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Genetics

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Abstract

L'intima interazione tra pianta ospite e microrganismi associati è cruciale nel determinare la pianta fitness e può favorire una migliore tolleranza agli stress abiotici e malattie. Come il microbioma di pianta può essere molto complesso, a basso costo, metodi di high throughput come amplicon di sequenziamento del gene del rRNA 16S sono spesso preferiti per caratterizzare la composizione microbica e la diversità. Tuttavia, la selezione di una metodologia appropriata quando lo svolgimento di tali esperimenti è fondamentale per ridurre le distorsioni che possono rendere difficile analisi e confronti tra campioni e studi. Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia standardizzata per la raccolta e l'estrazione di DNA da terreno, rizosfera ed esempi di radice. Inoltre, evidenziamo una pipeline di sequenziamento consolidata 16S rRNA amplicone che consente per l'esplorazione della composizione delle comunità batteriche in questi campioni e può essere facilmente adattati per altri geni marcatori. Questa pipeline è stata convalidata per una varietà di specie vegetali, tra cui sorgo, mais, frumento, fragola e agave e può aiutare a superare i problemi associati alla contaminazione da organelli di pianta.

Introduction

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Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi possono essere coltivate in isolamento il laboratorio multimediale generato, molti non possono, in parte perché essi possono si basano su relazioni simbiotiche con altri microbi, crescono molto lentamente, o richiedono condizioni che non possono essere replicate in un ambiente di laboratorio. Perché aggira la necessità per la coltivazione ed è relativamente poco costoso e ad alta velocità, analisi filogenetica basata su sequenza di campioni microbici ambientali e host-associato è diventata un metodo comodo per analizzante comunità microbica composizione.

La selezione delle tecnologie di sequenziamento appropriati forniti da vari prossima generazione sequenziamento (NGS) piattaforme1 dipende dalla necessità degli utenti, con importanti fattori tra cui: copertura desiderata, lunghezza amplicon, previsto comunità diversità, come pure sequenziamento tasso di errore, la lettura-lunghezza e il costo-per-Esegui/megabase. Un'altra variabile che deve essere considerato in esperimenti di sequenziamento degli ampliconi è quale gene sarà amplificati e verrà utilizzato quale primer. Quando si progetta o scegliendo gli iniettori, i ricercatori spesso sono costretti a fare compromessi tra l'universalità dell'amplificazione e la risoluzione tassonomica ottenibile dagli ampliconi risultanti. Per questo motivo, questi tipi di studi scelto spesso primer e marcatori che mirare selettivamente specifici sottoinsiemi del microbioma. Valutare la composizione delle comunità batteriche avviene comunemente ordinando uno o più delle regioni ipervariabili del batterici 16S rRNA gene2,3. In questo studio, descriviamo un amplicone basato sequenziamento protocollo sviluppato per una piattaforma NGS quella regione di bp V3-V4 obiettivi la 500 del gene del rRNA 16S batterica, che consente ampia amplificazione dei taxa batterici, fornendo inoltre una sufficiente variabilità a distinguere tra diversi taxa. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con altri set di primer, come quelli targeting il marcatore ITS2 di funghi o la subunità di rRNA 18S degli eucarioti.

Mentre altri approcci come fucile metagenomica, metatranscriptomics e sequenziamento unicellulare, offrono altri vantaggi tra cui risolti genomi microbici e misura più diretta della funzione di comunità, queste tecniche sono in genere più costoso e computazionalmente intensivi rispetto del profilo filogenetico descritto qui4. Inoltre, eseguendo il fucile metagenomica e metatranscriptomics su campioni di radice produce una grande percentuale di letture appartenendo a genoma della pianta ospite e metodi per superare questa limitazione sono ancora in fase sviluppato5,6.

Come con qualsiasi piattaforma sperimentale, profiling basato su amplicone può introdurre un numero di potenziali pregiudizi che dovrebbe essere considerato durante l'analisi di dati di progettazione e sperimentale. Questi includono i metodi di raccolta dei campioni, DNA estrazione, selezione degli iniettori di PCR e come preparazione di libreria viene eseguita. Diversi metodi possono influenzare notevolmente la quantità di dati utilizzabili generati e possono anche ostacolare gli sforzi per confrontare i risultati tra gli studi. Ad esempio, il metodo di rimozione rizosfera batteri7 e l'uso di tecniche di estrazione diversa o scelta di DNA estrazione Kit8,9 sono stati indicati per avere un impatto significativo dell'analisi a valle, che conduce a conclusioni differenti per quanto riguarda cui i microbi sono presenti e loro abbondanza relativa. Poiché profiling basato su amplicone può essere personalizzato, fare paragoni tra gli studi può essere impegnativo. Il progetto microbioma terra ha suggerito che i ricercatori che studiano i sistemi complessi come il microbioma pianta-collegato trarrebbero beneficio dallo sviluppo di protocolli standardizzati come mezzo per ridurre al minimo la variabilità causata dall'applicazione di metodi differenti tra studi10,11. Qui, discutiamo molti degli argomenti di cui sopra e offrire suggerimenti per quanto riguarda le migliori pratiche dove opportuno.

Il protocollo viene illustrato il processo di raccolta del suolo, rizosfera ed esempi di radice da sorgo bicolore ed estrazione DNA usando una consolidata kit di isolamento del DNA11. Inoltre, il nostro protocollo include un flusso di lavoro sequenziamento degli ampliconi dettagliate, utilizzando una piattaforma NGS comunemente utilizzata, per determinare la struttura delle comunità batteriche12,13,14. Questo protocollo è stato convalidato per l'uso in una vasta gamma di ospiti della pianta in un recente studio pubblicato di radici, rizosfera e associati-terreni di 18 specie di monocot compreso Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Questo metodo è stato convalidato anche per l'utilizzo con altri geni marcatori, come dimostrato dalla sua riuscita applicazione allo studio del gene marcatore ITS2 fungo negli studi del agave microbiome16,17 e fragola microbiome 18.

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Protocol

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1. raccolta e separazione della radice Endosphere, rizosfera e campioni di terreno

  1. Prima di entrare il campo, autoclave acqua ultrapura (almeno 90 mL di acqua per esempio) per sterilizzare. Preparare epifita rimozione tampone (almeno 25 mL per campione) aggiungendo 6,75 g di KH2PO4, 8,75 g di K2HPO4e 1 mL di Triton X-100, 1 L di acqua sterile. Sterilizzare il buffer utilizzando un filtro a depressione con pori di 0,2 µm.
    1. Per la procedura 1.2 a 1.5, indossare guanti puliti sterilizzati con etanolo a tutte le volte e sostituire i guanti tra ogni campione per evitare la contaminazione. Tutte le apparecchiature con etanolo al 70% di sterilizzare e pulire tutte le attrezzature tra campioni. Prima del campionamento, determinare la profondità di campionamento ottimale per il tuo esperimento ed essere coerente con tutte le collezioni del suolo e radice.
  2. Per raccogliere campioni di suolo bulk, utilizzare un collezionista di nucleo di terreno sterilizzato di etanolo per ottenere del suolo che è privo di radici delle piante attraverso la raccolta di un nucleo circa 23 a 30 cm dalla base della pianta.
  3. Trasferire il terreno a un sacchetto di plastica, omogeneizzare il terreno mediante agitazione delicata e trasferire un'aliquota del campione di terreno (circa 600 mg) per riempire una provetta da 2 mL. Posizionare immediatamente la provetta da 2 mL su ghiaccio secco o flash congelare il tubo liquido N2 fino al momento di procedere con l'estrazione del DNA (passaggio 2).
    1. In alcuni ambienti, il terreno circostante può contenere materiale vegetale. In questo caso, utilizzare un setaccio sterilizzato 2 mm per separare i detriti vegetali dal suolo prima dell'immissione nel sacchetto di plastica.
  4. Per raccogliere la radice e la rizosfera, utilizzare una pala da etanolo-sterilizzato per scavare la pianta, avendo cura di ottenere tanto della radice come possibile. Profondità dipende dalla pianta. Mentre piccole piante come il grano possono essere rimosso da parecchi centimetri di scavo, piante più grandi come il sorgo possono richiedere 30 cm o più. Agitare delicatamente fuori suolo in eccesso dalle radici fino a quando c'è di circa 2 mm di terreno aderendo alla superficie della radice.
    Nota: fare attenzione quando si lavora con le piccole piante, con radici fragili, o in terreni contenuti secco, alta-argilla. Idealmente, dovrebbe esserci solo un sottile strato di suolo restanti sulle radici dopo l'agitazione. Se rimangono grandi aggregati del suolo, un martello di gomma utilizzabile per sloggiare il terreno premendo delicatamente la base delle riprese. Se la quantità di terreno rimanente dopo questo processo superiore o inferiore a 2 mm, lo spessore approssimativo dovrebbe essere notato.
  5. Per impianti di grandi dimensioni, utilizzare forbici sterili e/o cesoie per tagliare una sottosezione rappresentativa delle radici e inserire un minimo di 500 mg di tessuto di radice in un flaconcino di coniche da 50 mL. Per piccole erbe, posizionare l'intero sistema della radice nel flaconcino. Aggiungere sufficiente buffer di rimozione epifite per coprire le radici, quindi immediatamente mettere il campione sul ghiaccio secco o flash congelare il campione a liquido N2.
    Nota: fare attenzione per non riempire eccessivamente il flaconcino da 50 mL conica, come si fanno lavare un passo difficile. Dovrebbe esserci abbastanza spazio vuoto tale che il buffer di epifite è in grado di fluire verso il basso, circondano le radici in tutto il flaconcino e coprire la parte superiore. Perché alcune erbe hanno più biomassa di radice che si adattano in un flaconcino di coniche da 50 mL, una sottosezione delle radici dovrebbe essere raccolti. Tuttavia, dovrebbe essere notato che le radici di taglio potrebbe portare ad batteri endofiti essere lavati fuori nella frazione rizosfera, rompendo così le radici dovrebbe essere minimizzato. Se i campioni non vengono elaborati immediatamente dopo il ritorno al laboratorio, essi possono essere conservati a-80 ° C.
  6. Per separare la rizosfera dalle radici, scongelare il campione di radice sul ghiaccio, quindi sottoporre ad ultrasuoni i campioni di radice a 4 ° C per 10 min con impulsi di 160 W per 30 s, separati da 30 s. trasferimento le radici in un freddo (4 ° C), pulire il tubo da 50 mL utilizzando pinze sterili. Non gettare il tubo originale con buffer e terreno, che è la frazione di rizosfera (Figura 1).
  7. Centrifugare la provetta contenente tampone e rizosfera per 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantare il supernatante, flash nella provetta contenente la frazione di rizosfera nel liquido N2di congelare e conservare la frazione di rizosfera a-80 ° C fino al momento di procedere con il DNA estrazione (passaggio 2).
  8. Per lavare le radici, aggiungere circa 20 mL di acqua sterile freddo (4 ° C) per la frazione di radice. Lavare la radice agitando vigorosamente (a mano o mixer, per 15-30 s) e poi scolare l'acqua.
  9. Ripetere questo passaggio almeno due volte, fino a quando nessun terreno rimane sulla superficie della radice. Se l'estrazione del DNA (passaggio 2) non viene eseguita immediatamente, avvolgere le radici in un foglio di alluminio sterile, flash congelare le radici in liquido N2e archivio i campioni a-80 ° C fino al pronto a procedere con l'estrazione del DNA.

2. DNA estrazione

Nota: In tutto i passaggi 2 e 3, guanti puliti, sterilizzati con l'etanolo devono essere indossati in ogni momento e tutti i lavori devono essere eseguiti su una superficie sterilizzata con etanolo.

  1. Estrazione del DNA dai campioni del suolo e della rizosfera.
    1. Utilizzare una spatola sterile trasferire velocemente 250 mg del suolo e della rizosfera da passaggi 1.3 e 1.7 nelle provette di raccolta differenziata fornita in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA utilizzando il kit Fornitore protocollo.
    2. Dopo l'eluizione del DNA nel buffer di eluizione in dotazione con il kit di isolamento del DNA, è possibile conservare il DNA a-20 ° C fino al momento di procedere con il passaggio 3.
  2. Estrazione del DNA dai campioni di radice.
    1. Raffreddare un sterilizzato mortaio e pestello usando liquido N2. Misurare 600 a 700 mg di tessuto di radice e posizionare il tessuto nel mortaio. Aggiungere con cautela, abbastanza liquido N2 per coprire le radici.
    2. Macinare le radici in piccoli pezzi. Continuare il processo di aggiunta di liquido N2 e rettifica (almeno due volte, essere coerenti tra campioni), fino a quando le radici sono una polvere fine. Assicurarsi che il tessuto di radice non scongelare durante questo passaggio.
      Attenzione: Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (camice, occhiali protettivi e Guanti criogenici) quando lavorano con liquido N2.
      Nota: Per un'estrazione di DNA di bassa qualità, può essere utile macinare le radici in eccesso in polvere e conservare la polvere a-80 ° C.
    3. Rapidamente, prima della radice polvere inizia a scongelare, utilizzare una spatola sterile per trasferire la polvere di radice nelle provette da 1,5 mL pre-pesati sul ghiaccio. Registrare il peso del tubo e la polvere. In genere, 300-400 mg di polvere viene trasferito.
    4. Utilizzare una spatola sterile per trasferire velocemente 150 mg di polvere di radice verso il tubo di raccolta fornito in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA usando protocollo del fornitore kit.
      Nota: Per alcuni campioni di radice, ci può essere un'alta concentrazione di sostanze organiche restanti nel pellet di DNA, che impedisce l'amplificazione del DNA durante la PCR, soprattutto quando un diverso protocollo di estrazione del DNA (ad es., estrazione CTAB) viene utilizzato. Se necessario, pulire il DNA seguendo le istruzioni fornite nel kit di pulizia ambientale di DNA.
  3. Misurare la concentrazione di tutti i campioni di DNA usando un fluorometro benchtop ad alta sensibilità.
    1. Aggiungere 1-20 µ l di ciascun campione di DNA eluite in tubi forniti nel kit di test ad alta sensibilità di dsDNA. Aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200) fino a 200 µ l.
    2. Preparare due altre provette contenenti 10 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA) o 10 µ l di campione 2 (100 ng / µ l) e aggiungere 190 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro ad ogni livello.
    3. Misurare la concentrazione di norme e di ogni campione. Se non viene fatto automaticamente, è possibile calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare tra le due norme.

3. presentazione e preparazione amplicone biblioteca

  1. Impostare i materiali per la reazione di amplificazione.
    1. Scongelare i campioni di DNA a 4 ° C e tenerli sul ghiaccio durante il passaggio 3. Randomizzare l'ordine dei campioni di DNA per minimizzare la distorsione a causa della posizione sulla piastra PCR (tabella 2).
    2. In una piastra PCR a 96 pozzetti, diluire DNA da ogni campione in acqua grado molecolare a 5 ng / µ l in un volume totale di 20 µ l. aggiungere 20 µ l acqua di grado molecolare dei pozzetti di quattro angolo come controllo negativo per l'amplificazione (vuote) (tabella 2).
    3. Organizzare gli iniettori con codice a barre (10 µM) in provette per PCR striscia o una piastra a 96 pozzetti, tale che possono essere aggiunti con una pipetta multicanale (Figura 2).
    4. Preparare il mix master sufficiente di PCR per amplificare ogni campione di DNA in triplice copia. Preparare 1,5 µ l di BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l di pre-fatte 2 x mix master (composta da tampone di PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerasi), 0,57 µ l del cloroplasto PNA (100 µM), 0,57 µ l di PNA mitocondriale (100 µM) e 25.86 µ l di acqua di grado molecolare.
    5. Versare il mix master in una sterile 25 mL di serbatoio pipetta multicanale e distribuire 66 µ l di master mix in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
      Nota: Quando calcolo di volumi di reagente per il mix master, assicurarsi di includere anche 4 pozzetti del bianco per piastra.
    6. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 6 µ l di DNA (dalla piastra di DNA normalizzato) alla piastra di mix master di 5 ng / µ l. Quindi aggiungere il master piatto 1,5 µ l di primer in avanti di 10 µM tale che ogni colonna ha un diverso codice a barre in avanti e 1,5 µ l di 10 µM reverse primer in modo tale che ogni riga ha un codice a barre inverso diverso (Figura 2).
      Nota: Prima di aggiungere gli iniettori, le piastre randomizzati e mix master possono essere utilizzati per amplificare i geni fungini ITS o ITS2 se sono stati aggiunti diversi primer. Se questo è il caso, un simile disegno dell'iniettore può essere utilizzato.
    7. Selezione verso il basso la piastra brevemente a 3.000 x g. utilizzare una pipetta multicanale per mescolare delicatamente, quindi dividere in tre piastre con 25 µ l di miscela di reazione.
      Nota: Anche se tre replicati non sono strettamente necessarie, si riduce l'impatto della variabilità tecnica.
  2. Amplificare il DNA in ogni piastra utilizzando un termociclatore impostare le seguenti condizioni: 180 s a 98 ° C, 30 cicli di: 98 ° C per 45 s (denaturazione), 78 ° C per 10 s (PNA ricottura), 55 ° C per 60 s (ricottura di primer) e 72 ° C per 90 s (estensione) , quindi 600 s a 72 ° C, seguita da una 4 ° C tenere il passo. Dopo l'amplificazione, piscina le tre lastre di replicare in una singola piastra a 96 pozzetti.
  3. Quantificare il DNA utilizzando reagenti fluorometro di alto-sensibilità in un lettore di piastra a 96 pozzetti.
    1. Aggiungere 2 µ l di ciascun prodotto PCR di una micropiastra a 96 pozzetti, insieme a 98 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200). Sono 4 pozzi come standard: 5 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA), 1 µ l di campione 2 (10 ng / µ l), 2 µ l di campione 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l di campione 2 (50 ng / µ l). Quindi aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro per un volume finale di 100 µ l.
      Nota: Ogni campione può essere misurata usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3, se un lettore non è disponibile.
    2. Calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare dei quattro standard.
    3. Per il codice a barre con successo amplificato prodotti (quelli che hanno una concentrazione maggiore di 15 ng / µ l), piscina di 100 ng di ciascun campione in una provetta di singolo 1,5 mL (tabella 2).
    4. Calcolare il volume medio dei campioni aggiunto al pool utilizzando la funzione =AVERAGE() in un programma di foglio di calcolo. Aggiungere il volume dei prodotti di PCR "in bianco" per il pool di campioni.
      Nota: Poiché i "vuoti" prodotti di PCR hanno loro proprie combinazioni di codice a barre univoco, può essere sequenziate per verificare eventuali contaminanti di laboratorio.
  4. Misurare la concentrazione del prodotto pool utilizzando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3 e prendere 600 ng di DNA e diluire in acqua di grado molecolare ad un volume finale di 100 µ l in una provetta da 1,5 mL. Conservare il prodotto rimanente in pool a-20 ° C.
  5. Lavare il 600 ng DNA aliquota seguendo il processo di purificazione di PCR stabilito con i branelli di purificazione paramagnetica in un formato a 96 pozzetti con poche eccezioni.
    1. Fare un fresco 600 µ l aliquota di etanolo al 70%. Agitare il flacone di biglie magnetiche per risospendere perline che si depositano sul fondo.
    2. Aggiungere volume x 1 (100 µ l) di soluzione di perlina a parte aliquota 600 ng di DNA. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Collocare la provetta sul supporto magnetico per 2 minuti (o fino a quando la soluzione è limpida) per separare le perle dalla soluzione. Mentre il filmato è ancora nel supporto magnetico, aspirare il supernatante chiaro con attenzione senza toccare i branelli magnetici e scartare il supernatante chiaro.
      Nota: A questo punto, i prodotti di ampliconi sono tenuti a biglie magnetiche. Tutti i branelli che sono disturbato o perso durante l'aspirazione si tradurrà in una perdita di DNA.
    4. Lasciare il tubo nel supporto magnetico e aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% per il tubo; Incubare a temperatura ambiente per 30 s. aspirato fuori l'etanolo e scartare. Ripetere questo processo ed eliminare l'etanolo tutti dopo il secondo lavaggio. Togliere il tubo dal supporto magnetico e aria secca per 5 min.
    5. Aggiungere 30 µ l di acqua grado molecolare ai talloni secchi e Miscelare pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 2 min ritorno il tubo per il supporto magnetico per 1 min per separare le perle dalla soluzione. Trasferire l'eluato ad un nuovo tubo.
      Nota: Biglie magnetiche non influenzerà le reazioni a valle.
  6. Misurare la concentrazione finale di puliti, pool DNA usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3. Diluire una parte aliquota di 10 nM in un volume finale di 30 µ l, o alla concentrazione e volume preferito da parte dell'impianto di sequenziamento.
  7. Utilizzare i servizi di una struttura di sequenziamento per sequenziare il DNA su una piattaforma NGS, 2 x 300 sequenziamento accoppiato-fine di bp.

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Representative Results

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Eseguire il protocollo raccomandato dovrebbe comportare un dataset di indicizzata fine accoppiato letture che possono essere abbinati torna a ciascun campione e assegnate a entrambi un batterico unità tassonomica operative (OTU) o variante di sequenza esatta (ESV, noto anche come amplicone variante di sequenza (ASV) e sub-operational unità tassonomica (sOTU)), a seconda dell'analisi a valle. Al fine di ottenere dati di sequenza di alta qualità, si deve prestare attenzione ad ogni passo per mantenere la coerenza tra campioni e minimizzare l'introduzione di eventuali potenziali bias durante l'elaborazione del campione o la preparazione di biblioteca. Dopo la raccolta, l'elaborazione e l'estrazione del DNA da campioni (passaggi 1 e 2), l'eluato risultante dovrebbe apparire chiaro e privo di sostanze organiche che inibirebbe l'amplificazione. Mentre la purezza può essere verificato misurando ogni campione di DNA tramite uno spettrofotometro di microvolume, abbiamo trovato che il terreno kit di estrazione del DNA rimuove in modo affidabile tutti i contaminanti. Come risultato la qualità del DNA prevedibile, metodi di quantificazione che si basano su coloranti basati sulla fluorescenza che legano specificamente DNA sono più appropriati rispetto a quelli basati su UV assorbanza19,20,21. Prima dell'amplificazione di PCR, campioni del suolo e della rizosfera media circa 10 ng / µ l DNA, mentre i campioni radice in genere hanno una concentrazione media di circa 30 ng / µ l (tabella 2).

In seguito l'amplificazione del DNA ambientale (passaggio 3), il successo o il fallimento può essere determinato misurando la concentrazione del prodotto della PCR tramite reagenti fluorimetro benchtop su un lettore di piastre, se disponibile, o manualmente (tabella 2). Nella nostra esperienza, amplificazioni di successo che si traducono in dati di alta qualità amplicone rendimenti superiori al 15 prodotti di PCR ng / µ l. Se ci sono più errori su un piatto, la disposizione posizionale all'interno dell'impianto e il tipo di campione dei campioni non riusciti può aiutare a determinare il problema. Per esempio, se sono tutte adiacenti sulla piastra, può indicare pipetta errore, mentre se sono tutti nella stessa riga o colonna, potrebbe suggerire problemi con un primer specifico. Se appartengono allo stesso tipo di campione, potrebbe suggerire problemi con trattamento del campione o estrazione del DNA.

È importante verificare la compatibilità dei PNA universale con il tuo bioinformatically di sistema specifico dell'impianto durante il disegno sperimentale al fine di verificare che essi si bloccherà amplificazione del cloroplasto e geni mitocondriali 16S. Dopo la fase di amplificazione, non è chiaro se il PNAs associato correttamente a mitocondriale e cloroplastico modelli; Questo si rivela solo dopo l'ordinamento (Figura 3). Per contribuire a garantire che il PNAs efficacemente blocca l'amplificazione di contaminante, un allineamento della sequenza PNA ogni cloroplasto e gene mitocondriale 16S rRNA (potrebbero esservi più copie) per la pianta ospitante indagato non rivelerete qualsiasi mancata corrispondenza . Anche un singolo disadattamento alla successione PNA bp 13, specialmente in mezzo al morsetto PNA, può ridurre drasticamente l'efficacia, come nel caso della sequenza PNA fornito cloroplasto e gene del rRNA 16S cloroplasto di Lactuca sativa (lattuga) ( Figura 3).

Poiché una pari quantità di DNA amplificato viene raccolto per campione, ci dovrebbe essere un numero circa anche di letture ottenuto per campione dopo sequenziamento e la cernita letture basate il loro indice di codice a barre (Figura 4). La maggior parte di queste letture deve corrispondere a taxa batterici. Ogni eucariote, mitocondriale, o cloroplasto partite devono essere eliminati. A seconda della pipeline di analisi e tassonomico database scelto, cloroplasto e letture mitocondriale possono erroneamente essere assegnate a lignaggi batteriche, spesso cianobatteri e Rickesttia, rispettivamente (Figura 3). Un grado di curatela manuale spesso è prudente per verificare queste mis-assegnazioni comune. Dettagli specifici dipenderà la scelta di analisi, ma abbondanza relativa profili generalmente dovrebbero essere simili (nessuna differenza significativa) tra repliche biologiche e significativamente differenti fra suolo, rizosfera ed esempi di radice (Figura 5 ). È importante notare, tuttavia, che mentre non ci può essere alcuna differenza significativa tra replicati biologici, è importante raccogliere almeno tre ripetizioni per.

Metodi per l'interpretazione dei dati ottenuti in questi esperimenti sono oggetto di accesi dibattiti tra ecologi microbici. Fino a poco tempo, analisi di sequenza di amplicon è stato dipendente di raggruppare le letture in OTUs. Tuttavia, queste sono problematiche perché: 1) sono basati su una soglia arbitraria di somiglianza di 97%, 2) la diversità è spesso sottovalutata e 3) ci può essere bassa risoluzione tassonomica. Recentemente sviluppati strumenti quali DADA2, Deblur e UNOISE222,23,24 sono in grado di ordinare le letture nella ESV, che risolve alcuni problemi presentati quando si utilizza OTUs. Avvertenze all'utilizzo gli ESV includono: 1) artificiale aumenta nella diversità a causa delle differenze nelle copie di rRNA all'interno di una specie e 2) aumento della sensibilità alla PCR e sequenziamento errori25,26.

Figure 1
Figura 1: separazione delle frazioni di radice e rizosfera. Diagramma di flusso visualizzati i passaggi per la separazione nella rizosfera dai campioni di radice, seguiti da lavaggio le radici con acqua sterile per rimuovere qualsiasi residuo organismi rhizoplane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: esempio di layout di magazzino primer per l'amplificazione e distribuzione all'interno di piastre. Stock primer (tabella 1) può essere preparato in tubi in striscia per una distribuzione ottimale all'interno di piastre da 96 pozzetti (ogni striscia degli iniettori è rappresentato da un colore diverso; viola per forward primer 1-8, arancione per inoltrare gli iniettori 9-16, blu per iniettori d'inversione 1-12 e verde per reverse primer 13-16.) In questo caso, 16 avanti e 16 iniettori d'inversione possono essere distribuiti in modo efficiente con una pipetta multicanale tale che ognuno ha anche una combinazione di codice a barre univoco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risultati che suggeriscono il cloroplasto PNA è inefficace. Risultato rappresentativo dalla rizosfera ("Rhizo"), radice e campioni di terreno da lattuga che erano non trattati (NT) o trattati (VT) con un ammendante del terreno biologico. La sequenza PNA utilizzata per bloccare la contaminazione del cloroplasto della maggior parte delle piante è GGCTCAACCCTGGACAG27. Tuttavia, la lattuga contiene una mancata corrispondenza nel gene del RNA ribosomiale 16S cloroplasto (GGCTCAACTCTGGACAG). Questo rende il PNA inefficace, risultante in un'alta relativa abbondanza di letture che corrispondono ai cianobatteri nei campioni rizosfera e radice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: distribuzione di lettura conta tra i campioni in una libreria. Grafico a barre Mostra numero di leggere conteggi (asse y) da diversi campioni (bar, asse x), accompagnati dalla combinazione di codice a barre nella lettura. Il numero di letture per campione può variare in base quanti campioni sono nella biblioteca; Questo sottoinsieme è stato sequenziato in una libreria di 192 campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: abbondanza relativa delle classi in radice, rizosfera e comunità del suolo top 12. Grafico a barre in pila risultati abbondanza relativa delle classi presenti in un dataset di rappresentante 16S contenente 6 replica per ogni tipo di campione (terreno alla rinfusa, rizosfera e radice endosphere). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: primer per l'amplificazione della regione V3-V4 del gene del rRNA 16S. Gli iniettori sono composte, in sequenza: un adattatore per una piattaforma comune di NGS, un codice a barre univoco, il primer per NGS, una regione del distanziatore di lunghezza variabile per spostare la cornice per il sequenziamento e un primer PCR universale che amplifica o 341F o 785R del gene del rRNA 16S. Il numero di primer necessari dipende quanti campioni sono in sequenza per libreria; una combinazione di 16 avanti e 16 iniettori d'inversione è sufficiente per 244 campioni (256 combinazioni di primer con 12 utilizzato per pozzetti del bianco durante la PCR (Figura 2)). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 2: normalizzazione del DNA randomizzato campioni prima e dopo amplificazione. Foglio di lavoro di esempio elencando i campioni in un ordine randomizzato e che indica la loro posizione su una singola piastra a 96 pozzetti, che determina anche la combinazione di primer assegnata ad esso. Le formule nella riga inferiore descrivono calcoli per l'aggiunta di 100 ng di ogni campione per la piastra normalizzata, più il volume d'acqua per raggiungere 20 µ l. Dopo l'amplificazione, il volume di 100 ng di ogni prodotto di successo è calcolati e aggiunti a un pool di finale. Il volume del prodotto PCR "in bianco" per aggiungere al pool finale è la media degli altri esempi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare figura 1: ravvicinamento delle biomasse radice minimo durante il prelievo. Quando raccolta radici, tenta di raccogliere almeno 500 mg di tessuto. Qui, le radici raccolti da una pianta giovane sorgo (sinistra, in entrambi A e B) e una pianta di riso giovane (a destra) vengono visualizzati accanto a (A) e all'interno di provette coniche (B) 50 mL. Entrambi i campioni pesano circa 1 g, tuttavia, è importante notare che questo peso include rizosfera e radice, e il peso di rizosfera è, in questo caso, circa la metà del peso totale. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

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Questo protocollo dimostra una pipeline stabilita per esplorare radice endosphere, rizosfera e composizioni di comunità microbica del suolo, dalla campionatura del campo di trattamento del campione e sequenziamento a valle. Studio associato radice microbiomi presenta sfide uniche, dovuto in parte per le difficoltà insite nel campionamento dal suolo. I terreni sono altamente variabile in termini di proprietà fisiche e chimiche, e condizioni del terreno possono essere separate da appena pochi millimetri28,29. Questo può portare a esempi in cui vengono raccolti dai siti di campionamento adiacenti avendo composizioni considerevolmente diverse comunità microbica e attività30,31. Così, utilizzando terreno nucleo collezionisti e pale per mantenere la profondità di campionamento coerente e omogeneizzazione prima dell'estrazione del DNA sono essenziali per la riproducibilità nell'ambito degli studi microbioma di radice. È anche essenziale per separare in modo efficiente le frazioni rizosfera e radice; utilizzando un metodo duro di sterilizzazione superficiale radice potenzialmente può lisare endofiti all'interno radici prima dell'estrazione del DNA, mentre un lavaggio più conservativo potrebbe non rimuovere tutti i microbi dalla radice superficie7. Un altro fattore chiave che possa negativamente influire o perturbare i risultati di sequenziamento è contaminazione batterica, che può venire da molte fonti e a volte è impossibile distinguere dal batteri ambientali campionate32,33. Per questo motivo, un'attenta sterilizzazione degli strumenti di campionamento, materiali sperimentali e ambienti di lavoro sono di vitale importanza al fine di evitare la contaminazione.

Dopo il campionamento, ottenere DNA di alta qualità è una priorità per successo analisi a valle. Nella nostra esperienza, estrazione di DNA da campo cresciuti campioni di radice attraverso metodi alternativi, come attraverso estrazione basata su CTAB, spesso contengono sostanzialmente maggiori quantità di acidi umici e altri composti rispetto ai campioni del terreno e della rizosfera. Questi composti possono prevenire l'attività enzimatica della DNA polimerasi durante l'amplificazione di PCR, anche a basse concentrazioni34,35. Con l'estrazione di DNA kit progettato per i terricci su campioni di radice, al contrario di un'estrazione CTAB seguita da un fenolo cloroformio pulitura, può efficacemente eliminare campioni di acidi umici e si tradurrà in alta qualità DNA36,37, 38,39. Di conseguenza, si consiglia di utilizzare un kit di estrazione di DNA disponibile in commercio per campioni di radice come pure. Si noti che l'obiettivo è di ottenere DNA genomico microbico dalle radici della pianta. Così, rettifica radice accurata e uniforme è importante abbattere i tessuti vegetali e lisare le cellule microbiche per rilasciare DNA microbico senza introdurre bias tra i campioni a causa delle variazioni nella pressione e tempo di macinazione.

A seguito di un'attenta estrazione del DNA da campioni, ci sono due fonti principali per problemi durante l'amplificazione: 1) contaminazione dei tessuti vegetali con pianta endosimbionti (cloroplasti e mitocondri) e 2) selezione della regione di rRNA 16S per amplificare. L'amplificazione da cloroplasti o mitocondri 16S rRNA sequenze possono generare > 80% delle sequenze nella radice campioni40e più nei tessuti fogliari, però la quantità di contaminazione è dipenda dalla scelta dei primer. Morsetti PNA sono quindi necessari durante la fase PCR per sopprimere la pianta ospitante cloroplasto e mitocondriale 16S contaminazione27,41. Tuttavia, diverse specie di piante può avere variazione nel cloroplasto e mitocondriale 16S sequenza27; Pertanto, è essenziale per confermare la sequenza del cloroplasto e geni mitocondriali 16S della pianta in fase di studio prima del sequenziamento di biblioteca, al fine di determinare se sono necessari i oligos PNA alternativi (Figura 3). Inoltre, il gene del rRNA 16S è costituito da nove regioni ipervariabili affiancate da nove regioni conservatore; diversi risultati possono essere ottenuti dalla stessa comunità dipendendo dalla quale regione ipervariabile è amplificata42. Precedenti studi hanno trovato la regione V4 per essere uno dei più affidabili per assegnando tassonomia43 ed esso è stato utilizzato per altri microbiome vaste indagini11. Allungando la destinazione alla regione V3-V4 è suggerito qui per aumentare la variabilità e migliorare la risoluzione tassonomica.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato una pipeline per eseguire amplicon del rRNA 16S tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS) per lo studio di composizioni di comunità microbica di campioni ambientali12. Si consiglia di utilizzare il sequenziamento degli ampliconi come strumento per l'analisi filogenetica, perché è relativamente poco costoso, ad alta produttività e non richiede ampie competenze computazionali o risorse per analizzare. Mentre il nostro metodo si concentra sull'analisi la frazione batterica del microbioma, può essere facilmente adattato per studiare i funghi. Il protocollo è identico fino al passo 2, e l'unica differenza nel passaggio 3 è quale primer sarebbe stato utilizzato durante l'amplificazione. Tuttavia, vale la pena di nulla che amplicone basato profilatura non è senza limitazioni. Sequenziando un gene marcatore singolo, non sono ottenere informazioni per quanto riguarda la capacità funzionale della Comunità. Inoltre, la risoluzione tassonomica può essere piuttosto bassa, soprattutto durante la sequenziazione da ambienti con un'alta percentuale di microbi atipici. Tuttavia, tecnologie di sequenziamento sono in rapida evoluzione, e anticipiamo il potenziale per affrontare alcune di queste carenze, adattando questo protocollo per l'uso con altre piattaforme di sequenziamento. Infine, come accennato nell'introduzione, metatranscriptomics e fucile metagenomica facilmente può essere eseguita su campioni di suolo e della rizosfera e metodi per eliminare la contaminazione della pianta dai tessuti vegetali sono attualmente in fase di studio. Disegni sperimentali quali approcci basati su amplicon di coppia e altre tecniche di metagenomica possono essere particolarmente efficace nella Comunità complesse dove alta biodiversità e irregolare rappresentazione dei taxa può impedire dati fucile da accuratamente che caratterizzano il meno membri dominanti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS è supportato dal NSF Graduate Research Fellowship Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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References

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Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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