菌種の広範な増幅を可能にする細菌の 16S rRNA 遺伝子の NGS プラットフォーム用に開発。異なる分類群の間を区別します。さらに、このプロトコルは簡単に他のプライマー セットなどの菌類の ITS2 マーカーや真核生物の 18S rRNA サブユニットをターゲットで使用するために適応できます。
他に近づくような散弾銃メタゲノム、メタトランスクリプトミクス、および単一セルの配列を提供する解決の微生物ゲノムとコミュニティ機能のより直接測定を含む他の利点と、これらの技術が通常より多く高価で、ここで説明した系統プロファイリング4よりも計算量の多い。また、宿主植物ゲノムに属する読み取りの大部分をもたらすルート サンプルに散弾銃メタゲノムおよびメタトランスクリプトミクスを実行して、この制限を克服する方法はまだ開発5,6をされています。
実験プラットフォームでも私アンプリコン ベースのプロファイリングは、実験デザインとデータ解析時に考慮すべき潜在的なバイアスの数を導入できます。検体の採取、DNA 抽出、PCR のプライマーの選択およびライブラリの準備を実行する方法のメソッドが含まれます。さまざまな方法は、生成されると、使用可能なデータの量に大きく影響することができますや、また研究間で結果を比較するための努力を妨げることができます。たとえば、根圏細菌7と異なる抽出技術の使用または DNA 抽出キット8,9の選択を除去する方法につながる下流解析に大きく影響する示されています。異なる結論に関して、微生物が存在し、彼らの相対的な存在量。私アンプリコン ベースのプロファイリングをカスタマイズすることができます、ので研究間で比較することが挑戦することができます。地球マイクロバイ プロジェクトのアプリケーションによって引き起こされる変動を最小限に抑える手段として標準化されたプロトコルの開発からプラント関連マイクロバイなど複雑なシステムを調査している研究が恩恵を示唆しています。研究10,11の間さまざまな方法。ここでは、我々 は上記のトピックの多くについて説明し、場所をベスト プラクティスとして提供提案が適切な。
プロトコルは、ソルガム確立された DNA 分離キット11を使用して抽出 DNA からの収集土、根、およびルート サンプル処理を示します。さらに、我々 のプロトコルには、細菌群集12,13,14の構造を決定する一般的利用 NGS プラットフォームを使用して詳細な私アンプリコン シーケンス ワークフローが含まれています。このプロトコルは、根、根、ソルガム、トウモロコシ、およびコムギの15を含む 18 の単子葉種の関連付けられている土壌の最近出版された調査で植物のホストの広い範囲で使用するために検証されています。このメソッドが他のマーカー遺伝子を使用も検証されたリュウゼツラン マイクロバイ16,17いちごマイクロバイに関する研究真菌 ITS2 マーカー遺伝子を勉強への適用によって示されるように18。
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Protocol
1. 収集とルート Endosphere、根、土壌試料の分離
- 滅菌オートクレーブ純水 (サンプルあたりの水の少なくとも 90 mL) フィールドを入力する前に。着生植物の除去バッファー (サンプルあたり少なくとも 25 mL) を準備するには、1 L の滅菌水に KH2PO4の 6.75 g、K2HPO4、8.75 g およびトリトン X-100 の 1 mL を追加します。0.2 μ m の細孔径を持つ真空フィルターを使用してバッファーを滅菌します。
- ステップ 1.2 から 1.5] エタノールで滅菌クリーン手袋を着用回、汚染を防ぐために各サンプル間手袋を交換します。70% エタノールですべての機器を滅菌し、サンプル間のすべての機器をきれいに拭きます。サンプリングの前にあなたの実験のための最適なサンプリングの深さを決定して、根と土壌のすべてのコレクションと一致します。
- 一括土壌サンプルを収集するには、コアを集めることによって無料で植物の根が土壌を取得する、エタノール殺菌土壌コアのコレクターを使用して、植物の根元から約 23 〜 30 センチ。
- ビニール袋に土を転送、穏やかな揺れで土を均質化し、1 つ 2 mL チューブに合わせて土壌サンプル (約 600 mg) の因数を転送します。フラッシュ (ステップ 2) の DNA の抽出を続行する準備ができるまでのリキッド N2管の凍結またはすぐにドライアイスを 2 mL 管を配置します。
- 一部の環境で、周囲の土壌は植物材料を含めることができます。この場合、ビニール袋にそれを配置する前に土壌から植物の残骸を分離する滅菌の 2 mm のふるいを使用します。
- 根と根を収集するには、限り多くできるだけルートの取得に注意しながら、植物を掘るエタノール殺菌のシャベルを使用します。深さは植物に依存しています。小麦など小さな植物を削除するには、いくつかのセンチを掘り、ソルガムなどのより大きい植物が 30 cm 以上必要となります。根面に付着した土の約 2 mm になるまで優しく根から余分な土壌を振り払います。
注: 小さな植物、壊れやすい根、乾燥、高粘土コンテンツ土壌を使用するとき注意してください。理想的には、揺れの後残りの根を土の薄層、だけ必要があります存在。土壌の大きな凝集体のまま、ゴム製木槌がシュートの基部を軽く押すことで土を除去するため使用できます。このプロセスの後の残りの土の量を超えたり、2 mm を下回る場合は、おおよその厚さを注意しなければなりません。 - 大きい植物の根の代表的な部分をカットし 50 mL コニカル バイアルに最低 500 mg 根組織の滅菌はさみ/大ばさみを使用します。小さい草は、バイアルに全体のルート システムを配置します。根をカバーし、すぐにドライアイスのサンプルを配置する十分な着生植物除去バッファーを追加またはフラッシュ凍結液 N2のサンプル。
注意: 洗浄ステップを困難にするが、50 mL コニカル バイアルを詰め込み過ぎないようにして注意してください。着生植物のバッファーが下に流れ、バイアル中の根を囲む、上部をカバーすることができるように、十分な空領域があるはずです。いくつかの草がより多くのルート バイオマス 50 mL コニカル バイアルに収まるよりもあるため、根の部分を収集します。しかし、生菌根端数に流失につながる根を切断、ので根を破壊を最小化する必要があります注意する必要があります。-80 ° C で格納できるサンプルが研究室に戻った後すぐに処理されない場合 - 根から根圏を分離する氷の上ルート サンプルを解凍し、超音波照射 30 160 W のパルスと 10 分のための 4 ° c ルート サンプル秒、区切って 30 s. 転送根冷蔵 (4 ° C) に、きれいに滅菌鉗子を使用して 50 mL のチューブ。バッファーと土壌では根圏の分数 (図 1) オリジナル チューブを捨てないでください。
- バッファーを含むチューブを遠心し、根圏 4,000 x g.、上清をデカント、4 ° C で 10 分間のフラッシュのため液 N2根画分を含む管を凍結、DNA を続行する準備ができるまで-80 ° C で根の一部を保存抽出 (ステップ 2)。
- 根を洗って、ルートの分数に冷蔵 (4 ° C) 滅菌水約 20 mL を追加します。積極的に (によって手やミキサー、15-30 s) を揺することによってルートを洗って水を排水します。
- 根の表面に土が残っていないまでに少なくとも二回、この手順を繰り返します。DNA の抽出 (手順 2) をすぐに実行しない場合、滅菌アルミホイルで根を包んで、フラッシュ凍結液 N2ストアまで-80 ° c のサンプルは、DNA の抽出を続行する準備ができての根。
2. DNA の抽出
注: 手順 2 および 3、全体クリーンなエタノールで滅菌手袋をすべての回で、エタノールで殺菌表面上ですべての作業を実行します。
- 土壌および根圏のサンプルから DNA を抽出します。
- 使用手順 1.3 1.7 から個別のコレクションの管に土と根の 250 mg をすばやく転送する滅菌ヘラが商業 DNA 分離キットで提供される土壌からの抽出のために設計し、キットのサプライヤーを使用して DNA の隔離を続行プロトコル。
- DNA 分離キットによって提供される溶出バッファーで DNA を溶出した後手順 3 を続行する準備ができるまで、-20 ° C で DNA を格納します。
- ルート サンプルから DNA を抽出します。
- 滅菌の乳鉢と乳棒リキッド N2を使用して冷やします。根組織の 700 に 600 mg を測定し、モルタルに組織を配置します。慎重に、十分な液体 N の2根をカバーするために追加します。
- 小さな断片に根を挽きます。リキッド N2を追加して、研磨のプロセスを続行 (2 回以上がサンプル間で一貫して)、根が細かい粉になるまで。根組織でこの手順中に解凍しないことを確認します。
注意: 使用する場合適切な個人用保護具 (白衣、防護用の眼鏡と低温手袋) リキッド N2での作業します。
注: 低品質の DNA の抽出のことができます余分な根をひいて粉にし、-80 ° C で粉を格納する有益です - すぐに、ルートの前に粉は雪解け、滅菌スパチュラを使用して氷の前体重 1.5 mL チューブに根の粉末を転送を開始します。チューブと粉末の重量を記録します。通常、粉末の 300-400 mg が転送されます。
- 使用商業 DNA 分離キットで提供されるコレクションの管に根の粉末の 150 mg をすばやく転送する滅菌ヘラは土壌からの抽出のために設計し、キット サプライヤーのプロトコルを使用して DNA の隔離を続行します。
注: いくつかのルートのサンプルができます PCR 場合は特に、異なる DNA の抽出のプロトコルの間に DNA の増幅を防ぐ DNA の餌の残りの有機物の高濃度 (e.g。、CTAB 抽出) が使用されます。必要な場合は、環境 DNA クリーン アップ キットで提供される指示に従い、DNA をきれい。
- 高感度卓上型蛍光光度計を使用してすべての DNA サンプルの濃度を測定します。
- DsDNA 高感度アッセイ キットで提供される管に各溶出の DNA サンプルの 1 20 μ L を追加します。200 μ L まで蛍光光度計作業ソリューション (1: 200 染料: バッファー) を追加します。
- 標準 2 (100 ng/μ L)、DNA 標準 1 (0 ng/μ L DNA) または 10 μ L の 10 μ L を含む 2 つの追加のチューブを用意し、蛍光光度計作業ソリューションの 190 μ L を各標準に追加します。
- 基準と各サンプルの濃度を測定します。それは自動的に行われない場合は、2 つの規格の線形回帰によって吸光度出力から DNA 濃度を計算します。
3. 私アンプリコン ライブラリの準備と提出
- 増幅反応のための材料を設定します。
- 4 ° c の DNA のサンプルを解凍し、手順 3 で氷のそれらを保ちます。PCR プレート (表 2) の場所のためのバイアスを最小限に抑えるために DNA のサンプルの順序をランダム化します。
- 96 ウェル PCR プレートにグレード分子水の各サンプルから DNA を増幅 (空白) (表 2) のネガティブ コントロールとして 20 μ L。 追加 20 μ L の 4 つのコーナーの井戸に水を分子グレードの総量 5 ng/μ L に希釈します。
- マルチ チャンネル ピペット (図 2) を追加できるような PCR ストリップ管または 96 ウェル プレートでバーコード プライマー (10 μ M) を配置します。
- 十分な 3 通の各 DNA サンプルを増幅する PCR マスター ミックスを準備します。BSA (20 mg/mL) の 1.5 μ L、既製の 2 × マスター ミックス ( Taq DNA ポリメラーゼ、dNTPs、MgCl2PCR バッファーの構成) 37.5 μ L、葉緑体 PNA の 0.57 μ L を準備 (100 μ M)、ミトコンドリアの PNA の 0.57 μ L (100 μ M)、および分子グレード水 25.86 μ L。
- マルチ チャンネル ピペット貯水池の滅菌 25 mL にマスター ミックスを注ぐし、マルチ チャンネル ピペットを使用して新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルにマスター ミックスの 66 μ L を配布します。
メモ: マスター ミックス試薬量の計算している場合、は、プレートごと 4 空井戸も含めるようにしてください。 - マルチ チャンネル ピペットを使用して、5 ng/μ l の DNA (正規化された DNA プレート) からマスター ミックス プレートを 6 μ L を追加します。各列が異なる前方バーコードがあり、各行が異なるリバース バーコード (図 2) プライマーをリバース 10 μ M の 1.5 μ 10 μ M 前方プライマーのマスター プレート 1.5 μ L に追加します。
注: プライマーを追加する前にランダム化されたプレートとマスター ミックスされる可能性があります異なるプライマーを追加した場合、ITS や ITS2 真菌遺伝子を増幅します。この場合、同様のプライマー設計を使用できます。 - 3,000 x g に簡単にプレートのスピンダウンは、優しく、ミックスし、反応混合物の 25 μ L で 3 つのプレートに分割マルチ チャンネル ピペットを使用します。
注: 3 つのレプリケートは厳密には必要ないが、技術の変動の影響が低下します。
- たちの次の条件に設定を使用して各板の DNA を増幅する: 180 s 98 ° C で、30 のサイクル: 98 ° C、45 s (変化)、10 の 78 ° C (PNA アニール) s、55 ° C、60 s (プライマーアニー リング)、および 90 のための 72 ° C s (拡張子)、その後、600 s 72 ° c 4 ° C に続いてホールド ステップ。増幅後、1 つの単一の 96 ウェル プレートに 3 つの複製版をプールします。
- 96 ウェル プレート リーダーの高感度蛍光光度計試薬を用いた DNA を定量化します。
- 96 ウェル マイクロ プレート、蛍光光度計作業ソリューション (1: 200 染料: バッファー) 98 μ と共に各 PCR の製品の 2 μ L を追加します。標準として 4 井戸があります: DNA 標準 1 の 5 μ L (0 ng/μ L DNA)、1 μ L の標準 2 (10 ng/μ L)、標準 2 (20 ng/μ L)、2 μ L、5 μ L 標準 2 (50 ng/μ L) の。100 μ L の最終巻の蛍光光度計作業ソリューションを加えます。
注: 各サンプルは、プレート リーダーが使用できない場合、2.3 の手順で説明されているようにベンチトップ蛍光光度計を使用して測定できます。 - 4 つの標準の線形回帰によって吸光度出力から DNA 濃度を計算します。
- 正常に増幅されたバーコード (これら 15 ng/μ L を超える濃度にしている)、製品プール 100 シングル 1.5 mL チューブ (表 2) に各サンプルの ng。
- スプレッドシート プログラムで =AVERAGE() 関数を使用してプールに追加するサンプルの平均数量を計算します。御府内に「空白」の PCR の製品の量を追加します。
注:「空白」の PCR の製品は、独自の一意のバーコードの組み合わせを持っている、ので、実験室汚染物をチェックするために配置できます。
- 96 ウェル マイクロ プレート、蛍光光度計作業ソリューション (1: 200 染料: バッファー) 98 μ と共に各 PCR の製品の 2 μ L を追加します。標準として 4 井戸があります: DNA 標準 1 の 5 μ L (0 ng/μ L DNA)、1 μ L の標準 2 (10 ng/μ L)、標準 2 (20 ng/μ L)、2 μ L、5 μ L 標準 2 (50 ng/μ L) の。100 μ L の最終巻の蛍光光度計作業ソリューションを加えます。
- ステップ 2.3、および DNA の取る 600 ng の説明に従ってベンチトップ蛍光光度計を使用してプールの製品の濃度の測定し、分子グレード 1.5 mL チューブに 100 μ L の最終巻に水で希釈します。-20 ° C で残りのプールの保管します。
- いくつかの例外を除いて 96 ウェル形式で常磁性精製ビーズ確立された PCR 精製プロセスに従う 600 ng DNA 分注を洗ってください。
- 70% のエタノールの因数新鮮な 600 μ L を作る。底に沈殿ビーズを再停止する磁気ビーズのボトルを振る。
- DNA の 600 ng 因数にビーズ ソリューションの 1 x ボリューム (100 μ L) を追加します。10 回のピペッティングにより徹底的にミックスします。室温で 5 分間インキュベートします。
- マグネット スタンドを 2 分間 (またはソリューションがクリアされるまで) にチューブを配置ソリューションからビーズを分離します。マグネット スタンドのチューブでは、磁性ビーズに触れることがなく慎重に明確な上清を吸引、明確な上澄みを廃棄します。
注: この時点で、私アンプリコン製品は、磁性ビーズにバインドされます。邪魔紛失中の誤嚥は、すべてのビーズは、DNA の損失になります。 - マグネット スタンドでチューブを残して、管; 70% のエタノールの 300 μ L を追加エタノールと破棄を 30 s. 吸引室温で孵化させなさい。このプロセスを繰り返し、2 番目の洗浄後すべてエタノールを取り外します。マグネット スタンドからチューブを外し、エアーで 5 分間乾燥させます。
- 乾燥ビーズにグレード分子水の 30 μ L を追加し、10 回のピペッティングで混ぜます。ソリューションからビーズを分離する 2 分 1 分のマグネット スタンドにリターン チューブの室温で孵化させなさい。溶出液を新しいチューブに転送します。
注: 磁気ビーズは下流の反応を影響しません。
- 掃除、2.3 の手順で説明されているようにベンチトップ蛍光光度計を用いたプールされた DNA の最終濃度を測定します。10 因数を希釈濃度、30 μ L の最終巻でボリューム シーケンス機能によって優先 nM。
- NGS のプラットフォーム、300 bp ペアエンド シーケンス x 2 で DNA のシーケンスにシーケンス処理施設のサービスを利用します。
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Representative Results
推奨されるプロトコルを実行する必要があります結果、データセットの各サンプルに戻る一致し、いずれか細菌に代入することができますインデックス付きのペアエンド リードの操作分類単位 (乙) または順序の変形 (ESV、増幅とも呼ばれますシーケンス バリアント (ASV) と sub-operational 分類単位 (sOTU)) は、下流の分析によって異なります。高品質シーケンス データを取得するためにサンプル間の整合性を維持し、サンプル処理やライブラリの準備の間に任意の潜在的なバイアスの導入を最小限に抑えるために各ステップで注意する必要があります。収集した後、処理、および (手順 1 と 2) のサンプルから DNA を抽出すると、はっきりと増幅を抑制すると有機物の無料結果溶出液が表示されます。微量分光光度計による各 DNA のサンプルを測定することにより純度を確認ことができます、我々 は土壌 DNA 抽出キットがすべての汚染物質を確実に削除することを発見しました。予測可能な DNA の品質結果特異 DNA を結合する蛍光ベースの染料に依存して定量化方法が紫外線吸光度19,20,21に基づくものよりも適切。PCR の拡大の前に土と根のサンプルの平均約 10 ng/μ L の DNA、ルート サンプルは通常約 30 ng/μ L (表 2) の平均濃度を持っています。
次の環境 DNA (ステップ 3) の拡大、成功または失敗をプレート リーダーのベンチトップ蛍光光度計試薬経由で PCR の製品の濃度を測定する場合は、によって定めることがまたは手動で (表 2)。我々 の経験で高品質私アンプリコン データで結果成功した増幅収量 15 ng/μ L の PCR の製品よりも大きい。板上に複数の障害が存在する場合、問題を特定工場と失敗したサンプルのサンプル入力位置の配置が役立つことがあります。たとえば、すべてのプレートに隣接する場合は、すべて同じ行または列の場合は、それは特定のプライマーとの問題を示唆に対しピペット エラーを示す場合します。すべて同じサンプル タイプに属する場合、それはサンプル処理または DNA の抽出の問題を提案するかもしれない。
葉緑体やミトコンドリア 16S 遺伝子の増幅をブロックすることを確認するために実験的なデザインの中にあなたの特定の植物のシステム bioinformatically とユニバーサルの PNAs の互換性を確認することが重要です。次の増幅ステップは不明だか、PNAs 正常にバインドにミトコンドリアと葉緑体のテンプレート;これは、(図 3) をシーケンス処理した後のみ明らかです。PNAs が汚染拡大、各葉緑体とミトコンドリア 16S rRNA 遺伝子 (複数あります) 工場の PNA シーケンスの線形を効果的にブロックされますを確保するために検討されているホストを明らかにしないで任意の不一致.PNA クランプの途中で特に 13 bp PNA シーケンスにも単一の不一致が指定された葉緑体 PNA シーケンスの場合とアキノノゲシ(レタス) (の葉緑体の 16S rRNA 遺伝子のように、有効性を大幅に削減できます。図 3)。
以来、増幅された DNA の同量は、必要があります読み取り数が約も得られるごとにサンプル シーケンスと読み取り、バーコード インデックス (図 4) に基づいてを並べ替え後サンプル、そこあたりプールです。これらの読み取りの大半は細菌の分類群に一致させてください。どんな真核生物、ミトコンドリア、葉緑体の一致を破棄する必要がありますか。解析パイプライン、選択した分類のデータベースによって葉緑体とミトコンドリアの読み取り誤ってに割り当てられます細菌系統、しばしばシアノ バクテリアとRickesttia、それぞれ (図 3)。手動キュレーションの程度は、これらの一般的なミスの割り当てをチェックするが賢明されます。特定の詳細分析、選択によって異なりますが、相対的な豊富なプロファイルは一般的に類似する必要があります (有意差なし) 生物の複製中、土壌、根圏、およびルート サンプル (図 5 間に有意な).ただし、生物学的複製間に有意差があるかもしれない、それはあたりの少なくとも 3 つの複製を収集するために重要なことが重要です。
これらの実験で得られたデータを解釈する方法は、微生物生態学者の間で激しく議論されています。最近まで、私アンプリコン シーケンス解析は OTUs に読み取りをグループ化に依存されています。しかし、これらが問題となるため: 1) 97% 類似の幾分任意のしきい値に基づいている、2) 多様性はしばしば過小評価され、3) 低の分類学的解像度をすることができます。最近 DADA2、不鮮明さを除く、および UNOISE222,23,24などの開発ツール、ESVs、OTUs を使用するときに表示されるいくつかの問題を解決するに読み取りを並べ替えることができます。ESVs を使用する注意点があります: PCR とシーケンス エラー25,26種、および 2) 感度内 rRNA コピーの違いによる多様性 1) 人工増加。
図 1: ルートと根分画の分離します。フローチャート削除任意の残りの根面の菌を滅菌水で根を洗浄が続くルート サンプルから根を分離するための手順を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 増幅とプレート内の分布のための株式入門レイアウトの例です。ストックのプライマー (表 1) に備えて 96 ウェル プレート (各プライマーのストリップが異なる色で表されます; 前方プライマー 1-8 の紫のオレンジの転送プライマー逆プライマー 1 12 9-16 青内最適配分ストリップ管、緑の逆プライマー 13-16 とします。)この場合、16 前後 16 逆プライマー配布できます効率的にマルチ チャンネル ピペットでそれぞれはよくユニークなバーコードの組み合わせがあるような。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 葉緑体 PNA が有効ではないことを示す結果。根圏 (「植物」)、根、および非投与 (NT) または生物的土壌改良処理 (VT) レタスから土壌サンプルから代表的な結果。ほとんどの植物の葉緑体汚染をブロックするために使用 PNA シーケンスは、GGCTCAACCCTGGACAG27です。しかし、レタスには、葉緑体の 16S リボソーム RNA 遺伝子 (GGCTCAACTCTGGACAG) の不一致が含まれています。これは、効果が、根と根の試料中にシアノ バクテリアと一致する読み取りの高い相対的な豊かさの結果、PNA をレンダリングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ライブラリのサンプル間で読み取りの分布をカウントします。数を示す棒グラフの読み取りでバーコードの組み合わせに一致する別のサンプル (棒、x 軸) からカウント (y 軸) を読みます。サンプルごとの読み取り数サンプルの数は、ライブラリによって異なることがこのサブセットは 192 サンプルのライブラリに配列されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ルート、根、土壌地域でトップ 12 クラスの相対的な豊かさ。6 を含む代表 16S データセット内に存在するクラスの相対量を示す積み上げ横棒グラフは、各サンプルの種類 (一括土、根、およびルート endosphere) のレプリケートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 16 s rRNA 遺伝子 V3 V4 地域を増幅用プライマー 。プライマーの順番で構成されます: シーケンシング、および普遍的な PCR プライマー 341F または 785R の 16S rRNA 遺伝子を増幅するためのフレームをシフトする NGS の共通プラットフォーム、ユニークなバーコード、NGS のプライマー、スペーサー領域可変長のためのアダプター。プライマーの必要数はライブラリあたりシーケンス処理されたサンプルの数に依存16 前後 16 逆プライマーの組み合わせは、244 サンプル (256 通りのプライマー組み合わせ 12 PCR (図 2) の間に空白の井戸の使用) のために十分です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
表 2: ランダム化された DNA の正常化サンプルを増幅し、前にします。ランダムにサンプルを一覧表示とそれに割り当てるプライマーの組み合わせを決定する単一の 96 ウェル プレート上の位置を示すワークシートの例。最下行の数式は 100 を追加するための計算を記述する各サンプルを正規化されたプレート プラス 20 μ L に到達する水の容積の ng。次の 100 のボリューム増幅成功した製品ごとの ng は計算され、最終的なプールに追加されます。最後のプールに追加する「空白」の PCR の製品の量は、他のサンプルの平均です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 1: サンプル コレクション.中に最小根バイオマスの近似とき収集ルートは、組織の少なくとも 500 mg を収集してみてください。根が若いソルガム工場から収集ここでは、(両方の左 A と B)、(A) と (B) 50 mL コニカル チューブ内へ若い水稲 (右) が表示されます。両方のサンプル約 1 グラムの重量を量る、ただし、この重量、根や根で根の重量は、このケースでは、総重量を約半分あることに注意することが重要です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、ルート endosphere、根、およびサンプル処理し、下流配列にサンプリング、フィールドからの土壌微生物群集組成の基礎の確立されたパイプラインを示します。勉強ルート関連内細菌叢解析特有の課題、ため一部サンプリングの固有の難しさへの土壌から。土壌は非常に物理的・化学的性質の面で変数と異なる土壌条件はわずか数ミリ28,29によって分けることができます。これはかなり異なる微生物群集の組成を持ち、活動30,31隣接するサンプリング サイトから集めたサンプルにつながることができます。したがって、土壌コアのコレクターやシャベルを使用して一貫性のあるサンプリングの深さと DNA の抽出の前に均質化ルート マイクロバイ研究内再現性に不可欠ですを維持します。根と根分画で; を効率的に分離も欠かせません過酷なルート表面殺菌法を用いた潜在的分離エンドファイト DNA の抽出の前に根の内でより保守的な洗浄が根表面7からすべての微生物を削除可能性があります。否定的に影響を与えるまたはシーケンス結果を混乱させることができます別の重要要因は細菌の汚染は、多くのソースから来ることができるし、時々 サンプルの環境細菌32,33から区別することはできません。このため、慎重な滅菌サンプリング ツール、実験材料、作業環境が汚染を避けるために不可欠です。
サンプリング後、は、高品質の DNA を取得成功した下流解析の優先度の高いです。CTAB ベース抽出などの代替手段を通してルート サンプルを成長のフィールドからの DNA の抽出には我々 の経験での大幅により多量腐植酸と根と土のサンプルと比較して他の化合物にはが含まれています。これらの化合物は低濃度34,35でも、PCR の拡大の間に DNA のポリメラーゼの酵素の活性を防ぐことができます。DNA 抽出キット土壌フェノール続いて CTAB 抽出ではなく、ルートのサンプルのために設計されたクリーンアップをクロロホルム、腐植酸のサンプルを効果的に取り除くことができます、高品質 DNA36,37,になりますを使用して38,39。したがって、ルート サンプル同様の市販 DNA 抽出キットを使用をお勧めします。植物の根から微生物のゲノム DNA を取得する目的であることに注意してください。したがって、徹底的かつ一貫したルート研削は、植物組織を分解し、研磨圧力と時間の差が、サンプル間のバイアスを導入することがなく微生物の DNA を解放する微生物細胞を溶解することが重要です。
以下のサンプルからの DNA の抽出を注意、増幅中に問題の 2 つの主要な源がある: 1) 植物共生 (葉緑体とミトコンドリア) と 2) を増幅する 16S rRNA 領域の選択と植物組織の汚染。増幅から葉緑体やミトコンドリア 16S rRNA シーケンスを生成できます > ルートでシーケンスの 80% の40、サンプルし、より, 葉身への汚染の量がプライマーの選択に依存します。したがって、植物ホスト葉緑体とミトコンドリア 16S 汚染27,41を抑制する PCR のステップ中に、PNA のクランプが必要です。ただし、異なる植物種は葉緑体とミトコンドリア 16S シーケンス27; 変化を持つことができます。したがって、植物ライブラリ シーケンスの前に代替の PNA oligos を必要なかどうかを決定するために検討されている (図 3) のミトコンドリア 16S 遺伝子と葉緑体のシーケンスを確認するため不可欠です。さらに、16 s rRNA 遺伝子は 9 つの保守的な地域に挟まれた 9 の超可変領域で構成されています異なる結果は、どの領域が増幅42によって同じコミュニティから入手できます。前の研究は、その他広範なマイクロバイ調査11使用されています分類43とそれを割り当てる最も信頼性の高い 1 つである V4 地域を発見しました。変動、分類学的分解能を向上させるためここで V3 V4 地域にターゲットを延長が示唆されました。
このプロトコルでは、環境試料12の微生物群集の組成を研究するため次世代シーケンシング (NGS) によって 16S rRNA 増幅シーケンスを実行するパイプラインを示しました。それは比較的安価、高スループット、計算ノウハウや分析するリソースは必要ありませんので系統プロファイリング用ツールとして私アンプリコン シーケンスを使用をお勧めします。本手法は、マイクロバイの細菌の割合を分析に焦点を当てて、菌類を調査する簡単に適合できます。プロトコル、手順 2、すると、手順 3 で唯一の違いは、増幅時に使用されるどのようなプライマーです。しかし、それは何の価値が私アンプリコン ベース プロファイリング制限なしはないです。単一のマーカー遺伝子を配列することによってコミュニティの機能に関する情報を取得はありません。さらに、環境, 微生物の割合が高いから配列するとき特に分類学的解像度は非常に低く、できます。シーケンス テクノロジーが急速に進化しているし、このプロトコル シーケンスの他のプラットフォームで使用するために適応させることによってこれらの欠点のいくつかに対処する可能性を見込んでいます。最後に、導入で述べたように、散弾銃メタゲノムとメタトランスクリプトミクスが簡単に行えます土壌と根のサンプルと植物組織からの植物の汚染を除去する方法は現在検討されています。実験デザイン ペア私アンプリコン ベース手法と他のメタゲノム技術することができます、イチイの不均一な表現と高い種多様性防ぐことができる散弾銃データから正確に複雑なコミュニティに特に効果的以下を特徴付ける支配的なメンバー。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、米国農務省アルス (CRIS 2030-21430-008-00D) によって賄われていた。TS は、NSF 大学院研究フェローシップ ・ プログラムによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
