Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla amplikon sekvensdata av jord, odlingsbädden och rot endosphere microbiomes. Denna information kan användas för att undersöka den sammansättning och mångfalden av växt-associerade mikrobiella samhällen, och är lämplig för användning med ett brett utbud av växtarter.
Abstract
Intima samspelet mellan anläggning värd och associerade mikroorganismer är avgörande för att fastställa växt fitness, och kan främja förbättrad tolerans mot abiotisk stress och sjukdomar. Den växten mikrobiomet kan vara mycket komplexa, låg kostnad, är hög genomströmning metoder såsom amplikon-baserade sekvensering av 16S rRNA-genen ofta föredra för att karakterisera dess mikrobiell komposition och mångfald. Valet av lämplig metodik när genomföra sådana experiment är dock avgörande för att minska fördomar som kan försvåra analys och jämförelser mellan prover och undersökningar. Det här protokollet beskriver i detalj en standardiserad metod för insamling och extraktion av DNA från jord, odlingsbädden och rot prover. Dessutom, vi lyfter fram en väletablerad 16S rRNA amplikon sekvensering pipeline som möjliggör utforskandet av sammansättningen av bakteriella samhällen i dessa prover, och kan enkelt anpassas för andra markörgener. Denna pipeline har validerats för en mängd växtarter, inklusive sorghum, majs, vete, jordgubb och agave, och kan bidra till att lösa frågor i samband med föroreningen från växten organeller.
Introduction
Växt-associerad microbiomes består av dynamiska och komplexa mikrobiella samhällen består av bakterier, arkéer, virus, svampar och andra eukaryota mikroorganismer. Utöver deras väl studerat roll i orsakar växtsjukdomar, kan växt-associerade mikrober också positivt påverka växtskydd genom att förbättra tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar, främja näringsämnen tillgänglighet och förbättra växternas tillväxt genom produktionen av fytohormoner. Av denna anledning finns särskilt intresse i karaktärisera de taxa som förknippar med växt rot endospheres, rhizospheres och den omgivande marken. Medan vissa mikrober kan vara odlade i isolering på laboratoriet genererade media, många inte, delvis eftersom de kan lita på symbiotiska relationer med andra mikrober, växer mycket långsamt, eller kräva villkor som inte kan replikeras i en labbmiljö. Eftersom det kringgår behovet av odling och är relativt billig och hög genomströmning, har sekvens-baserade fylogenetiska profilering av miljö- och host-associerade mikrobiell prover blivit en rekommenderad metod för testmetoder mikrobiell gemenskapen sammansättning.
Valet av lämpliga sekvensering teknik som tillhandahålls av olika nästa generation sequencing (NGS) plattformar1 är beroende av användarnas behov, med viktiga faktorer inklusive: önskad täckning, amplikon längd, förväntat gemenskapen mångfald, samt sekvensering felprocenten, Läs-längd och den kostnad-per-kör/megabase. En annan variabel som måste beaktas i amplikon-baserade sekvensering experiment är vilken gen kommer att förstärkas och vilken grundfärg ska användas. När du designar eller välja primers, tvingas forskare ofta göra kompromisser mellan amplifiering universalitet och taxonomisk upplösning kan uppnås från den resulterande amplikoner. Av denna anledning valde dessa typer av studier ofta primers och markörer för att selektivt riktar specifika delmängder av mikrobiomet. Utvärdera sammansättningen av bakteriella samhällen sker vanligen genom sekvensering en eller flera av de bakteriella 16S rRNA gen2,3hypervariabel regioner. I denna studie, beskriver vi en amplikon baserat sekvensering protokoll som utvecklats för en NGS plattform mål 500 bp V3-V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genen, vilket möjliggör bred förstärkning av bakteriell taxa samtidigt ge tillräcklig variation till skilja mellan olika taxa. Detta protokoll kan dessutom enkelt anpassas för användning med andra primer uppsättningar, som riktar sig till den ITS2 markören av svampar eller den 18S rRNA subuniten av eukaryotes.
Medan andra metoder såsom hagelgevär metagenomik, metatranscriptomics och encelliga sekvensering, erbjuder andra fördelar inklusive löst mikrobiell genomen och mer direkt mätning av gemenskapens funktion, är dessa tekniker vanligtvis mer dyrt och arbetsintensivt än fylogenetiska profilering beskrivs här4. Dessutom utför hagelgevär metagenomik och metatranscriptomics på roten prover ger en stor andel av läsningar som hör till den mottagande anläggning arvsmassan, och metoder för att övervinna denna begränsning fortfarande är utvecklade5,6.
Som med alla experimentell plattform, kan amplikon-baserade profilering införa ett antal potentiella fördomar som bör övervägas under den experimentella design och dataanalys. Dessa inkluderar metoder för provtagning, DNA extraktion, urval av PCR primers och hur biblioteket beredning utförs. Olika metoder kan avsevärt påverka mängden användbara data som genereras, och kan också hindra ansträngningarna att jämföra resultat mellan studierna. Till exempel metoden för att avlägsna odlingsbädden bakterier7 och användningen av olika utvinning tekniker eller val av DNA extraktion kit8,9 har visat sig signifikant inverkan nedströms analys, vilket leder till olika slutsatser om vilka mikrober är närvarande och deras relativa förekomsten. Eftersom amplikon-baserade profilering kan anpassas, kan det vara svårt att göra jämförelser mellan studierna. Jorden mikrobiomet projektet har föreslagit att forskare studerar komplexa system som den växt-associerade mikrobiomet skulle gynnas utvecklingen av standardiserade protokoll som ett medel för att minimera variabiliteten orsakas av tillämpningen av olika metoder mellan studier10,11. Här diskuterar vi många av de ovanstående ämnena och ge förslag om bästa praxis där så är lämpligt.
Protokollet visar processen för samlande jord, odlingsbädden och rot prover från Sorghum bicolor och utvinna DNA med en väletablerad DNA isolering kit11. Våra protokoll innehåller dessutom en detaljerad amplikon sekvensering arbetsflöde, med en ofta utnyttjad NGS platform, för att bestämma strukturen av bakteriesamhällen12,13,14. Detta protokoll har validerats för användning i ett brett utbud av växten varar värd i en nyligen publicerad studie av rötter, odlingsbädden och associerade-smutsar av 18 enhjärtbladiga arter inklusive Sorghum bicolor, Zea mays, och Triticum aestivum15. Denna metod har också validerats för användning med andra markörgener, vilket framgår av dess framgångsrika för att studera genen svamp ITS2 markör i studier av agave mikrobiomet16,17 och strawberry mikrobiomet 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. insamling och Separation av roten Endosphere, odlingsbädden och jordprover
- Innan fältet, autoklav ultrarent vatten (minst 90 mL vatten per prov) för att sterilisera. Förbereda epifyt borttagning buffert (minst 25 mL per prov) genom att lägga till 6,75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4och 1 mL av Triton x-100, 1 L sterilt vatten. Sterilisera bufferten med ett vakuum filter med 0,2 µm porstorlek.
- För steg 1,2 till 1,5, Använd rena handskar steriliseras med etanol i alla tider och Byt handskar mellan varje prov att förhindra kontaminering. Sterilisera all utrustning med 70% etanol och torka ren all utrustning mellan prover. Före provtagningen, bestämma optimal provtagning djupet för experimentet, och vara förenliga med alla jord och rötter samlingar.
- Att samla in bulk jordprover, använda en etanol-steriliseras jord kärna samlare för att erhålla jord som är fri från växternas rötter genom att samla en kärna cirka 23 till 30 cm från basen av växten.
- Överföra jorden till en plastpåse, homogenisera marken genom mild omskakning och överför en alikvot av den jordprov (cirka 600 mg) att fylla en 2 mL tub. Placera omedelbart 2 mL röret på torris eller flash frysa röret i vätska N2 tills redo att gå vidare med DNA-extraktion (steg 2).
- I vissa miljöer, kan den omgivande marken innehåller växtmaterial. I detta fall använda en steriliserad 2 mm sikt för att separera växtrester från marken innan du placera det i plastpåsen.
- Att samla in roten och odlingsbädden, använda en etanol-steriliseras spade för att gräva upp växten, noga med för att få så mycket av roten som möjligt. Djup är beroende av växten. Medan små växter såsom vete kan tas bort genom att gräva flera centimeter, kräva större växter såsom sorghum 30 cm eller mer. Skaka försiktigt bort överflödig jord från rötterna tills det är ca 2 mm av jord följa rotytan.
Obs: var försiktig när du arbetar med små växter, med ömtåliga rötter, eller i torrt, hög-lera innehåll jordar. Helst bör det endast finnas ett tunt lager av jord kvar på rötterna efter omskakning. Om stora aggregat av jord kvar, kan en gummiklubba användas för att rubba jorden genom att försiktigt slå basen av fotograferingen. Om mängden jord som återstår efter denna process överstiger eller understiger 2 mm, bör ungefärlig tjocklek noteras. - För stora växter, Använd steril sax och/eller saxen att skära ett representativt underavsnitt av rötter och placera minst 500 mg av root vävnad i en 50 mL konisk injektionsflaska. För mindre gräs, placera hela rotsystemet i injektionsflaskan. Lägg till tillräckligt epifyt borttagning buffert för att täcka rötterna och sedan omedelbart placera provet på torris eller flash frysa provet i vätska N2.
Obs: se till att inte överfyllnad 50 mL koniska flaskan, eftersom det kommer att göra tvätt steg svårt. Det bör vara tillräckligt tomt utrymme sådan som epifyt bufferten kunna flöda till botten, omger rötterna i hela flaskan och täcka upp. Eftersom vissa gräs har mer rot biomassa än passar in i en 50 mL konisk injektionsflaska, bör ett underavsnitt av rötterna samlas in. Det bör dock noteras att klippa rötterna kunde leda till Endofytisk bakterier spolas i odlingsbädden bråket, så bryter rötter bör minimeras. Om proverna inte behandlas omedelbart efter återkomsten till lab, kan de lagras vid-80 ° C. - För att skilja odlingsbädden från rötterna, Tina rot provet på isen, sedan Sonikera rot proverna vid 4 ° C i ca 10 min med pulser av 160 W för 30 s, separeras genom 30 s. överföring rötterna i en kyld (4 ° C), ren 50 mL tub med steril pincett. Släng inte ursprungliga röret med buffert och jord, som är den odlingsbädden fraktionen (figur 1).
- Centrifugera röret som innehåller buffert och odlingsbädden för 10 minuter vid 4 ° C, 4000 x g. Dekantera supernatanten, flash frysa röret som innehåller den odlingsbädden fraktionen i vätska N2, och lagra det odlingsbädden bråket vid-80 ° C tills det att fortsätta med DNA extraktion (steg 2).
- För att tvätta rötterna, lägga ca 20 mL kylt (4 ° C) sterilt vatten till den rot-fraktionen. Tvätta roten genom att skaka kraftigt (för hand eller mixer, för 15-30 s), och sedan tömma vattnet.
- Upprepa detta minst två gånger, tills ingen jord kvar på rotytan. Om den DNA-extraktionen (steg 2) inte utförs omedelbart, Linda rötterna i sterila aluminiumfolie, flash frysa rötterna i vätska N2och store proverna vid-80 ° C tills redo att gå vidare med DNA-extraktion.
2. DNA-extraktion
Obs: Hela steg 2 och 3, rena handskar steriliseras med etanol bör bäras hela tiden och allt arbete ska utföras på en yta som steriliseras med etanol.
- Extrahera DNA från proverna av jord och odlingsbädden.
- En steril spatel för att snabbt överföra 250 mg av jord och odlingsbädden från steg 1,3 och 1,7 till separat insamling rör som finns i ett kommersiellt DNA isolering kit designad för utvinning från jord, sedan gå vidare med DNA isolering använder kit leverantörens protokoll.
- Efter eluering DNA i eluering bufferten levereras av DNA isolering kit, lagra DNA vid-20 ° C tills det att fortsätta med steg 3.
- Extrahera DNA från roten proverna.
- Chill en steriliserad mortel och stöt med flytande N2. Mäta ut 600-700 mg root vävnad och placera vävnaden i mortel. Tillsätt försiktigt, tillräckligt flytande N2 för att täcka rötterna.
- Mala rötterna i små bitar. Fortsätter processen att lägga till vätska N2 och slipning (minst två gånger, vara konsekvent mellan prover), tills rötterna är ett fint pulver. Se till att roten vävnaden inte Tina under detta steg.
Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, skyddsglasögon och kryogena handskar) när arbetar med flytande N2.
Obs: För en låg kvalitet DNA-extraktion, kan det vara fördelaktigt att slipa överskott rötter till pulver och förvara pulvret vid-80 ° C. - Snabbt, innan rot börjar pulver Tina, Använd en steril spatel för att överföra roten pulvret i förväg vägde 1,5 mL rör på is. Spela in vikten på röret och pulver. Vanligtvis överförs 300-400 mg pulver.
- Använd en steril spatel för att snabbt överföra 150 mg pulver till samling röret i en kommersiell DNA isolering kit designad för utvinning från jord, sedan gå vidare med DNA isolering med kit leverantörens protokollet.
Obs: För vissa rot prover, det kan finnas en hög koncentration av organics kvar i DNA pelleten, vilket förhindrar förstärkning av DNA under PCR, särskilt när ett annat DNA extraktion protokoll (t.ex., CTAB extraktion) används. Om nödvändigt, ren DNA genom att följa instruktionerna i den miljömässiga DNA sanering kit.
- Mätning av koncentrationen av alla DNA-prover med en hög känslighet bänkmonterade fluorometer.
- Tillsätt 1-20 µL av varje eluerade DNA-prov in rören i dsDNA hög känslighet assay kit. Lägg till fluorometer arbetslösning (1: 200 färgämne: buffert) upp till 200 µL.
- Förbered två ytterligare rör innehållande 10 µL av DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) eller 10 µL av standard 2 (100 ng/µL), och tillsätt 190 µL av fluorometer fungerande lösning till varje standard.
- Mätning av koncentrationen av standarderna och varje prov. Om det inte sker automatiskt, beräkna DNA koncentrationen från absorbansen utdata genom en linjär regression av de två normerna.
3. amplikon bibliotek förberedelse och inlämning
- Ställa in material för amplifiering reaktionen.
- Tina DNA-prover vid 4 ° C och hålla dem på is i hela steg 3. Slumpa ordning på DNA-prover att minimera bias på grund av platsen på PCR-plattan (tabell 2)
- I en PCR-plattan med 96 brunnar, späd DNA från varje prov i molekylär-grade vatten till 5 ng/µL i en total volym av 20 µL. Tillsätt 20 µL av molekylär-grade vatten till fyra hörn brunnarna som negativa kontroller för amplifiering (tomma) (tabell 2).
- Ordna barcoded primers (10 µM) i antingen PCR remsan rör eller en plattan med 96 brunnar så att de kan läggas med en flerkanalig pipett (figur 2).
- Förbereda tillräckliga PCR master mix att förstärka varje DNA-prov i tre exemplar. Förbereda 1,5 µL av BSA (20 mg/mL), 37,5 µL av färdiga 2 x master mix (består av PCR buffer, MgCl2, dNTP och Taq -DNA-polymeras), 0,57 µL av kloroplast PNA (100 µM), 0,57 µL av mitokondriell PNA (100 µM), och 25.86 µL av molekylärbiologisk kvalitet vatten.
- Häll huvudmixen till en steril 25 mL av multikanalspipett reservoaren och fördela 66 µL master mix i varje brunn för en ny PCR-plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett.
Obs: Vid beräkning av reagens volymer för huvudmixen, se till att även omfatta 4 tomma brunnarna per platta. - Använder en flerkanalig pipett, tillsätt 6 µL 5 ng/µL DNA (från normaliserat DNA plattan) till huvudmixen plattan. Lägg sedan till den tryckplåt 1,5 µL 10 µM framåt primer så att varje kolumn har en olika framåt streckkod och 1,5 µL 10 µM reverse primer så att varje rad har en annan omvänd streckkod (figur 2).
Obs: Innan du lägger till primers, randomiserad tallrikar och master mix kan användas att förstärka ITS eller ITS2 svamp generna om olika grundfärger lades. Om så är fallet, kan en liknande primer design användas. - Spinn ner plattan kort på 3000 x g. Använd en flerkanalig pipett för att blanda försiktigt, sedan dela in i tre plattor med 25 µL av reaktionsblandningen.
Obs: Även om tre replikat inte är absolut nödvändigt, det minskar effekten av tekniska variabilitet.
- Förstärka DNA i varje platta med en termocykler inställd på följande villkor: 180 s 98 ° c, 30 cykler av: 98 ° C för 45 s (denaturing), 78 ° C för 10 s (PNA glödgning), 55 ° C för 60 s (primer glödgning) och 72 ° C för 90 s (förlängning) , sedan 600 s vid 72 ° C följt av en 4 ° C håller steg. Efter förstärkning, pool, tre replikera plattorna i en enda plattan med 96 brunnar.
- Kvantifiera DNA med hög känslighet fluorometer reagens i en plattan med 96 brunnar läsare.
- Tillsätt 2 µL av varje PCR-produkten till en 96 brunnar mikroplattan, tillsammans med 98 µL fluorometer arbetslösning (1: 200 färgämne: buffert). Inkluderar 4 brunnar som standarder: 5 µL av DNA standard 1 (0 DNA ng/µL), 1 µL standard 2 (10 ng/µL), 2 µL av standard 2 (20 ng/µL) och 5 µL standard 2 (50 ng/µL). Lägg sedan till fluorometer fungerande lösning för en slutlig volym av 100 µL.
Obs: Varje prov kan mätas med en bänkmonterade fluorometer enligt beskrivningen i steg 2.3 om en Plattläsare inte är tillgänglig. - Beräkna DNA koncentrationen från absorbansen utdata av en linjär regressionslinje för de fyra standarderna.
- För att framgångsrikt förstärkt barcoded produkter (de som har en koncentration som är större än 15 ng/µL), pool 100 ng av varje prov i ett enda 1,5 mL rör (tabell 2).
- Beräkna den genomsnittliga volymen av prover som lagts till i poolen med hjälp av =AVERAGE()-funktionen i ett kalkylprogram. Lägga till volymen av de ”tomma” PCR-produkterna i de poolade proverna.
Obs: Eftersom de ”tomma” PCR-produkterna har sin egen unik streckkod kombinationer, de kan sekvenseras för att kontrollera eventuella föroreningar i laboratorium.
- Tillsätt 2 µL av varje PCR-produkten till en 96 brunnar mikroplattan, tillsammans med 98 µL fluorometer arbetslösning (1: 200 färgämne: buffert). Inkluderar 4 brunnar som standarder: 5 µL av DNA standard 1 (0 DNA ng/µL), 1 µL standard 2 (10 ng/µL), 2 µL av standard 2 (20 ng/µL) och 5 µL standard 2 (50 ng/µL). Lägg sedan till fluorometer fungerande lösning för en slutlig volym av 100 µL.
- Mätning av koncentrationen av poolade produkten med en bänkmonterade fluorometer enligt beskrivningen i steg 2,3 och ta 600 ng DNA och späd i molekylär-grade vatten till en slutlig volym av 100 µL i en 1,5 mL tub. Förvara den återstående poolade produkten vid-20 ° C.
- Tvätta 600 ng DNA alikvotens genom att följa etablerade PCR reningsprocessen med paramagnetiska rening pärlor i en 96-väl format med några få undantag.
- Göra en färsk 600 µL alikvotens 70% etanol. Skaka flaskan av magnetiska pärlor för återsuspendering pärlor som sätter sig till botten.
- Lägga till 1 x volym (100 µL) pärla lösning 600 ng alikvoten av DNA. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera röret på magnetiska stativet i 2 min (eller tills lösningen är klar) att skilja pärlor från lösningen. När röret är fortfarande i den magnetiska stå, aspirera klara supernatanten noggrant utan att röra de magnetiska pärlorna och kassera klara supernatanten.
Obs: vid denna punkt, amplikon produkterna är bundna till de magnetiska pärlorna. Några pärlor som är störd eller förlorade under strävan kommer att resultera i en förlust av DNA. - Lämna röret i den magnetisk stå och tillsätt 300 µL 70% etanol i röret; odla i rumstemperatur i 30 s. Aspirera ut etanol och kassera. Upprepa denna process och ta bort alla etanol efter andra tvätten. Ta bort röret från den magnetisk stå och lufttorka för 5 min.
- Tillsätt 30 µL molekylär-grade vatten i de torkade pärlorna och blanda genom pipettering 10 gånger. Odla i rumstemperatur i 2 min. Retur röret till det magnetiska står för 1 min för att separera pärlorna från lösningen. Överföra eluatet till en ny tub.
Obs: Magnetiska pärlor påverkar inte efterföljande reaktioner.
- Mäta slutliga koncentration rengöras, poolade DNA med en bänkmonterade fluorometer enligt beskrivningen i steg 2,3. Späd en alikvot till 10 nM i en slutlig volym av 30 µL, eller att koncentrationen och volym som föredras av sekvensering anläggningen.
- Utnyttja tjänster av en sekvensering anläggning att sekvensera DNA på en NGS plattform, 2 x 300 bp Parade-end sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utföra det rekommenderade protokollet bör resultera i en datamängd av indexerade Parade-end läser som kan matchas till varje prov och tilldelats antingen en bakteriell operativa taxonomiska enheter (OTU) eller exakta sekvens variant (ESV, även kallad amplikon sekvens variant (ASV) och sub-operational taxonomiska enheten (sOTU)), beroende på efterföljande analys. För att få hög kvalitet sekvensdata, måste försiktighet iakttas vid varje steg att behålla överensstämmelsen mellan prover och minimera införandet av någon potentiella bias vid prov bearbetning eller bibliotek beredning. Efter insamling visas behandling och extrahera DNA från prover (steg 1 och 2), resulterande eluatet klar och fri från organics som skulle hämma förstärkning. Medan renhet kan verifieras genom att mäta varje DNA-prov via en microvolume spektrofotometer, har vi funnit att jorden DNA extraktion kit tillförlitligt tar bort alla föroreningar. Till följd av den förutsägbara DNA kvaliteten är kvantifiering metoder som förlitar sig på fluorescens-baserade färgämnen som specifikt binder DNA lämpligare än de baserat på UV absorbansen19,20,21. Innan PCR-amplifiering genomsnitt prover av jord och odlingsbädden ca 10 ng/µL DNA, medan roten prover har vanligtvis en genomsnittlig koncentration på cirka 30 ng/µL (tabell 2).
Efter förstärkning av miljömässiga DNA (steg 3), framgång eller misslyckande kan bestämmas genom att mäta koncentrationen av PCR-produkten via bänkmonterade fluorometer reagens på Plattläsare, om tillgängligt, eller manuellt (tabell 2). Vår erfarenhet ger framgångsrika kompletteringar som resulterar i hög kvalitet amplikon data större än 15 ng/µL PCR-produkter. Om det finns flera misslyckanden på en tallrik, kan positionella arrangemanget inom anläggningen och provtypen misslyckade prover hjälpa till att fastställa problemet. Till exempel, om de är alla intilliggande på tallriken, kan det indikera pipett fel, medan om de är alla i samma rad eller kolumn, den kan föreslå problem med en specifik primer. Om de alla tillhör samma provtypen, antyder det problem med prov bearbetning eller DNA-extraktion.
Det är viktigt att kontrollera de universella PNAs kompatibilitet med din specifika växt system bioinformatically under experimentell design för att kontrollera att de kommer att blockera amplifiering av kloroplast och mitokondrie 16S gener. Efter förstärkning steget, det är inte klart huruvida PNAs bundits till mitokondrie och kloroplast mallar; detta avslöjas endast efter sekvensering (figur 3). För att säkerställa att PNAs effektivt blockerar föroreningars förstärkning, en anpassning av PNA sekvensen till varje kloroplast och mitokondrie 16S rRNA genen (det kan finnas flera kopior) för anläggningen avslöja värd utreds inte eventuella avvikelser . Ens en enda obalans till 13 bp PNA sekvensen, särskilt i mitten av PNA klämman, kan drastiskt minska effektiviteten, som i fallet med den medföljande kloroplast PNA sekvensen och kloroplast 16S rRNA genen av Lactuca sativa (sallad) ( Figur 3).
Eftersom en lika stor mängd amplifierade DNA är poolade per prov, det bör ett ungefärligt även antal läsningar erhållas per prov efter sekvensering och sortering läsningar utifrån sina barcoded index (figur 4). Majoriteten av dessa läsningar ska matcha till bakteriell taxa. Alla eukaryota, mitokondriell, eller kloroplast matcher ska kasseras. Beroende analys pipeline och taxonomiska databas valt, kloroplast och mitokondrie läser kan felaktigt tilldelas till bakteriell härstamningar, ofta cyanobakterier och Rickesttia, respektive (figur 3). En viss manuell curation är ofta klokt att kontrollera för dessa gemensamma mis uppdrag. Specifika detaljer kommer att bero på valet av analys, men relativa överflöd profiler bör generellt vara liknande (ingen signifikant skillnad) bland biologiska replikat och signifikant skillnad mellan jord, odlingsbädden och rot prover (figur 5 ). Det är viktigt att Observera dock att det kan finnas ingen signifikant skillnad mellan biologiska replikat, det är viktigt att samla in minst tre replikat per.
Metoder för att tolka de data som erhållits i dessa experiment debatteras hett bland mikrobiell ekologer. Tills nyligen har amplikon sekvensanalys varit beroende av att gruppera läsningar i OTUs. Dessa är dock problematiskt eftersom: 1) de bygger på en något godtycklig tröskel av 97% likhet, 2) mångfald underskattas ofta och (3) det kan vara låg taxonomisk upplösning. Nyligen ska utvecklade verktyg såsom DADA2, Deblur och UNOISE222,23,24 kunna sortera läsningar i ESVs, som löser vissa problem som presenteras när du använder OTUs. Varningar att använda ESVs inkluderar: (1) konstgjorda ökningar av mångfald på grund av skillnaderna i rRNA exemplar inom en art, och 2) ökad känslighet till PCR och sekvensering fel25,26.
Figur 1: Separation av roten och odlingsbädden fraktioner. Flödesschemat visar stegen för att separera odlingsbädden från roten proverna, följt av tvättning rötterna med sterilt vatten för att avlägsna alla återstående rhizoplane organismer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på lager primer layout för förstärkning och distribution inom plattor. Lager grundfärg (tabell 1) kan förberedas i remsan rör för optimal fördelning inom 96 brunnar (varje remsa av primers representeras av en annan färg; lila för framåt grundfärger 1-8, orange för vidarebefordra primers 9-16, blå för omvänd grundfärger 1-12 och grön för omvänd primers 13-16.) I det här fallet kan 16 fram och 16 omvänd primers fördelas effektivt med en flerkanalig pipett så att alla har väl en unik streckkod kombination. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: resultat som tyder på kloroplast PNA är ineffektiva. Representativa resultat från odlingsbädden (”Rhizo”), rot och jordprover från sallad som var icke-behandlade (NT) eller behandlats (VT) med en biologisk jord ändringsförslag. PNA sekvensen används för att blockera kloroplast kontaminering av de flesta växter är GGCTCAACCCTGGACAG27. Sallad innehåller dock en obalans i kloroplast 16S ribosomalt RNA genen (GGCTCAACTCTGGACAG). Detta gör PNA odugligt, vilket resulterar i en hög relativ överflöd av läsningar som matchar på cyanobakterier i odlingsbädden och rot prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fördelning av Läs räknar bland prover i ett bibliotek. Stapeldiagram som visar antalet läsa räknas (y-axeln) från olika prover (barer, x-axeln), matchas av kombinationen streckkod i Läs. Antalet läsningar per prov kan variera beroende på hur många prover finns i biblioteket; Denna delmängd sekvenserades i ett bibliotek av 192 prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: relativa överflöd topp 12 klasser i rot, odlingsbädden och jord samhällen. Staplat stapeldiagram som visar relativa överflöd av klasser i en representant 16S datamängd som innehåller 6 replikat för varje Provtyp (bulk jord, odlingsbädden och rot endosphere). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Primers för förstärka regionen V3-V4 av 16S rRNA genen. Primers består av, sekventiellt: en adapter för en gemensam NGS-plattform, en unik streckkod, primern för NGS, en spacer region av variabel längd att skifta ramen för sekvensering, och en universell PCR-primer som förstärker antingen 341F eller 785R av 16S rRNA-genen. Antalet primers som behövs är beroende av hur många prover är sekvenserade per bibliotek; en kombination av 16 fram och 16 omvänd primers räcker för 244 prover (256 primer kombinationer med 12 används för tomma brunnar under PCR (figur 2)). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tabell 2: normalisering av randomiserade DNA prover före och efter amplifiering. Exempel kalkylblad notering prover i en randomiserad ordning och som anger deras plats på en enda plattan med 96 brunnar, som också bestämmer kombinationen primer som tilldelats den. Formler i nedersta raden beskriver beräkningar för att lägga till 100 ng av varje prov till normaliserade plattan, plus volymen vatten att nå 20 µL. Efter förstärkning, volymen av 100 ng av varje framgångsrik produkt beräknas och lagts till en slutlig poolen. Volymen av ”blank” PCR-produkt att lägga till slutliga poolen är genomsnittet av de andra proverna. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Figur1: tillnärmning av minsta rot biomassa under provtagning. När samla rötter, försöka samla minst 500 mg av vävnad. Här, rötter som samlats in från en ung sorghum växt (vänster, i både A och B) och en ung ris-växt (höger) visas bredvid (A) och släpper (B) 50 mL koniska rör. Båda proverna väger cirka 1 g, det är dock viktigt att notera att denna vikt innehåller odlingsbädden och rot, och har en odlingsbädden vikt, i detta fall, ungefär halva den totala vikten. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar en etablerad rörledning för att utforska rot endosphere, odlingsbädden och jord mikrobiell gemenskapen kompositioner, från fältprovtagning prov bearbetning och efterföljande sekvensering. Studerar rot-associerad microbiomes presenterar unika utmaningar, vederbörlig delvis inneboende svårigheterna att provtagning från marken. Jordar är mycket variabel i form av fysiska och kemiska egenskaper och olika markförhållanden kan separeras från så lite som några millimeter28,29. Detta kan leda till proven som samlas in från intilliggande provtagningsställen har betydligt olika mikrobiella gemenskapen kompositioner och aktiviteter30,31. Således använder jord kärna samlare och spadar för att upprätthålla konsekvent provtagning djup och homogenisering innan DNA-extraktion är viktigt för reproducerbarheten inom rot mikrobiomet studier. Det är också viktigt att effektivt separera de odlingsbädden och rot fraktionerna; med en hård metod av roten ytan sterilisering kan potentiellt lyse endophytes inom rötter innan DNA-extraktion, medan en mer konservativ tvätt inte får ta bort alla mikrober från roten yta7. En annan viktig faktor som kan negativt påverka eller störa sekvensering resultat är bakteriell kontamination, som kan komma från många källor och är ibland omöjligt att skilja från samplade miljö bakterier32,33. Därför försiktig sterilisering av provtagning verktyg, experimentella material och miljöer är avgörande för att undvika kontaminering.
Efter provtagningen är erhålla högkvalitativa DNA en hög prioritet för framgångsrika nedströms analyser. Vår erfarenhet innehåller DNA-extraktion från fältet vuxit rot prover genom alternativa metoder, såsom genom CTAB-baserade utvinning, ofta betydligt större mängder humussyror och andra föreningar jämfört med odlingsbädden och jord prover. Dessa föreningar kan förhindra den enzymatiska aktiviteten av DNA polymerase under PCR-amplifiering, även vid låga koncentrationer34,35. Med hjälp av DNA-extraktion kit designad för jordar på roten prover, i motsats till en CTAB utvinning följt av en fenol kloroform sanering, effektivt kan bli prover av humussyror och kommer att resultera i hög kvalitet DNA36,37, 38,39. Följaktligen rekommenderar vi använder en kommersiellt tillgänglig DNA extraktion kit för roten prover samt. Det bör noteras att målet är att få mikrobiell genomiskt DNA från växternas rötter. Noggrann och konsekvent rot slipning är därför viktigt att bryta ner växtvävnad och lysera mikrobiella cellerna att släppa mikrobiell DNA utan att införa bias mellan prover på grund av variationen i slipning tryck och tiden.
Efter noggrann extraktion av DNA från prover, det finns två huvudsakliga källor för problem under förstärkning: 1) kontaminering av växt vävnader med växt endosymbionts (kloroplast och mitokondrier) och 2) urval av 16S rRNA regionen att förstärka. Förstärkning från kloroplast eller mitokondrier 16S rRNA sekvenser kan generera > 80% av sekvenserna i roten prover40, och mer i leaf vävnader, men mängden förorening är beroende av valet av primers. Således, PNA klämmor är nödvändigt under PCR steg att undertrycka anläggning värd kloroplast och mitokondrie 16S kontaminering27,41. Men kan olika växtarter ha variation i kloroplast och mitokondrie 16S sekvens27; Därför är det viktigt att bekräfta sekvensen av kloroplast och mitokondrie 16S gener av anläggningen som studeras innan biblioteket sekvensering, för att avgöra om alternativa PNA oligos behövs (figur 3). Dessutom, består 16S rRNA genen av nio hypervariabel regioner flankerad av nio konservativa regioner; olika resultat kan erhållas från samma gemenskapen beroende på vilken hypervariabel region är förstärkta42. Tidigare studier har funnit regionen V4 är en av de mest tillförlitliga för tilldela taxonomin43 och det har använts för andra omfattande mikrobiomet undersökningar11. Förlänga målet i V3-V4 regionen föreslås här att öka variationen och förbättra taxonomisk upplösning.
I detta protokoll visat vi en rörledning för att utföra 16S rRNA amplikon sekvensering via nästa generations sekvensering (NGS) för att studera mikrobiell gemenskapen kompositioner av miljöprover12. Vi rekommenderar att du använder amplikon sekvensering som ett verktyg för fylogenetiska profilering, eftersom det är relativt billigt, hög genomströmning, och inte kräver omfattande computational kompetens eller resurser att analysera. Medan vår metod är inriktad på att analysera bakteriedelen av microbiom, kan den enkelt anpassas för att undersöka svampar. Protokollet är identiska genom steg 2, och den enda skillnaden i steg 3 är vad grundfärger skulle användas under förstärkning. Det är dock värt någonting att amplikon baserat profilering inte är utan begränsningar. Genom att sekvensera en enda markörgen, erhålls ingen information angående den funktionella kapaciteten hos gemenskapen. Taxonomisk upplösning kan dessutom vara ganska låg, särskilt när sekvensering från miljöer med en hög andel av uncharacterized mikrober. Dock sekvensering teknik utvecklas snabbt och vi räknar med potential att ta itu med några av dessa brister genom att anpassa detta protokoll för användning med andra sekvensering plattformar. Slutligen, som nämnts i inledningen, hagelgevär metagenomik och metatranscriptomics enkelt kan utföras på prover av jord och odlingsbädden och metoder för att eliminera växt kontaminering från växt vävnader undersöks för närvarande. Experimentell design vilket par amplikon-baserat tillvägagångssätt och andra gjorts tekniker kan vara särskilt effektiv i komplexa samhällen där hög artrikedom och ojämn representation av taxa kan förhindra hagelgevär data från korrekt karakterisera mindre dominerande medlemmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS stöds av NSF Graduate Research Fellowship-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
