Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57561
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

Abstract

האינטראקציה אינטימי בין המארח צמחים ומיקרואורגניזמים המשויך הוא קריטי לקביעת כושר צמח, שיכול לטפח עמידות משופרת בפני והאביוטיים לחצים ומחלות. ככל microbiome הצמח יכול להיות מאוד מורכבות, בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה שיטות כמו מבוססי אמפליקון רצף של הגן rRNA מטוסי אף-16 לעיתים קרובות המועדפת על אפיון הרכב מיקרוביאלי והמגוון שלה. עם זאת, הבחירה של המתודולוגיה המתאימה כאשר עורכים ניסויים אלה חיוני להפחתת הטיות שיכולים לעשות ניתוח והשוואות בין מחקרים ודוגמאות קשה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט מתודולוגיה מתוקננת מספקת כדי להפוך את אוסף מן האדמה, rhizosphere, ודוגמאות שורש החילוץ של ה-DNA. בנוסף, אנחנו לסמן קו 16 ומבוססת rRNA אמפליקון רצף צינור המאפשר עבור חקר ההרכב של קהילות חיידקי בדגימות אלה, ולא ניתן להתאים בקלות עבור גנים סמן אחרים. צינור זה אומתה למגוון רחב של מיני צמחים, כולל סורגום, תירס, חיטה, תות שדה, אגבה, והוא יכול לעזור להתגבר על בעיות הקשורות לזיהום של צמח organelles.

Introduction

צמח-הקשורים microbiomes מורכב דינאמי ומורכב קהילות מיקרוביאלית של חיידקים ארכאונים, וירוסים, פטריות, מיקרואורגניזמים אחרים האיקריוטים. בנוסף תפקידם למד היטב בגרימת מחלות צמחים, חיידקים הקשורים צמח יכול גם להשפיע לטובה על בריאות הצמח על ידי שיפור עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים קידום זמינות חומרי הזנה, שיפור צימוח דרך הייצור של phytohormones. מסיבה זו, קיים עניין מיוחד באפיון taxa מקשר עם הצמח שורש endospheres, rhizospheres את האדמה שמסביב. בעוד כמה חיידקים יכולים להיות בתרבית בבידוד במדיה שנוצר מעבדה, רבים לא ניתן, בין השאר כי הם עשויים מסתמכים על יחסי סימביוזה עם חיידקים אחרים, גדלים באיטיות, או דורשים תנאים שלא ניתן לשכפל בסביבת מעבדה. בגלל זה עוקף את הצורך בטיפוח והוא יחסית זול, תפוקה גבוהה, המבוססת על רצף פילוגנטי פרופיל של דגימות מיקרוביאלי סביבתיים הקשורים מארח הפכה שיטה מועדפות assaying קהילת חיידקים ההרכב.

הבחירה של טכנולוגיות רצף המתאימים שסופקו על-ידי שונים הדור הבא רצף פלטפורמות (הגדרות)1 היא תלויה צורכי המשתמשים, עם גורמים חשובים כולל: כיסוי הרצוי, אורך אמפליקון, צפוי הקהילה גיוון, כמו גם קביעת רצף שיעור שגיאה באורך לקריאה, את העלות-לכל-ההפעלה/megabase. משתנה נוסף צריך להיחשב בניסויים מבוססי אמפליקון רצף הוא ג'ין מה הגברה מה תחל לשמש. בעת תכנון או בחירת צבעי בסיס, חוקרים נאלצים לעיתים קרובות לבצע עיסקאות חליפין בין האוניברסליות של הגברה הרזולוציה בטקסונומיה השגה מ amplicons שנוצר. מסיבה זו, אלו סוגים של מחקרים בחרה לעיתים קרובות תחל וסמנים המיועדות באופן סלקטיבי הנדונים של microbiome. הערכת ההרכב של קהילות חיידקי מושגת בדרך כלל על ידי רצף אחד או יותר של האזורים hypervariable של2,3גנים rRNA 16 חיידקי. במחקר זה, אנו מתארים של אמפליקון המבוסס רצף פרוטוקול שפותחו עבור פלטפורמה המיתרים באותו אזור bp V3-V4 מטרות ה-500 של הגן rRNA חיידקי מטוסי אף-16, המאפשר הגברה רחבה של חיידקי taxa גם בעת מתן השתנות מספיקות כדי מבחין בין taxa שונים. בנוסף, פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים לשימוש עם ערכות פריימר אחרות, כגון אלה פילוח הסמן ITS2 של פטריות או יחידת משנה של rRNA 18S של פרוקריוטים.

ואילו השני מתקרב כגון רובה metagenomics, metatranscriptomics ורצף מתא בודד, מציעים יתרונות נוספים לרבות הגנום מיקרוביאלי נפתרה ומדידה ישירה יותר של פונקציית הקהילה, טכניקות אלה הן בדרך כלל יותר יקר ולא שהמפתחות אינטנסיבית יותר פרופיל פילוגנטי המתוארים כאן4. בנוסף, ביצוע רובה metagenomics ו- metatranscriptomics על בסיס דגימות התשואות ואחוז גדול של קריאות השייכים הגנום הצמח הפונדקאי, שיטות להתגבר על מגבלה זו מתבצעת עדיין מפותח5,6.

כמו עם כל פלטפורמה ניסיוני, מבוסס אמפליקון פרופיל יכול להציג את מספר הטיות אפשריות אשר יש לקחת בחשבון במהלך עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. אלה כוללים שיטות איסוף הדגימה DNA החילוץ, מבחר של PCR תחל, איך מתבצעת ההכנה הספרייה. שיטות שונות יכולים להשפיע באופן משמעותי את כמות הנתונים שמיש שנוצר, גם יכול לעכב את המאמצים כדי להשוות בין תוצאות בין מחקרים. לדוגמה, שיטת הסרת חיידקים rhizosphere7 והשימוש בטכניקות שונות מיצוי או ברירה של דנ א מיצוי ערכות8,9 הוכחו להשפיע באופן משמעותי ניתוח במורד הזרם, מה שמוביל מסקנות שונות לגבי אשר חיידקים הם המתנה ו- abundances היחסי שלהם. מאז מבוססי אמפליקון פרופיל יכול להיות מותאם אישית, ביצוע השוואות בין לימודי יכול להיות מאתגר. הפרויקט Microbiome הארץ הציע כי החוקרים ללמוד מערכות מורכבות כגון microbiome צמח-הקשורים ירוויחו הפיתוח של פרוטוקולים סטנדרטיים, כאמצעי מזעור ההשתנות נגרם על-ידי היישום של שיטות שונות בין מחקרים10,11. כאן, נדון רבים מן הנושאים הנ ל, להציע הצעות לגבי שיטות עבודה מומלצות היכן המתאים.

הפרוטוקול מדגים את התהליך של איסוף קרקע, rhizosphere, ודוגמאות השורש של דורה bicolor ודנ א חילוץ באמצעות ומבוססת DNA בידוד ערכת11. בנוסף, פרוטוקול שלנו כולל אמפליקון מפורט רצף זרימת עבודה, באמצעות פלטפורמה הגדרות שימוש נפוץ, כדי לקבוע את המבנה של קהילות חיידקי12,13,14. פרוטוקול זה אומתה לשימוש במגוון רחב של צמחים מארחים במחקר שפורסם לאחרונה של שורשים, rhizosphere, הקשורים-קרקעות של 18 מינים monocot, כולל דורה bicolor, זיה מייז, ו חיטת הלחם15. שיטה זו גם אומתה לשימוש עם גנים אחרים סמן, כפי שמתואר על-ידי היישום המוצלח שלה ללמוד את הגן סמן ITS2 פטרייתי במחקרים של אגבה microbiome16,17 , תות microbiome 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איסוף והפרדה של שורש Endosphere, Rhizosphere, דגימות אדמה

  1. לפני הכניסה למגרש, תא לחץ מים הנדסה גנטית (לפחות 90 מ"ל של מים עבור דגימה) לחטא. להכין אפיפיט הסרת מאגר (לפחות 25 מ לכל דגימה) על-ידי הוספת 6.75 גרם2פו ח'4, 8.75 g K-2-HPO-4ו- 1 מ"ל של טריטון X-100, 1 ליטר של מים סטריליים. לעקר את המאגר באמצעות מסנן ואקום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.2.
    1. לקבלת צעדים 1.2 עד 1.5, לבשו כפפות נקי מחוטא עם אתנול בכלל פעמים והחלף את הכפפות בין כל מדגם למניעת זיהום. לעקר את כל הציוד עם 70% אתנול, תנקה כל הציוד בין הדגימות. לפני דגימה, לקבוע את עומק דגימה מיטבי עבור הניסוי שלך, להיות עקבי עם כל האוספים אדמה ושורש.
  2. כדי לאסוף דגימות. אדמה בתפזורת, השתמש אספן הליבה אתנול-עיקור קרקע להשגת אדמת חינם שורשי הצמח על ידי איסוף ליבה של 23 עד 30 ס מ מבסיס הצמח.
  3. להעביר את הקרקע שקית ניילון, homogenize את הקרקע ע י ניעור עדין, העברה של aliquot של המדגם אדמה (כ 600 מ ג) למלא שפופרת אחת 2 מ"ל. מיד במקום הצינור 2 מ"ל על קרח יבש או פלאש להקפיא את הצינור נוזלי N2 עד מוכן להמשיך עם ה-DNA החילוץ (שלב 2).
    1. בסביבות מסוימות, האדמה שמסביב יכולים להכיל חומר צמחי. במקרה זה, השתמש מסננת סטיריליים 2 מ מ להפריד את הלכלוך צמח האדמה לפני הצבתו בשקית פלסטיק.
  4. כדי לאסוף את השורש ואת rhizosphere, להשתמש האת של אתנול-לעקר לגלות את הצמח, מקפיד לקבל כל כך הרבה של השורש ככל האפשר. עומק יהיה תלוי הצמח. בעוד מפעלים קטנים כמו חיטה ניתן להסיר על ידי מציאת מספר סנטימטרים, צמחים גדולים יותר כגון דורה עשויים לדרוש 30 ס מ או יותר. בעדינות לנער עודפי אדמה מן השורשים עד כ- 2 מ מ של אדמה הקפדה על פני השורש.
    הערה: תשמרי כאשר עובדים עם מפעלים קטנים, עם שורשים שביר או בקרקעות תוכן יבש, קליי גבוהה. באופן אידיאלי, צריך רק להיות שכבה דקה של האדמה שנותרו על השורשים לאחר רועדת. אם נשארים אגרגטים גדולים של אדמה, פטיש גומי יכול לשמש כדי לסלק את האדמה על ידי להכות בעדינות את הבסיס של הצילומים. אם כמות אדמה שנותרה לאחר תהליך זה חורג או נופל קצר של 2 מ מ, עובי משוער יש לציין.
  5. צמחים גדולים, לשימוש מספריים סטרילי ו/או מספריים כדי לגזור תת נציג של שורשים מקום לפחות 500 מ ג של רקמת השורש לתוך בקבוקון חרוט 50 מ. לקבלת עשבים קטנים יותר, למקם מערכת השורשים כולו לתוך הבקבוקון. הוסף את מאגר להסרת אפיפיט מספיק כדי לכסות את השורשים, ואז מיד שים המדגם על קרח יבש או פלאש להקפיא את דגימת נוזל N2.
    הערה: הקפידו לא תמלא יותר מדי את המבחנה חרוט של 50 מ ל, לעשות כביסה שלב קשה. צריך להיות די שטח ריק כך המאגר אפיפיט היא היכולת לזרום לתחתית להקיף את השורשים לכל אורך המבחנה, לכסות את החלק העליון. בגלל כמה עשבים ביומסה שורש יותר מכפי שניתן לתוך בקבוקון חרוט 50 מ ל, צריך לאסוף סעיף משנה של השורשים. עם זאת, יצוין כי חיתוך השורשים עלולה להוביל חיידקים endophytic להיות נשטף החוצה לתוך השבר rhizosphere, אז פרץ שורשים צריך להיות ממוזער. אם הדגימות לא יעובדו מיד לאחר מבוקש מעבדה, והם יכולים להיות מאוחסנים ב- 80 ° c
  6. כדי להפריד את rhizosphere מן השורשים, להפשיר המדגם השורש על קרח, ואז sonicate את הדגימות שורש ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם פולסים של 160 W ב-30 s, מופרדים על ידי העברה ס' 30 השורשים לתוך צונן (4 ° C), 50 מ ל צינור באמצעות מלקחיים סטרילי נקי. אל תשליך את הצינור המקורי עם מאגר ואדמה, שהינו השבר rhizosphere (איור 1).
  7. Centrifuge הצינור המכיל מאגר של rhizosphere במשך 10 דקות ב 4 ° C, x 4,000 ג'י Decant תגובת שיקוע, פלאש להקפיא את הצינור המכיל את השבר rhizosphere נוזלי N2, ולאחר לאחסן את השבר rhizosphere ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם ה-DNA חילוץ (שלב 2).
  8. לשטוף את השורשים, להוסיף כ 20 מ ל מים סטריליים צוננת (4 ° C) השבר שורש. לשטוף את השורש ע י ניעור נמרצות (על ידי היד או מערבל, עבור s 15-30) ולאחר מכן לנקז את המים.
  9. חזור על שלב זה לפחות פעמיים, עד הקרקע לא נשאר על פני השורש. אם הפקת דנ א (שלב 2) לא מתבצעת מיידית, לעטוף את השורשים בנייר אלומיניום סטרילי, פלאש להקפיא את השורשים נוזלי N2וחנות הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם מיצוי הדנ א.

2. הפקת דנ א

הערה: במהלך שלבים 2 ו-3, כפפות נקי מחוטא עם אתנול לענידה בכל עת, כל העבודה יש לבצעו על משטח לעקר עם אתנול.

  1. תמצית ה-DNA בין דגימות קרקע ומי rhizosphere.
    1. השתמש במרית סטרילי להעביר במהירות את 250 מ"ג של אדמה, rhizosphere מצעדי 1.3 ו 1.7 לתוך צינורות אוסף נפרד המסופקים בערכה בידוד של דנ א מסחרי המיועד לחילוץ מן הקרקע, ואז להמשיך עם ה-DNA בידוד באמצעות של הספק ערכת פרוטוקול.
    2. לאחר eluting ה-DNA במאגר • תנאי שסופק על-ידי ערכת בידוד ה-DNA, לאחסן את ה-DNA ב-20 ° C עד מוכן להמשיך את שלב 3.
  2. תמצית ה-DNA בין דגימות שורש.
    1. מקררים ומכתש סטיריליים באמצעות נוזל N2. למדוד את 600-700 מ"ג של רקמת השורש ולמקם את הרקמה לתוך המליטה. . בזהירות, מוסיפים מספיק נוזל N2 כדי לכסות את השורשים.
    2. לטחון את השורשים לחתיכות קטנות. המשך התהליך של הוספת נוזל N2 וטחינה (לפחות שתי פעמים, להיות עקבי בין דוגמאות), עד השורשים אבקה. ודא כי רקמת השורש לא להפשיר במהלך שלב זה.
      התראה: שימוש ציוד מגן אישי המתאים (חלוק המעבדה במשקפי מגן, כפפות קריוגני) כאשר עובדים עם נוזל N2.
      הערה: להפקת DNA באיכות נמוכה, זה יכול להיות מועיל לטחון שורשים עודף לאבקה, לאחסן את האבקה ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. . מהר, לפני השורש אבקת מתחיל להפשיר, להשתמש במרית סטרילי כדי להעביר את אבקת שורש לתוך צינורות mL 1.5 שנשקל מראש על קרח. להקליט את המשקל של הצינורית, אבקת. בדרך כלל, 300-400 מ ג של אבקת מועבר.
    4. השתמש במרית סטרילי להעביר במהירות 150 מ ג של אבקת שורש הצינור אוסף המסופקים בערכה בידוד של דנ א מסחרי המיועד לחילוץ מן הקרקע, ולאחר מכן להמשיך עם ה-DNA בידוד באמצעות הפרוטוקול של הספק ערכת.
      הערה: עבור דגימות שורש, שם ניתן ריכוז גבוה של אורגניקס שנותרו בגדר הדנ א, אשר מונע ההגברה של ה-DNA במהלך PCR, במיוחד כאשר פרוטוקול מיצוי הדנ א אחר (למשל., מיצוי CTAB) משמש. במידת הצורך, לנקות את ה-DNA על פי ההוראות המסופק בערכה ניקיון סביבתי הדנ א.
  3. מודדים את ריכוז כל דגימות די אן איי באמצעות fluorometer של רגישות גבוהה benchtop.
    1. להוסיף 1-20 µL של כל. דנ א eluted לתוך צינורות המסופק בערכה assay רגישות גבוהה dsDNA. הוסף הפתרון עובד fluorometer (צבע 1:200: מאגר) עד 200 µL.
    2. להכין שני צינורות נוספים המכילים 10 µL של DNA רגיל 1 (0 ng/µL דנ א) או 10 µL של תקן 2 (100 ng/µL), וכן להוסיף 190 µL של הפתרון עובד fluorometer כל סטנדרט.
    3. מודדים את ריכוז המידה ואת כל דגימה. אם זה לא נעשה באופן אוטומטי, לחשב את ריכוז הדנ א מהפלט ספיגת מאת רגרסיה ליניארית שני תקנים.

3. אמפליקון ספריית בהכנה והגשה

  1. הגדרת חומרים עבור התגובה הגברה.
    1. הפשרת דגימות די אן איי ב 4 ° C ולשמור אותם על קרח לאורך כל שלב 3. אקראי הסדר של דגימות די אן איי כדי לצמצם הטיה בשל המיקום על הצלחת ה-PCR (טבלה 2).
    2. בצלחת PCR 96-ובכן, לדלל הדנ א של כל מדגם במים ברמה מולקולרית כדי ng/µL 5 ב הנפח הכולל של 20 להוסיף 20 µL µL. מולקולרית-כיתה מים לבארות פינת ארבע כפקדי שלילי עבור הגברה (ריקים) (טבלה 2).
    3. סדר את תחל לבר-קוד (10 מיקרומטר) או רצועת המבחנות או צלחת 96-ובכן כך ניתן להוסיף עם פיפטה רב ערוצית (איור 2).
    4. להכין מספיק PCR מיקס מאסטר כדי להגביר כל מדגם ה-DNA דולר. להכין µL 1.5 של BSA (20 מ"ג/מ"ל), µL 37.5 של מוכנות מראש 2 x מיקס מאסטר (המורכבת של מאגר ה-PCR, MgCl2, dNTPs ו הדנ א. אנזימים ), µL 0.57 של כלורופלסט הרשות הפלסטינית (100 מיקרומטר), µL 0.57 של הרשות הפלסטינית מיטוכונדריאלי (100 מיקרומטר), ו- µL 25.86 של מים ברמה המולקולרית.
    5. יוצקים המיקס מאסטר לתוך 25 מ ל סטרילי של מאגר פיפטה רב-ערוצי ולהפיץ µL 66 של מיקס מאסטר לתוך כל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
      הערה: בעת חישוב ריאגנט כרכים על המיקס מאסטר, הקפד לכלול גם הבארות ריק 4 לכל צלחת.
    6. בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף 6 µL של 5 ng/µL DNA (מהצלחת DNA מנורמל) לצלחת מיקס מאסטר. לאחר מכן להוסיף לוח אב 1.5 µL של 10 מיקרומטר פריימר לפנים כזה כי בכל עמודה יש ברקוד קדימה שונים, ו 1.5 µL של 10 מיקרומטר הפוך תחל כך שכל שורה תכיל ברקוד הפוכה שונים (איור 2).
      הערה: לפני הוספת תחל, צלחות אקראי של מיקס מאסטר יכול לשמש כדי להגביר את הגנים פטרייתי בקשתה או ITS2 אם נוספו תחל שונים. אם זה המקרה, ניתן להשתמש בעיצוב פריימר דומה.
    7. ספין למטה הצלחת בקצרה ב 3,000 x ג להשתמש פיפטה רב ערוצית לערבב בעדינות, ואז לחלק את שלוש צלחות עם 25 µL תערובת התגובה.
      הערה: למרות משכפל שלוש אינם הדבר הכרחי לחלוטין, זה מקטין את ההשפעה של השתנות טכני.
  2. להגביר את ה-DNA בצלחת לכל שימוש thermocycler להגדיר את התנאים הבאים: 180 s ב 98 ° C, 30 מחזורים של: 98 ° C עבור 45 s (denaturing), 78 מעלות צלזיוס במשך 10 s (חישול הרשות הפלסטינית), 55 ° C 60 s (פריימר חישול), ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s (סיומת) , ואז 600 s ב-72 מעלות ואחריו של 4 ° C להחזיק שלב. לאחר ההגברה, בריכת הלוחות שכפל שלוש לתוך לוח 96-ובכן בודד אחד.
  3. לכמת את הדנ א באמצעות רגישות גבוהה fluorometer ריאגנטים קורא 96-ובכן צלחת.
    1. להוסיף 2 µL של כל מוצר ה-PCR microplate 96-ובכן, יחד עם µL 98 של הפתרון עובד fluorometer (צבע 1:200: מאגר). כולל 4 בארות באמות מידה: 5 µL של ה-DNA 1 רגיל (0 ng/µL ה-DNA), µL 1 2 רגיל (10 ng/µL) µL 2 2 רגיל (20 ng/µL), µL 5 תקן 2 (50 ng/µL). לאחר מכן להוסיף fluorometer הפתרון עובד עבור אמצעי אחסון הסופי של 100 µL.
      הערה: כל מדגם ניתן למדוד באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר בשלב 2.3 אם קורא הלוח אינו זמין.
    2. חשב את ריכוז הדנ א מהפלט ספיגת מאת רגרסיה ליניארית ארבעה תקנים.
    3. עבור לבר-קוד בהצלחה מוגבר מוצרים (אלה שיש להם ריכוז גדול מ- 15 ng/µL), בריכה 100 ננוגרם של כל מדגם לתוך צינור יחיד mL 1.5 (טבלה 2).
    4. לחשב את הנפח הממוצע של דגימות שהתווסף למאגר באמצעות הפונקציה =AVERAGE() בתוכנית גיליון אלקטרוני. הוסף את עוצמת הקול של מוצרי ה-PCR "ריק" הדגימות במאגר.
      הערה: מאז המוצרים PCR "ריק" יש שילובים ברקוד ייחודי משלהם, הם יכולים להיות רציף כדי לבדוק אם כל מזהמים מעבדה.
  4. למדוד את הריכוז של המוצר במאגר באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר שלב 2.3, לקחת 600 ng של ה-DNA, לדלל במים ברמה המולקולרית לאמצעי הסופי של µL 100 צינור 1.5 מ. לאחסן את המוצר במאגר הנותרים ב-20 ° C.
  5. לשטוף את הדנ א נג 600 aliquot על ידי ביצוע תהליך טיהור PCR הוקמה עם חרוזים טיהור פאראמגנטיים בתבנית 96-ובכן עם כמה יוצאים מן הכלל.
    1. להפוך µL 600 טריים aliquot של 70% אתנול. לנער את הבקבוק של beads מגנטי להשעות מחדש חרוזים ליישב את העניין.
    2. להוסיף נפח x 1 (100 µL) של פתרון חרוז aliquot ng 600 ה-DNA. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 10 פעמים. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מקם את הצינורית על גבי המעמד מגנטית למשך 2 דקות (או עד פתרון ברור) להפריד חרוזים פתרון. כאשר הצינור נמצא עדיין הדוכן מגנטי, וארוקן את תגובת שיקוע ברור בזהירות מבלי לגעת את החרוזים מגנטי, ולמחוק את תגובת שיקוע ברורה.
      הערה: בשלב זה, המוצרים אמפליקון מאוגדים החרוזים מגנטי. כל החרוזים כי הם השאיפה מופרע או אבד במהלך תגרום לאובדן של ה-DNA.
    4. להשאיר את הצינור ביציע מגנטי ולהוסיף 300 µL של 70% אתנול הצינור; תקופת דגירה בטמפרטורת החדר של 30 ס' וביופסיה אתנול, להשליך. חזור על תהליך זה, ולהסיר כל אתנול לאחר לשטוף את השני. להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, אוויר יבש במשך 5 דקות.
    5. להוסיף 30 µL של מים ברמה המולקולרית החרוזים יבשים ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק לשוב לדוכן מגנטי עבור 1 דקות ברכבת התחתית להפריד את החרוזים פתרון. להעביר את eluate צינור חדש.
      הערה: beads מגנטי לא ישפיעו על תגובות במורד הזרם.
  6. למדוד את הריכוז הסופי של ניקו, במאגר הדנ א באמצעות fluorometer benchtop כפי שמתואר בשלב 2.3. לדלל עם aliquot 10 nM, נפח סופי 30 µL, או ריכוז ונפח המועדף על המתקן רצף.
  7. לנצל את השירותים של מתקן רצף רצף ה-DNA על פלטפורמה המיתרים, 2 x 300 bp לזווג-קצה רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביצוע הפרוטוקול המומלץ יביא dataset הקריאות לזווג-קצה באינדקס שניתן מתאימים לחזור כל דגימה או שהוקצו או בקטריאלית ביחידות תפעוליות בטקסונומיה (OTU) או רצף המדויק משתנה (אשד מזרקות, המכונה גם אמפליקון רצף variant (ASV) ויחידת תפעולי בטקסונומיה (sOTU)), בהתאם לניתוח במורד הזרם. על מנת לקבל נתונים רצף איכותי, חייבים להקפיד בכל שלב כדי לשמור על עקביות בין דגימות ולצמצם את המבוא של כל הטיה אפשרית במהלך עיבוד הדגימה או ספריית הכנה. לאחר איסוף, עיבוד, חילוץ DNA דגימות (שלבים 1 ו- 2), eluate שנוצר אמור להופיע וחופשיים של אורגניקס המעכבות הגברה. בעוד טוהר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי מדידת כל מדגם ה-DNA ויה ספקטרופוטומטרים microvolume, מצאנו כי הקרקע ערכת חילוץ DNA הסרה אמינה של מזהמים כל. כתוצאה מאיכות דנ א צפוי, כימות שיטות המסתמכות על צבעי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית שקושרים DNA במיוחד מתאימים יותר מאשר אלה בהתבסס על UV ספיגת19,20,21. לפני ה-PCR-הגברה, דגימות קרקע ומי rhizosphere ממוצע סביב 10 ng/µL ה-DNA, בעוד השורש דגימות בדרך כלל יש ריכוז אכזרי של 30 ng/µL (טבלה 2).

בעקבות ההגברה של ה-DNA סביבתיים (שלב 3), הצלחה או כישלון יכול להיקבע על ידי מדידת ריכוז המוצר PCR דרך benchtop fluorometer ריאגנטים על קורא צלחת, אם הוא זמין, או באופן ידני (טבלה 2). מניסיוננו, amplifications מוצלחת שתוצאתה נתונים באיכות גבוהה אמפליקון תשואה גדולה מ 15 מוצרים PCR ng/µL. אם קיימים כשלים מרובים על צלחת, הסידור לפי מיקום בתוך הצמח ואת סוג הדגימה של דגימות שנכשלו עשוי לעזור לקבוע את הבעיה. למשל, אם הם סמוכים הכל על הצלחת, זה עשוי להצביע על שגיאה פיפטה, ואילו אם כולם נמצאים באותה שורה או עמודה, זה יכול להציע בעיות עם פריימר ספציפיים. אם הם כולם שייכים לאותו סוג הדגימה, זה עשוי להציע בעיות דוגמת עיבוד או מיצוי הדנ א.

חשוב לבדוק את התאימות של PNAs אוניברסלי עם bioinformatically המערכת שלך צמח מסוים במהלך תכנון ניסויים על מנת לוודא כי הם ימשיכו לחסום הגברה של כלורופלסט, מיטוכונדריאלי 16 גנים. בעקבות הצעד הגברה, זה לא ברור אם Pna בהצלחה מאוגד ל מיטוכונדריאלי ותבניות כלורופלסט; זה מתגלה רק לאחר קביעת רצף (איור 3). כדי לסייע להבטיח כי Pna ביעילות יחסום מזהם הגברה, ישור של הרצף הרשות הפלסטינית כל כלורופלסט, 16 מיטוכונדריאלי rRNA ג'ין (ייתכנו מספר עותקים) עבור המפעל המארח נחקר לא לחשוף כל אי-התאמות . אפילו חוסר התאמה יחידה 13 bp הרשות הפלסטינית רצף, במיוחד באמצע המלחציים הרשות הפלסטינית, ניתן להפחית באופן דרסטי את היעילות, כמו במקרה של הרצף הרשות הפלסטינית כלורופלסט שסופקו ועם הגן rRNA כלורופלסט מטוסי אף-16 של sativa חסה (חסה) ( איור 3).

מאז כמות שווה של DNA מוגבר איחדו לדגימה, שם יש מספר כ אפילו של קריאות לקבל עבור דגימה לאחר רצף ומיון קריאות בהתבסס על שלהם אינדקס לבר-קוד (איור 4). הרוב המכריע של קריאות אלה צריכים להתאים כדי taxa חיידקי. בכל האיקריוטים, מיטוכונדריאלי, או צריכים להיות מושלך כלורופלסט גפרורים. בהתאם לניתוח צינור בטקסונומיה מסד הנתונים שבחרת, כלורופלסט וקורא מיטוכונדריאלי בטעות ניתן להקצות שושלות חיידקי, לעיתים קרובות כחוליות ו- Rickesttia, בהתאמה (איור 3). דרגת curation ידנית לעתים קרובות זהיר לבדוק אם ההקצאות שגויה נפוצות. פרטים ספציפיים תהיה תלויה הבחירה של ניתוח, אבל השפע היחסי פרופילים בדרך כלל צריך להיות דומה (הבדל משמעותי) בין משכפל ביולוגי, שונה באופן משמעותי בין אדמה, rhizosphere השורש דגימות (איור 5 ). חשוב לציין, עם זאת, כי בעוד שיכול להיות הבדל משמעותי בין משכפל ביולוגי, חשוב לאסוף משכפל לפחות שלושה לכל.

שיטות לפרש את הנתונים שהתקבלו בניסויים אלה הם שנויה במחלוקת בקרב האקולוגים מיקרוביאלי. עד לאחרונה, ניתוח רצף אמפליקון כבר תלוי קיבוץ קריאות לתוך אוטוס. אולם, אלה הם בעייתיים כי: 1). הם מבוססים על סף שרירותי למדי של 97% דמיון, 2) המגוון הוא המעיט לעיתים קרובות ו 3) יכול להיות ברזולוציה נמוכה בטקסונומיה. לאחרונה פיתח כלים כגון DADA2, Deblur ו- UNOISE222,23,24 מסוגלים למיין קריאות לתוך ESVs, אשר פותר בעיות שהוצגו בעת שימוש אוטוס. אזהרות בשימוש ESVs כוללים: 1) מלאכותי העלאות גיוון עקב הבדלים rRNA עותקים בתוך מינים, ורגישות מוגברת 2) PCR, קביעת רצף שגיאות25,26.

Figure 1
איור 1: הפרדה בין שברים בסיס, rhizosphere. תרשים זרימה מציג את השלבים עבור להפריד את rhizosphere בין הדגימות שורש, ואחריו לשטוף את השורשים במים סטריליים כדי להסיר את כל האורגניזמים rhizoplane הנותרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דוגמה של מניות תחל פריסה עבור הגברה וחלוקה בתוך צלחות. ניתן להכין מלאי תחל (טבלה 1) רצועת צינורות להפצה אופטימלית תוך 96-ובכן צלחות (כל רצועת תחל מיוצג על-ידי צבע שונה; סגול עבור קדימה תחל 1-8, כתום בשביל להעביר תחל כחול 9-16, תחל הפוכה 1-12 ירוק עבור הפוכה תחל 13-16.) במקרה זה, 16 תחל הפוך קדמי ו-16 שניתן להפיץ ביעילות עם פיפטה רב ערוצית כך בכל טוב יש שילוב ברקוד ייחודי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תוצאות מציע כלורופלסט הרשות הפלסטינית אינו יעיל. תוצאה נציג rhizosphere ("Rhizo"), שורש, אדמת דגימות חסה שאינם מטופלים (NT) או שטופלו (VT) תיקון קרקע ביולוגיים. הרצף הרשות נהגה לחסום כלורופלסט זיהום של רוב הצמחים הוא GGCTCAACCCTGGACAG27. עם זאת, חסה מכיל חוסר התאמה הגן ribosomal RNA מטוסי אף-16 כלורופלסט (GGCTCAACTCTGGACAG). זה הופך את הרשות הפלסטינית לא אפקטיבי, וכתוצאה מכך שפע היחסית גבוהה הקריאות תואמים כדי כחוליות בדגימות rhizosphere ושורש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הפצה של קריאת מונה בין דגימות בספריה. הגרף מציג מספר לקרוא ספירות (ציר y) דוגמאות שונות (ברים, ציר x), מתאימים לפי השילוב ברקוד קרא. מספר קריאות עבור דגימה יכולה להשתנות לפי הם כמה דוגמאות בספריה; ערכה זו היה רציף בספריה של 192 דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: שפע יחסי של הכיתות העליון 12 השורש, rhizosphere, וקהילות אדמה. תרשים עמודות מוערמות מציג שפע יחסי של מחלקות נוכח dataset נציג מטוסי אף-16 המכיל 6 משכפל עבור כל סוג הדגימה (אדמת בתפזורת, rhizosphere ו- endosphere שורש). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: צבעי יסוד הגברה האזור V3-V4 של הגן rRNA מטוסי אף-16. תחל מורכבים, ברצף: מתאם עבור פלטפורמה משותפת המיתרים, ברקוד ייחודי, ומהצמיגים עבור הגדרות אזור מרווח באורך משתנה כדי להעביר את המסגרת רצף, פריימר PCR אוניברסלי זה מגביר את 341F או 785R של הגן rRNA מטוסי אף-16. מספר צבעי יסוד הצורך הוא תלוי כמה דוגמאות הן וסודרו לכל ספריה; שילוב של 16 תחל הפוך קדמי ו-16 מספיקה עבור דגימות 244 (256 פריימר שילובים עם 12 המשמש בארות ריק במהלך ה-PCR (איור 2)). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

בטבלה 2: הנורמליזציה של DNA אקראי דגימות לפני כן, בעקבות הגברה. דוגמה גליון רישום מדגמים סדר אקראי, המציין את המיקום שלהם על לוח אחד 96-ובכן, הקובע גם את השילוב פריימר מוקצה לו. נוסחאות בשורה התחתונה לתאר חישובים עבור הוספת 100 ננוגרם של כל מדגם לצלחת מנורמל, בתוספת נפח המים כדי להגיע 20 µL. בעקבות הגברה, הנפח של 100 ננוגרם של כל מוצר מוצלח ולאחר הבריכה הסופי. הנפח של מוצר ה-PCR "ריק" להוספה בבריכה הסופי הוא הממוצע של הדגימות אחרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה איור 1: קירוב של ביומסה הבסיס המינימלי במהלך איסוף הדגימה. כאשר השורשים איסוף, מנסה לאסוף לפחות 500 מ ג של רקמות. כאן, נאספו שורשים מצמח דורה הצעיר (שמאל, הן A ו- B) צמח צעיר אורז (מימין) מוצגים ליד (א) ו בתוך צינורות חרוט (ב) 50 מ ל. הן דוגמאות שוקל כ 1 g, עם זאת, חשוב לציין כי המשקל הזה כולל rhizosphere ושורש, המשקל rhizosphere הוא, במקרה זה, חצי לערך המשקל הכולל. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים של צינור הוקמה עבור חקר הבסיס endosphere, rhizosphere ו אדמת הקהילה מיקרוביאלי יצירות, שהדגימה שדה דוגמת עיבוד ורצף במורד הזרם. Microbiomes שורש-הקשורים לומד מציג באתגרים הייחודיים לה, בשל באופן חלקי הקשיים הכרוכים בחילוף מן הקרקע. קרקעות הן מאוד משתנה מבחינת הפיסיקליות והכימיות, בתנאי קרקע שונים יכול להיות מופרדים קטנה כמו כמה מילימטרים28,29. זה יכול להוביל הדגימות אשר נאספו מאתרי דגימה סמוכים נתקל לקהילה מיקרוביאלית משמעותית אחרת יצירות ו פעילויות30,31. לכן, באמצעות אדמת הליבה אספנים ואתים לשמור על הדגימה עקבי במעמקי ו המגון לפני מיצוי DNA חיוניים הפארמצבטית בתוך השורש microbiome מחקרים. זה גם הכרחי להפריד ביעילות שברים rhizosphere ושורש; באמצעות שיטה נוקשה של עיקור משטח שורש יכול באופן פוטנציאלי lyse endophytes בתוך שורשים לפני הפקת דנ א, בזמן שטיפה יותר שמרני רשאי להסיר כל החיידקים משטח שורש7. גורם מפתח נוסף שניתן להשפיע באופן שלילי או לשבש את רצף תוצאות היא זיהום חיידקי, אשר יכולים להגיע ממקורות רבים, לפעמים בלתי אפשרי להבחין בין חיידקים סביבתיים שנדגמו32,33. מסיבה זו, עיקור זהיר של הדגימה כלים, חומרים ניסיוניים, סביבות העבודה הכרחיים על מנת למנוע זיהום.

לאחר דגימה, השגת DNA באיכות גבוהה הוא בעדיפות גבוהה עבור ניתוחים מוצלחים במורד הזרם. מניסיוננו, מיצוי הדנ א משדה גדל דגימות השורש באמצעות שיטות אלטרנטיביות, כגון דרך CTAB מבוססי החילוץ, לעתים קרובות מכילים כמויות באופן משמעותי יותר של חומצות רקבובי ותרכובות אחרות בהשוואה rhizosphere וקרקע. תרכובות אלו יכול למנוע את הפעילות אנזימטי של ה-DNA פולימראז במהלך הגברה PCR, אפילו בגיל34,ריכוזים נמוכים35. באמצעות מיצוי DNA ערכות מיועד קרקעות על בסיס דגימות, בניגוד מיצוי CTAB ואחריו של פנול חומר הרדמה לנקות, יכול להיפטר ביעילות דגימות של חומצות רקבובי והתוצאה באיכות גבוהה דנ א36,37, 38,39. בהתאם לכך, מומלץ להשתמש ערכת חילוץ DNA זמינים מסחרית לדוגמאות שורש כמו גם... יצוין, כי המטרה היא להשיג DNA גנומי מיקרוביאלי שורשי צמחים. לפיכך, טחינת השורש יסודית ועקבית חשוב לפרק את רקמת הצמח ואת lyse תאי חיידקים כדי לשחרר דנ א חיידקים ללא היכרות עם הטיה בין דגימות עקב השוני טחינת לחץ וזמן.

לאחר חילוץ זהיר של ה-DNA מדגימות, ישנם שני מקורות עיקריים לבעיות במהלך הגברה: 1) זיהום של רקמות הצמח עם הצמח endosymbionts (כלורופלסט, המיטוכונדריה) ו- 2) מבחר 16 אזור rRNA כדי להגביר. ההגברה כלורופלסט או המיטוכונדריה מטוסי אף-16 ניתן להפיק רצפים rRNA > 80% של הרצף בבסיס דגימות40ולאחר יותר ברקמות עלה, למרות כמות הזיהום תלויה הבחירה של צבעי יסוד. כך, הרשות הפלסטינית מלחציים נחוצים במהלך השלב ה-PCR לדכא את הצמח הפונדקאי כלורופלסט ו- 16 מיטוכונדריאלי זיהום27,41. עם זאת, מינים שונים יכול להיות וריאציה כלורופלסט, 16 מיטוכונדריאלי ברצף27; לכן, זה הכרחי כדי לאשר את רצף כלורופלסט מיטוכונדריאלי מטוסי אף-16 גנים של הצמח נחקר לפני רצף הספרייה, על מנת לקבוע אם יש צורך oligos הרשות הפלסטינית חלופי (איור 3). בנוסף, הגן rRNA מטוסי אף-16 מורכב של תשעה אזורים hypervariable ולצדו תשעה אזורים שמרנית; ניתן להשיג תוצאות שונות באותה קהילה תלוי איזה. אזור hypervariable זה מוגבר42. מחקרים קודמים מצאו אזור V4 להיות אחד ביותר עבור הקצאת טקסונומיה43 ו זה שימש במשך אחרים סקרים נרחבים microbiome11. הארכת המטרה לאזור V3-V4 הוא הציע כאן כדי להגדיל את השתנות ולשפר את הרזולוציה בטקסונומיה.

ב פרוטוקול זה, הפגנו צינור כדי לבצע רצף אמפליקון rRNA מטוסי אף-16 באמצעות הדור הבא רצף (הגדרות) ללמוד קומפוזיציות הקהילה מיקרוביאלית של דגימות הסביבה12. אנו ממליצים להשתמש אמפליקון רצף ככלי עבור פרופיל פילוגנטי, בגלל שזה זול יחסית, תפוקה גבוהה, ואינו דורש מומחיות חישובית או משאבים כדי לנתח. בעוד השיטה שלנו מתמקד לנתח את חלק microbiome חיידקי, ניתן להתאים אותו בקלות לחקור את הפטריות. הפרוטוקול זהה דרך שלב 2, ההבדל היחיד בשלב 3 הוא מה תחל היה לשמש במהלך ההגברה. עם זאת, זה לא שווה כלום כי אמפליקון מבוסס פרופיל אינה ללא מגבלות על ידי קביעת רצף גנים סמן בודד, מתקבל מידע לגבי הקיבולת הפונקציונלית של הקהילה. בנוסף, הרזולוציה בטקסונומיה יכול להיות נמוכה למדי, במיוחד כאשר רצף של סביבות עם אחוז גבוה של חיידקים uncharacterized. עם זאת, טכנולוגיות רצף מתפתחים במהירות, אנו צופים את היכולת להתמודד עם כמה חסרונות אלה על-ידי התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם פלטפורמות אחרות רצף. לבסוף, כאמור במבוא, רובה metagenomics ו- metatranscriptomics ניתן בקלות לבצע על דגימות קרקע ומי rhizosphere, שיטות כדי לחסל את הצמח זיהום רקמות הצמח כעת להיות נידונות. עיצובים מוטוריים איזה זוג אמפליקון גישות וטכניקות אחרות metagenomic יכול להיות יעיל במיוחד בקהילות מורכב שבו מגוון מינים גבוה וייצוג לא אחידה של taxa יכול למנוע רובה במדויק אפיון הפחות דומיננטי חברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי משרד החקלאות-ארס (כריס 2030-21430-008-00D). TS נתמך על-ידי התוכנית אחוות ה-NSF מחקר לתואר שני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 135 מטוסי אף-16 rRNA רצף שורש endosphere rhizosphere קרקע microbiome פרופיל פילוגנטי
לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng,… More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter