Summary
Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.
Abstract
La interacción íntima entre la planta huésped y microorganismos asociados es crucial en la determinación de aptitud de la planta y puede fomentar mejor tolerancia a estreses abióticos y enfermedades. Como el microbioma de la planta puede ser muy compleja y de bajo costo, alto rendimiento métodos tales como secuenciación basada en productos del gene del rRNA 16S se prefieren a menudo para caracterizar su composición microbiana y diversidad. Sin embargo, la selección de la metodología adecuada al llevar a cabo tales experimentos es fundamental para reducir los sesgos que se pueden hacer análisis y comparaciones entre las muestras y estudios difíciles. Este protocolo describe en detalle una metodología estandarizada para la colección y extracción de ADN de muestras de suelo, rizósfera y raíz. Además, destacar una tubería bien establecida 16S rRNA amplicon secuencia que permite la exploración de la composición de comunidades bacterianas en las muestras y puede ser fácilmente adaptados para otros genes marcadores. Este gasoducto ha sido validado para una gran variedad de especies de plantas, incluyendo sorgo, maíz, trigo, fresa y agave y puede ayudar a superar problemas asociados con la contaminación de los organelos de la planta.
Introduction
Microbiomes asociada a la planta consisten en dinámicas y complejas de las comunidades microbianas de bacterias, arqueas, virus, hongos y otros microorganismos eucariotas. Además de su función bien estudiado como causa de enfermedad de plantas, microbios asociados planta pueden influir también positivamente en sanidad vegetal por mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos, promover la disponibilidad de nutrientes y mejorar el crecimiento de las plantas a través de la producción de fitohormonas. Por esta razón, existe particular interés en la caracterización de los taxa que se asocian con la planta raíz endospheres, rhizospheres y el suelo circundante. Mientras que algunos microbios pueden ser cultivadas en aislamiento en laboratorio generado medios de comunicación, muchos no pueden, en parte porque puede depender de relaciones simbióticas con otros microorganismos, crecen muy lentamente, o requieren condiciones que no pueden repetirse en un entorno de laboratorio. Porque evita la necesidad de cultivo y es relativamente barato y de alto rendimiento, perfiles filogenéticos basados en la secuencia de muestras ambientales y asociado anfitrión microbianas ha convertido en un método preferido para el análisis de la comunidad microbiana composición.
La selección de tecnologías de secuenciación adecuada proporcionada por varios generación sequencing (NGS) plataformas1 depende de las necesidades del usuario, con factores importantes como: la cobertura deseada, longitud del amplicón, espera que la comunidad diversidad, así como tasa de error, lectura de longitud y el costo-por-run/megabase de secuenciación. Otra variable que debe considerarse en los experimentos de secuenciación basada en productos es lo que gene se amplificarán y qué iniciadores se utilizará. Al diseñar o elegir cebadores, los investigadores a menudo se ven obligados a hacer realizables de los amplicones resultante entre la universalidad de la amplificación y la resolución taxonómica. Por esta razón, este tipo de estudios eligió a menudo cartillas y marcadores dirigidos selectivamente a subconjuntos específicos de la microbioma. Evaluación de la composición de comunidades bacterianas comúnmente se logra ordenando uno o más de las regiones hipervariables de bacteriano 16S rRNA gene2,3. En este estudio, describimos un amplicon basado en protocolo de secuenciación desarrollado para una plataforma NGS esa región de bp V3-V4 de objetivos el 500 del gene del rRNA 16S bacteriano, que permite la amplificación amplia de taxones bacterianos mientras que también proporciona suficiente variabilidad para distinguir entre diferentes taxones. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el uso con otros conjuntos de la cartilla, como los dirigidos al marcador ITS2 de hongos o la subunidad rRNA de 18S de los eucariotas.
Mientras que otros enfoques tales como metagenómica de escopeta, metatranscriptomics y secuenciación unicelular, ofrecen otras ventajas incluyendo genomas microbianos resueltos y medición más directa de la función de la comunidad, estas técnicas son generalmente más caro y cálculo intensivo de los perfiles filogenéticos describen aquí4. Además, realizar escopeta metagenómica y metatranscriptomics en muestras de raíz produce un gran porcentaje de lecturas que el genoma de la planta huésped, y métodos para superar esta limitación todavía están siendo desarrollados5,6.
Como con cualquier plataforma experimental, basada en productos de perfiles pueden introducir a una serie de sesgos potenciales que deben considerarse en el análisis de datos y diseño experimental. Estos incluyen los métodos de recogida de muestras ADN extracción, selección de iniciadores PCR, y cómo se realiza la preparación de la biblioteca. Diferentes métodos pueden afectar significativamente la cantidad de datos utilizables generados y también pueden obstaculizar los esfuerzos para comparar resultados entre estudios. Por ejemplo, el método de eliminación de bacterias de rizósfera7 y el uso de técnicas de extracción diferentes o elección de ADN de8,de kits de extracción9 han demostrado a un impacto significativo en análisis posteriores, que conduce a conclusiones diferentes sobre cuáles microbios están presentes y su abundancia relativa. Desde perfiles basados en los productos pueden ser modificado para requisitos particulares, puede ser difícil hacer comparaciones entre los estudios. El proyecto del microbioma de tierra ha sugerido que los investigadores estudiando sistemas complejos como el microbioma asociado de planta beneficiaría el desarrollo de protocolos estándares como un medio de reducir al mínimo la variabilidad causada por la aplicación de diferentes métodos entre los estudios10,11. Aquí, discutimos muchos de los temas mencionados y ofrecen sugerencias sobre las mejores prácticas de donde proceda.
El protocolo muestra el proceso de recoger muestras de suelo, rizósfera y raíz de Sorghum bicolor y extracción del ADN mediante un ADN bien establecida aislamiento kit11. Además, nuestro protocolo incluye un flujo de trabajo de la secuencia detallada de productos, utilizando una plataforma NGS comúnmente utilizada, para determinar la estructura de las comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo ha sido validada para el uso en una amplia gama de anfitriones de la planta en un reciente estudio publicado de las raíces, rizosfera y asociados-suelos de 18 especies de monocotiledóneas, incluyendo sorgo bicolor, Zea mays y Triticum aestivum15. Este método también ha sido validado para su uso con otros genes marcadores, como lo demuestra su exitosa aplicación al estudio de los hongos ITS2 gen marcador en estudios de agave microbioma16,17 y microbioma fresa 18.
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Protocol
1. recolección y separación de la raíz Endosphere, rizosfera y las muestras de suelo
- Antes de entrar en el campo, agua ultrapura de autoclave (menos de 90 mL de agua por muestra) para esterilizar. Preparar el tampón de extracción epiphyte (por lo menos 25 mL por muestra) agregando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4y 1 mL de Tritón X-100, a 1 L de agua estéril. Esterilizar el buffer con un filtro de vacío de tamaño de poro de 0,2 μm.
- Para pasos de 1.2 a 1.5, limpia guantes esterilizados con etanol en todo y cambiar los guantes entre cada muestra para evitar la contaminación. Esterilizar todo el equipo con etanol al 70% y limpie todo el equipo entre muestras. Antes de toma de muestras, determinar la profundidad de muestreo óptimo para su experimento y consistente con todas las colecciones de suelo y raíz.
- Para recolectar muestras de suelo a granel, utilice un colector de base de suelo esterilizado de etanol para obtener suelo libre de raíces de la planta por la recogida de un núcleo de aproximadamente de 23 a 30 cm de la base de la planta.
- Transferir el suelo a una bolsa de plástico, homogeneizar el suelo agitando suave y transferir una alícuota de la muestra de suelo (aproximadamente 600 mg) para llenar un tubo de 2 mL. Inmediatamente Coloque el tubo de 2 mL en hielo seco o flash congele el tubo en el líquido N2 hasta que esté listo para proceder con la extracción de ADN (paso 2).
- En algunos entornos, el suelo circundante puede contener material vegetal. En este caso, utilizar un tamiz de 2 mm esterilizado para separar los restos vegetales del suelo antes de colocar en la bolsa de plástico.
- Para recolectar las raíces y rizosfera, utilice una pala esterilizada de etanol para desenterrar la planta, cuidando de obtener tanto la raíz como sea posible. Profundidad depende de la planta. Mientras que pequeñas plantas como el trigo pueden ser quitadas por varios centímetros de excavación, plantas más grandes como el sorgo pueden requerir 30 cm o más. Suavemente sacuda el exceso de suciedad de las raíces hasta que hay aproximadamente 2 mm de suelo adheridas a la superficie de la raíz.
Nota: tenga cuidado cuando se trabaja con plantas pequeñas, con raíces frágiles, o en suelos de contenido seco, alta-arcilla. Idealmente, sólo debería haber una capa delgada de suelo que queda en las raíces después de la sacudida. Si se mantienen grandes agregados de suelo, puede utilizarse un mazo de goma para desalojar la tierra golpeando suavemente la base del rodaje. Si la cantidad de suelo que queda después de este proceso excede o cae por debajo de 2 mm, el espesor aproximado debe señalarse. - Para plantas grandes, uso estériles tijeras o Cizallas para cortar una subdivisión representativa de las raíces y colocar un mínimo de 500 mg de tejido de raíz en un frasco cónico de 50 mL. Para las hierbas más pequeñas, coloque todo el sistema de raíz en el frasco. Agregar suficiente buffer de remoción de epífitas para cubrir las raíces, luego coloque inmediatamente la muestra en hielo seco o flash congelar la muestra en líquido N2.
Nota: tenga cuidado de no para sobrellenar el frasco cónico de 50 mL, como hará lavado de paso difícil. Debe haber suficiente espacio que el búfer de epífitas es capaz de fluir a la parte inferior, rodean las raíces en todo el frasco y la tapa. Debido a que algunas hierbas tienen más biomasa de la raíz que caben en un frasco cónico de 50 mL, una subdivisión de las raíces se debe recoger. Sin embargo, debe señalarse que corte las raíces podría conducir a bacterias endophytic ser lavadas fuera en la fracción de la rizosfera, rompiendo así las raíces debe reducirse al mínimo. Si las muestras no son procesadas inmediatamente después de regresar al laboratorio, puede conservarse a-80 ° C. - Para separar la rizosfera de las raíces, descongelar la muestra de raíz en el hielo, luego someter a ultrasonidos las muestras de raíz a 4 ° C por 10 min con pulsos de 160 W por 30 s, separadas por 30 s. transferencia las raíces en una fría (4 ° C), limpiar 50 tubo mL utilizando pinzas estériles. No deseche el tubo original con buffer y suelo, que es la fracción de la rizosfera (figura 1).
- Centrifugar el tubo con tampón y rizosfera para flash 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar el sobrenadante, congelar el tubo que contiene la fracción de la rizosfera en líquido N2y almacenar la fracción de la rizosfera a-80 ° C hasta que esté listo para proceder con el ADN extracción (paso 2).
- Para lavar las raíces, añadir aproximadamente 20 mL de agua estéril fría (4 ° C) a la fracción de raíz. Lavar la raíz agitando vigorosamente (a mano o batidora, para 15-30 s) y luego drenar el agua.
- Repita este paso por lo menos dos veces, hasta que no suelo permanece en la superficie de la raíz. Si la extracción de ADN (paso 2) no se realiza inmediatamente, envuelva las raíces en papel de aluminio estéril, flash congelar las raíces en líquido N2y tienda las muestras a-80 ° C hasta listo para proceder con la extracción de ADN.
2. extracción de ADN
Nota: A lo largo de los pasos 2 y 3, guantes limpios, esterilizados con etanol deben llevarse en todo momento y todo el trabajo debe realizarse sobre una superficie esterilizada con etanol.
- Extraer el ADN de las muestras de suelo y rizósfera.
- Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 250 mg del suelo y la rizosfera de los pasos 1.3 y 1.7 en los tubos de recogida proporciona en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de ADN utilizando el proveedor de kit Protocolo.
- Después de liberador de la DNA en el tampón de elución proporcionada por el kit de aislamiento de DNA, guardar el ADN a-20 ° C hasta que esté listo para proceder con el paso 3.
- Extraer el ADN de las muestras de raíz.
- Enfriar un mortero esterilizado y Maja usando líquido N2. Mida 600 a 700 mg de raíz tejido y coloque el tejido en el mortero. Cuidadosamente, agregue suficiente líquido N2 para cubrir las raíces.
- Moler las raíces en trozos pequeños. Continuar con el proceso de agregar líquido N2 y pulido (por lo menos dos veces, ser coherente entre las muestras), hasta que las raíces son un polvo fino. Asegúrese de que el tejido de la raíz no descongelar durante este paso.
PRECAUCIÓN: Use equipo de protección personal (bata, gafas protectoras y Guantes criogénicos) cuando trabajan con líquido N2.
Nota: Para una extracción de ADN de baja calidad, puede ser beneficioso moler raíces exceso en polvo y guardar el polvo a-80 ° C. - Rápidamente, antes de la raíz en polvo comienza a descongelar, utilizar una espátula estéril para transferir el polvo de la raíz en tubos de 1,5 mL previamente pesado en el hielo. Registrar el peso del tubo y el polvo. Por lo general, se transfiere 300-400 mg de polvo.
- Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 150 mg de polvo de la raíz para el tubo de la colección en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de la DNA usando el protocolo del proveedor de kit.
Nota: Para algunas muestras de raíz, puede haber una alta concentración de materia orgánica remanente en el pellet de ADN, lo que impide la amplificación de la DNA durante PCR, especialmente cuando un protocolo de extracción de ADN diferente (por ej., extracción CTAB) se utiliza. Si es necesario, limpie el ADN siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit de limpieza ambiental de ADN.
- Medir la concentración de todas las muestras de ADN con un fluorómetro de sobremesa de alta sensibilidad.
- Añadir 1-20 μl de cada muestra de ADN eluída en tubos en el kit de ensayo de alta sensibilidad de dsDNA. Añadir solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200) hasta 200 μl.
- Preparar dos tubos adicionales con 10 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN) o 10 μl de estándar 2 (100 ng/μL) y añadir 190 μl de solución de trabajo de Fluorímetro a cada estándar.
- Medir la concentración de cada muestra y los estándares. Si no se realiza automáticamente, calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los dos estándares.
3. productos biblioteca preparación y presentación
- Crear materiales para la reacción de amplificación.
- Descongelar las muestras de ADN a 4 º C y mantenerse en hielo en el paso 3. Aleatorizar el orden de las muestras de ADN para minimizar el sesgo debido a la ubicación de la placa PCR (tabla 2).
- En una placa PCR de 96 pocillos, Diluya el ADN de cada muestra de agua molecular grado a 5 ng/μL en un volumen total de 20 μl. agregar 20 μl de agua de grado molecular a los pozos de cuatro esquinas como controles negativos para la amplificación (espacios en blanco) (tabla 2).
- Organizar los cebadores con código de barras (10 μm) en tubos PCR tira o en una placa de 96 pocillos que se puede añadir con una pipeta multicanal (figura 2).
- Preparar suficiente mezcla maestra de PCR para amplificar cada muestra de ADN por triplicado. Preparar 1,5 μl de BSA (20 mg/mL), 37.5 μl de prefabricadas 2 x master mix (compuesto de buffer PCR, dNTPs, MgCl2y Taq ADN polimerasa), 0.57 μl de cloroplasto PNA (100 μm), 0.57 μl de ANP mitocondrial (100 μm) y 25.86 μl de agua de grado molecular.
- Vierta la mezcla principal en un estéril 25 mL del reservorio de la pipeta multicanal y distribuir 66 μl de la master mix a cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nueva utilizando una pipeta multicanal.
Nota: Al calcular los volúmenes de reactivo para la mezcla principal, asegúrese de incluir también los pocillos del blanco 4 por placa. - Usando una pipeta multicanal, añadir 6 μl de 5 ng/μl de ADN (de la placa normalizada de ADN) a la placa de mezcla principal. Luego añadir a la placa principal 1,5 μl del primer avance de 10 μm que cada columna tiene un diferente código de barras hacia delante y 1,5 μl de 10 μm inversa primer tal que cada fila tiene un código de barras diferentes inversa (figura 2).
Nota: Antes de la adición de iniciadores, las placas al azar y mezcla principal podrían utilizarse para amplificar los genes de hongos ITS o ITS2 si se agregaron diferentes cartillas. Si este es el caso, puede utilizarse un diseño similar de la cartilla. - Giro de la placa brevemente a 3.000 x g. Utilice una pipeta de varios canales para mezclar suavemente, luego se dividen en tres placas con 25 μl de mezcla de reacción.
Nota: Aunque no son estrictamente necesarios tres repeticiones, disminuye el impacto de la variabilidad técnica.
- Amplificar el ADN en cada placa utilizando un termociclador a las siguientes condiciones: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturalización), 78 ° C durante 10 s (PNA recocido), 55 ° C durante 60 s (primer recocido) y 72 ° C durante 90 s (extensión) , entonces 600 s a 72 ° C seguido de un 4 ° C mantener paso. Después de la amplificación, la piscina las tres placas replicadas en una sola placa de 96 pocillos.
- Cuantificar el ADN utilizando los reactivos de alta sensibilidad Fluorímetro en un lector de placa de 96 pocillos.
- Añadir 2 μl de cada producto PCR a una microplaca de 96 pozos, junto con 98 μl de solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200). Incluyen 4 pozos como estándares: 5 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN), 1 μl de estándar 2 (10 ng/μL), 2 μl de estándar 2 (20 ng/μL) y 5 μl de estándar de 2 (50 ng/μL). A continuación Agregar solución de trabajo de Fluorímetro para un volumen final de 100 μl.
Nota: Cada muestra puede medirse con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3, si no hay un lector de placas. - Calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los cuatro estándares.
- Para el código de barras con éxito amplificado productos (aquellos que tienen una concentración mayor de 15 ng/μL), piscina 100 ng de cada muestra en un tubo de 1,5 mL sola (tabla 2).
- Calcular el volumen promedio de muestras de agregado a la piscina mediante la función =AVERAGE() en un programa de hoja de cálculo. Añadir el volumen de los productos PCR "en blanco" a las muestras agrupadas.
Nota: Puesto que los productos PCR "en blanco" tienen sus propias combinaciones de código de barras único, puede secuenciados para verificar cualquier contaminante de laboratorio.
- Añadir 2 μl de cada producto PCR a una microplaca de 96 pozos, junto con 98 μl de solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200). Incluyen 4 pozos como estándares: 5 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN), 1 μl de estándar 2 (10 ng/μL), 2 μl de estándar 2 (20 ng/μL) y 5 μl de estándar de 2 (50 ng/μL). A continuación Agregar solución de trabajo de Fluorímetro para un volumen final de 100 μl.
- Medir la concentración del producto combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3 y tomar 600 ng de ADN y diluir en agua grado molecular a un volumen final de 100 μL en un tubo de 1,5 mL. Almacenar el producto combinado restantes a-20 ° C.
- Lavar el ADN ng 600 alícuota siguiendo el proceso establecido de purificación PCR con granos de purificación paramagnética en un formato de 96 pocillos con unas pocas excepciones.
- Hacer un fresco 600 μl alícuota de etanol al 70%. Agite la botella de bolas magnéticas para resuspender los granos que se colocan en la parte inferior.
- Agregar 1 volumen x (100 μL) de solución de grano a la 600 alícuota ng de ADN. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético de 2 minutos (o hasta que la solución esté clara) para separar los granos de la solución. Mientras el tubo está en el soporte magnético, aspirar el sobrenadante con cuidado sin tocar las bolas magnéticas y descartar el sobrenadante.
Nota: en este punto, los productos de productos están limitados a las bolas magnéticas. Cualquier granos que son perturbada o perdida durante la aspiración resultará en una pérdida de ADN. - Dejar el tubo en el soporte magnético y añadir 300 μL de etanol al 70% al tubo; incubar a temperatura ambiente durante 30 s. aspirado el etanol y el descarte. Repita este proceso y etanol todos después del segundo lavado. Retire el tubo del soporte magnético y aire seco durante 5 minutos.
- Añadir 30 μl de agua molecular grado a los granos secos y mezclar mediante pipeteo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min vuelta el tubo al soporte magnético durante 1 minuto para separar los granos de la solución. Transferir el efluente a un tubo nuevo.
Nota: Granos magnéticos no afectará las reacciones posteriores.
- Medir la concentración final de limpiar, ADN combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3. Diluir una alícuota de 10 nM en un volumen final de 30 μL, o a la concentración y volumen preferido por la facilidad de la secuencia.
- Utilizar los servicios de un establecimiento de secuencia a secuencia de la DNA en una plataforma NGS, 2 x 300 bp final emparejado la secuencia.
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Representative Results
Realizar el protocolo recomendado debe resultar en un conjunto de datos de indexadas Lee extremo apareado que pueden ser emparejados a cada muestra y asignado a cualquier bacteriana unidades taxonómicas operativas (OTU) o variante de la secuencia exacta (ESV, también conocido como productos variante de la secuencia (ASV) y unidad taxonómica incompletos (sOTU)), dependiendo de posteriores análisis. Con el fin de obtener datos de la secuencia de alta calidad, se debe tener cuidado en cada paso para mantener la coherencia entre las muestras y minimizar la introducción de cualquier sesgo potencial durante el procesamiento de las muestras o la preparación de la biblioteca. Después de recoger, procesar y extraer ADN de muestras (pasos 1 y 2), el efluente resultante debe aparecer claro y libre de materia orgánica que inhibiría la amplificación. Mientras que la pureza puede comprobarse mediante la medición de cada muestra de ADN por medio de un espectrofotómetro de microvolume, hemos encontrado que el kit de extracción de ADN de suelo confiable elimina todos los contaminantes. Como resultado de la predecible calidad de ADN, métodos de cuantificación que se basan en tintes basados en fluorescencia que se unen específicamente a ADN son más apropiados que los basados en la absorbancia de UV19,20,21. Antes de la amplificación por PCR, las muestras de suelos y rizosfera promedio alrededor de 10 ng/μl ADN, mientras que las muestras de raíz suelen tienen una concentración media de aproximadamente 30 ng/μl (tabla 2).
Después de la amplificación del ADN ambiental (paso 3), éxito o fracaso puede determinarse midiendo la concentración del producto PCR mediante reactivos de Fluorímetro de sobremesa con un lector de placa, si está disponible, o manualmente (cuadro 2). En nuestra experiencia, exitosas amplificaciones que resultan en productos de alta calidad de datos rendimiento mayor que los productos PCR de 15 ng/μl. Si hay múltiples fallos en una placa, el arreglo posicional dentro de la planta y el tipo de muestra de las muestras puede ayudar a determinar el problema. Por ejemplo, si son todo junto en el plato, puede indicar error de pipeta, mientras que si están todos en la misma fila o columna, puede sugerir problemas con una imprimación específica. Si pertenecen al mismo tipo de muestra, pueden sugerir problemas con el procesamiento de las muestras o la extracción de ADN.
Es importante comprobar la compatibilidad de las PNAs universales con su bioinformatically de sistema de planta específica durante el diseño experimental con el fin de verificar que bloquean la amplificación de genes 16S mitocondrial y de cloroplasto. Tras el paso de amplificación, no está claro si las PNAs con éxito limitado a mitocondrial y plantillas del cloroplasto; Esto se revela sólo después de la secuencia (figura 3). Para ayudar a garantizar que los PNAs bloquearán amplificación de contaminantes, una alineación de la secuencia PNA a cada cloroplasto y gene del rRNA 16S mitocondrial (puede haber múltiples copias) para la planta anfitrión siendo investigado no debe revelar cualquier desajustes . Incluso un solo desajuste a la secuencia PNA de bp 13, especialmente en el centro de la abrazadera de la ANP, puede reducir drásticamente la efectividad, como en el caso de la secuencia PNA de cloroplasto proporcionado y el gene del rRNA 16S cloroplasto de Lactuca sativa (lechuga) ( Figura 3).
Puesto que la misma cantidad de ADN amplificado se agruparon por muestra, allí debe ser un número aproximadamente incluso de lecturas obtenido por muestra después de secuenciación y clasificación Lee basado en su índice de código de barras (figura 4). La mayoría de estas lecturas debe coincidir a taxones bacterianos. Cualquier eucariotas, mitocondrial, o cloroplasto partidos deben ser descartados. Dependiendo de la tubería de análisis y bases de datos taxonómico elegido, cloroplasto y mitocondrial Lee erróneamente se puede asignar a linajes bacterianos, a menudo cianobacterias y Rickesttia, respectivamente (figura 3). A menudo es prudente verificar estas asignaciones errónea común un grado de curación manual. Detalles específicos dependerá de la opción de análisis y perfiles de abundancia relativa general deben ser similares (sin diferencia significativa) entre las réplicas biológicas y significativamente diferente entre muestras de suelo, rizósfera y raíz (figura 5 ). Es importante tener en cuenta, sin embargo, que aunque no puede haber ninguna diferencia significativa entre las réplicas biológicas, es importante recoger por lo menos tres repeticiones por.
Métodos para la interpretación de los datos obtenidos en estos experimentos se debaten acaloradamente entre los ecólogos microbianos. Hasta hace poco, análisis de la secuencia de productos ha sido dependiente de la agrupación lee en OTUs. Sin embargo, éstos son problemáticos porque: 1) se basan en algo arbitrario umbral de similitud del 97%, 2) la diversidad es a menudo subestimada, y 3) puede haber baja resolución taxonómica. Recientemente desarrollados herramientas como DADA2 Deblur y UNOISE222,23,24 son capaces de ordenar lee en ESV, que soluciona algunos problemas que se presentan al utilizar OTUs. Advertencias al uso de ESV incluyen: 1) artificiales aumentos de diversidad debido a las diferencias en copias de rRNA dentro de una especie y 2) aumento de la sensibilidad para la PCR y secuenciación errores25,26.
Figura 1: separación de las fracciones de raíces y rizosfera. Diagrama de flujo mostrando los pasos para la separación de la rizosfera de las muestras de raíz, siguió lavando las raíces con agua estéril para eliminar cualquier resto organismos rizoplano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplo de diseño de acciones primer para la amplificación y la distribución dentro de las placas. Cartillas de stock (tabla 1) se pueden preparar en tubos de tira para una óptima distribución en placas de 96 pocillos (cada tira de cartillas es representada por un color diferente, morado para cartillas de avance 1-8, naranja para adelante cartillas azul 9-16, para primers reversas 1-12 y verde para revertir cartillas 13-16.) En este caso, 16 adelante y 16 atrás iniciadores pueden ser distribuidos eficientemente con una pipeta multicanal que bueno cada uno tiene una combinación de código de barras único. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados que sugieren cloroplasto PNA es ineficaz. Resultado representativo de la rizosfera ("Rhizo"), raíz y las muestras de suelo de lechuga no tratados (NT) o trataron (VT) con una enmienda biológica. La secuencia PNA solía bloquear contaminación del cloroplasto de la mayoría de las plantas es GGCTCAACCCTGGACAG27. Sin embargo, la lechuga contiene un desajuste en el gen de ARN ribosomal 16S de cloroplasto (GGCTCAACTCTGGACAG). Esto hace que la ANP ineficaz, dando como resultado una alta abundancia relativa de las lecturas que corresponden a cianobacterias en muestras de rizosfera y raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: distribución de lectura se cuenta entre las muestras en una biblioteca. Gráfico de barras mostrando número de leer cuentas (eje y) de diferentes muestras (bares, eje x), igualadas por la combinación de código de barras en la lectura. El número de lecturas por muestra puede variar dependiendo de cómo muchas muestras están en la biblioteca; este subconjunto se secuenció en una librería de 192 muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: abundancia relativa de las clases de top 12 en raíz, rizosfera y suelo comunidades. Gráfico de barras apilada que muestra la abundancia relativa de las clases presentes en un conjunto de datos de representante 16S con 6 repeticiones para cada tipo de muestra (suelo a granel, rizosfera y raíz endosphere). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Primers para amplificar la región V3-V4 del gene del rRNA 16S. Cartillas se componen de, secuencialmente: un adaptador para una plataforma común de NGS, un código de barras único, la cartilla de NGS, una región del espaciador, de longitud variable para cambiar el marco de la secuencia y una imprimación universal de PCR que amplifica 341F o 785R del gene del rRNA 16S. El número de iniciadores necesitada depende de cuántas muestras se secuenciaron por biblioteca; una combinación de 16 adelante y 16 atrás cartillas basta 244 muestras (256 combinaciones de cartilla con 12 utilizado para pozos en blanco durante la polimerización en cadena (figura 2)). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla 2: normalización de DNA al azar muestras antes y después de la amplificación de. Hoja de cálculo ejemplo listado de las muestras en orden aleatorio y que indica su ubicación en una sola placa de 96 pocillos, que también determina la combinación de la cartilla que le asigna. Fórmulas en la fila inferior describen cálculos para agregar 100 ng de cada muestra a la placa normalizada, además el volumen de agua a 20 μl. Tras la amplificación, el volumen de 100 ng de cada producto exitoso se calcula y se agrega a una piscina final. El volumen de producto PCR "en blanco" para agregar a la piscina final es el promedio de las otras muestras. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplementario Figura 1: aproximación de biomasa raíz mínima durante la recogida de muestras. Cuando recoger raíces, tratar de cobrar por lo menos 500 mg de tejido. Aquí, las raíces recolectaron de una planta de sorgo joven (izquierda, en tanto A y B) y una planta de arroz joven (derecha) junto al (A) y dentro de los tubos cónicos (B) 50 mL. Tanto las muestras pesan aproximadamente 1 g, sin embargo, es importante tener en cuenta que este peso incluye la rizosfera y la raíz, y el peso de la rizosfera, en este caso, aproximadamente la mitad del peso total. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo muestra una tubería establecida para explorar endosphere raíz, rizosfera y composiciones de comunidad microbiana del suelo, del muestreo de campo para el procesamiento de las muestras y la secuenciación descendente. Microbiomes asociada a raíz de estudiar presenta desafíos únicos, debido en parte a las dificultades inherentes en el muestreo de suelo. Suelos altamente variable en términos de propiedades físicas y químicas, y diferentes condiciones de suelo pueden ser separadas por tan sólo unos milímetros de28,29. Esto puede conducir a las muestras que se recogen de los sitios de muestreo adyacentes tener comunidad microbiana considerablemente diferentes composiciones y actividades30,31. Así, utilizando suelo base colectores y palas para mantener profundidades de muestreo consistente y homogeneización antes de la extracción de ADN son esenciales para la reproducibilidad dentro de los estudios de microbioma de raíz. También es esencial para separar eficientemente las fracciones rizosfera y raíz; utilizando un método áspero de la esterilización superficial de raíz potencialmente puede lisar endófitos dentro de raíces antes de la extracción de ADN, mientras que un lavado más conservador no puede eliminar todos los microbios de la superficie de la raíz7. Otro factor clave que puede negativamente afectar o alterar resultados de la secuenciación es la contaminación bacteriana, que puede provenir de muchas fuentes y a veces es imposible distinguir las bacterias ambientales muestreo32,33. Por esta razón, esterilización cuidadosa de herramientas de toma de muestras, materiales experimentales y entornos de trabajo son vitales para evitar la contaminación.
Después del muestreo, obtención de ADN de alta calidad es una prioridad para análisis posteriores exitosos. En nuestra experiencia, la extracción de ADN del campo crecido muestras de raíz a través de métodos alternativos, tales como extracción de CTAB, contienen a menudo cantidades sustancialmente mayores de ácidos húmicos y otros compuestos en comparación con las muestras de rizósfera y suelo. Estos compuestos pueden prevenir la actividad enzimática de la ADN polimerasa durante la amplificación por PCR, incluso a bajas concentraciones de34,35. Mediante la extracción de ADN kits diseñados para los suelos en muestras de raíz, en contraposición a una extracción CTAB seguido de un fenol cloroformo limpiar, efectivamente pueden eliminar muestras de ácidos húmicos y resultarán en alta calidad DNA36,37, 38,39. Por consiguiente, se recomienda utilizar un kit de extracción de ADN disponible comercialmente para las muestras de raíz, así. Cabe señalar que el objetivo es obtener ADN genómica microbiana de raíces de la planta. Así, es importante romper el tejido de la planta y lyse las células microbianas para liberar el ADN microbiano sin introducir sesgo entre las muestras debido a la variación de presión y tiempo de pulido pulido de raíz profunda y constante.
Después de cuidadosa extracción de ADN de las muestras, hay dos fuentes principales de problemas durante la amplificación: 1) la contaminación de los tejidos de la planta con planta endosimbiontes (cloroplasto y mitocondrias) y 2) selección de región de rRNA 16S para amplificar. La amplificación del cloroplasto o mitocondrias 16S rRNA secuencias pueden generar > 80% de las secuencias en raíz muestras40, y más en los tejidos de la hoja, aunque el grado de contaminación depende de la elección de los primers. Así, las abrazaderas de la PNA son necesarias durante el paso de la polimerización en cadena para suprimir la planta anfitrión cloroplasto y mitocondrial 16S contaminación27,41. Sin embargo, diferentes especies de plantas pueden tener variación en el cloroplasto y la secuencia de 16S mitocondrial27; por lo tanto, es esencial para confirmar la secuencia del cloroplasto y mitocondrial 16S genes de la planta estudiada antes de la secuencia de la biblioteca, con el fin de determinar si se necesitan oligos PNA suplentes (figura 3). Además, el gene del rRNA 16S consiste en nueve regiones hipervariables flanqueadas por nueve regiones conservadoras; pueden que se obtengan diferentes resultados de la misma comunidad dependiendo de qué región hipervariable es amplificado42. Estudios anteriores han encontrado la región V4 para ser uno de los más confiables para asignar taxonomía43 y se ha utilizado para otros microbioma extensas encuestas11. Alargar el destino a la región V3-V4 se sugiere aquí para aumentar la variabilidad y mejorar la resolución taxonómica.
En este protocolo, hemos demostrado una tubería para llevar a cabo productos rRNA 16S que ordena mediante la siguiente secuencia de generación (NGS) para estudiar la composición de la comunidad microbiana de muestras ambientales12. Recomendamos el uso de secuenciación del amplicón como herramienta para elaboración de perfiles filogenéticos, porque es relativamente barato, de alto rendimiento y no requiere de amplios conocimientos computacionales o recursos para analizar. Mientras que nuestro método se enfoca en analizar la fracción bacteriana de la microbioma, fácilmente puede ser adaptado para investigar hongos. El protocolo es idéntico al paso 2, y la única diferencia en el paso 3 es qué bases se utilizaría durante la amplificación. Sin embargo, merece la pena nada que la amplicon basado en perfiles no está exenta de limitaciones. Mediante la secuenciación de un gen marcador único, ninguna información es obtenida con respecto a la capacidad funcional de la comunidad. Además, la resolución taxonómica puede ser bastante bajo, sobre todo cuando la secuencia de ambientes con un alto porcentaje de los microbios no caracterizados. Sin embargo, tecnologías de secuenciación están evolucionando rápidamente, y anticipamos el potencial para hacer frente a algunas de estas deficiencias mediante la adaptación de este protocolo para su uso con otras plataformas de secuenciación. Finalmente, como se mencionó en la introducción, metatranscriptomics y metagenómica de escopeta puede fácilmente realizarse en muestras de suelo y rizosfera, y actualmente se están estudiando métodos para eliminar la contaminación de la planta de tejidos de la planta. Diseños experimentales que par los enfoques basados en los productos y otras técnicas de metagenómica pueden ser particularmente efectivos en comunidades complejas donde alta diversidad de especies y la desigual representación de taxa pueden prevenir datos de escopeta de precisión caracterizar al menos los miembros dominantes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS es apoyado por el programa de becas de postgrado investigación de NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
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