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Genetics

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57561
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

Summary

यहां, हम मिट्टी, rhizosphere, और रूट endosphere microbiomes के amplicon अनुक्रम डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह जानकारी संरचना और संयंत्र से संबंधित माइक्रोबियल समुदायों की विविधता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संयंत्र प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

संयंत्र की मेजबानी और जुड़े सूक्ष्मजीवों के बीच अंतरंग बातचीत संयंत्र फिटनेस का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, और अजैव तनाव और रोगों के लिए सुधार सहिष्णुता को बढ़ावा कर सकते हैं । के रूप में संयंत्र microbiome अत्यधिक जटिल हो सकता है, कम लागत, इस तरह के amplicon आधारित अनुक्रमण 16S rRNA जीन के रूप में उच्च प्रवाह तरीकों अक्सर अपनी माइक्रोबियल संरचना और विविधता निस्र्पक के लिए पसंद कर रहे हैं । हालांकि, इस तरह के प्रयोगों का आयोजन करते समय उपयुक्त कार्यप्रणाली का चयन उन पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है जो नमूनों और अध्ययनों के बीच विश्लेषण और तुलना को कठिन बना सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन विस्तार से मिट्टी, rhizosphere, और जड़ नमूनों से संग्रह और डीएनए के निष्कर्षण के लिए एक मानकीकृत पद्धति । इसके अतिरिक्त, हम इन नमूनों में बैक्टीरियल समुदायों की संरचना की खोज के लिए अनुमति देता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित 16S rRNA amplicon अनुक्रमण पाइपलाइन पर प्रकाश डाला, और आसानी से अन्य मार्कर जीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस पाइप लाइन, चारा, मक्का, गेहूं, स्ट्रॉबेरी, और agave सहित संयंत्र प्रजातियों की एक किस्म के लिए मान्य किया गया है, और संयंत्र organelles से संदूषण से जुड़े मुद्दों पर काबू पाने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

संयंत्र से जुड़े microbiomes बैक्टीरिया, archaea, वायरस, कवक, और अंय eukaryotic सूक्ष्मजीवों के शामिल गतिशील और जटिल माइक्रोबियल समुदायों से मिलकर बनता है । संयंत्र रोग के कारण में उनकी अच्छी तरह से अध्ययन भूमिका के अलावा, संयंत्र से जुड़े रोगाणुओं भी सकारात्मक बायोटिक और अजैव तनाव के लिए सहिष्णुता में सुधार के द्वारा संयंत्र के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं, पोषक तत्वों की उपलब्धता को बढ़ावा देने, और बढ़ाने के माध्यम से संयंत्र वृद्धि phytohormones का उत्पादन होता है । इस कारण से, विशेष रुचि निस्र्पक taxa है कि संयंत्र जड़ endospheres, rhizospheres, और आसपास की मिट्टी के साथ सहयोगी में मौजूद है । जबकि कुछ रोगाणुओं पर अलगाव में संस्कृति किया जा सकता है प्रयोगशाला मीडिया उत्पंन, कई नहीं, भाग में, क्योंकि वे अंय रोगाणुओं के साथ सहजीवी रिश्तों पर भरोसा कर सकते हैं, बहुत धीरे से बढ़ती है, या शर्तों है कि एक प्रयोगशाला वातावरण में दोहराया नहीं जा सकता की आवश्यकता होती है । क्योंकि यह खेती के लिए की जरूरत है दरकिनार और अपेक्षाकृत सस्ती और उच्च प्रवाह, अनुक्रम-पर्यावरण और मेजबान के वंशावली profiling-जुड़े माइक्रोबियल नमूनों की परख माइक्रोबियल समुदाय के लिए एक पसंदीदा तरीका बन गया है संरचना.

विभिन्न अगली पीढ़ी sequencing (NGS) प्लेटफार्मों1 द्वारा प्रदान की गई उपयुक्त अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के चयन सहित महत्वपूर्ण कारकों के साथ उपयोगकर्ताओं की जरूरतों पर निर्भर है: वांछित कवरेज, amplicon लंबाई, उम्मीद समुदाय विविधता, साथ ही अनुक्रमण त्रुटि दर, पढ़ें-लंबाई, और लागत प्रति रन/megabase । amplicon आधारित अनुक्रमण प्रयोगों में विचार किया जा करने की जरूरत है कि एक और चर क्या जीन परिलक्षित किया जाएगा और क्या प्राइमरों का इस्तेमाल किया जाएगा । जब डिजाइनिंग या प्राइमरों का चयन, शोधकर्ताओं अक्सर प्रवर्धन की सार्वभौमिकता और वर्गीकरण के परिणामस्वरूप amplicons से प्राप्त संकल्प के बीच tradeoffs बनाने के लिए मजबूर कर रहे हैं । इस कारण से, अध्ययन के इन प्रकार अक्सर प्राइमरों और मार्करों कि चुनिंदा microbiome के विशिष्ट सबसेट लक्षित चुना । बैक्टीरियल समुदायों की संरचना का मूल्यांकन सामांयतः एक या जीवाणु 16S rRNA जीन2,3के hypervariable क्षेत्रों के अधिक अनुक्रमण द्वारा पूरा किया जाता है । इस अध्ययन में, हम एक NGS मंच है कि बैक्टीरियल 16S rRNA जीन है, जो बैक्टीरियल taxa के व्यापक प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है के ५०० बीपी V3-V4 क्षेत्र लक्ष्य के लिए विकसित एक amplicon आधारित अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पर्याप्त परिवर्तनशीलता प्रदान करते हुए भी अलग taxa के बीच अंतर । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को आसानी से अंय प्राइमर सेट के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कवक के ITS2 मार्कर या eukaryotes के 18S rRNA उपइकाई लक्ष्यीकरण उन ।

इस तरह बन्दूक metagenomics, metatranscriptomics, और एकल सेल अनुक्रमण के रूप में अन्य दृष्टिकोण, समाधान माइक्रोबियल जीनोम और समुदाय समारोह के अधिक प्रत्यक्ष माप सहित अन्य लाभ प्रदान करते हैं, इन तकनीकों आम तौर पर अधिक कर रहे हैं वंशावली की तुलना में महंगा और गणनात्मक गहन यहां4वर्णित है । इसके अतिरिक्त, शॉटगन metagenomics और metatranscriptomics रूट के नमूनों पर प्रदर्शन मेजबान संयंत्र जीनोम से संबंधित पढ़ता का एक बड़ा प्रतिशत पैदावार, और इस सीमा को दूर करने के तरीके अभी भी5,6विकसित किया जा रहा है ।

किसी भी प्रायोगिक मंच के साथ के रूप में, amplicon आधारित रूपरेखा संभावित पूर्वाग्रहों जो प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण के दौरान विचार किया जाना चाहिए की एक संख्या शुरू कर सकते हैं । इनमें नमूना संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्राइमरों का चयन, और पुस्तकालय की तैयारी कैसे की जाती है, के तरीकों को शामिल किया गया है । विभिंन तरीकों काफी प्रयोग करने योग्य डेटा उत्पंन की राशि को प्रभावित कर सकते हैं, और भी अध्ययन के बीच परिणामों की तुलना करने के प्रयासों में बाधा कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, rhizosphere बैक्टीरिया को हटाने की विधि7 और अलग निष्कर्षण तकनीकों या डीएनए निष्कर्षण किट8के विकल्प का उपयोग करें,9 काफी अनुप्रवाह विश्लेषण है, जो सुराग के लिए दिखाया गया है अलग निष्कर्ष के बारे में जो रोगाणुओं मौजूद है और उनके रिश्तेदार बहुतायत । चूंकि amplicon आधारित profiling अनुकूलित किया जा सकता है, अध्ययन भर तुलना कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है । पृथ्वी Microbiome परियोजना का सुझाव दिया है कि शोधकर्ताओं ने संयंत्र के रूप में जटिल प्रणालियों का अध्ययन संबद्ध Microbiome के आवेदन के कारण परिवर्तनशीलता को कम करने के एक साधन के रूप में मानकीकृत प्रोटोकॉल के विकास से लाभ होगा अध्ययन के बीच विभिंन तरीकों10,11। यहां, हम सबसे अच्छा प्रथाओं जहां उपयुक्त के रूप में उपरोक्त विषयों और प्रस्ताव के सुझावों के कई चर्चा ।

प्रोटोकॉल मिट्टी, rhizosphere इकट्ठा करने की प्रक्रिया को दर्शाता है, और चारा bicolor से जड़ नमूने और डीएनए निकालने एक अच्छी तरह से स्थापित डीएनए आइसोलेशन किट11का उपयोग कर । इसके अतिरिक्त, हमारे प्रोटोकॉल एक विस्तृत amplicon अनुक्रमण कार्यप्रवाह भी शामिल है, एक सामांय उपयोग NGS मंच का उपयोग कर, बैक्टीरियल समुदाय12,13,14की संरचना का निर्धारण । इस प्रोटोकॉल की जड़ें, rhizosphere के हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में संयंत्र मेजबान की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए मांय किया गया है, और जुड़े- ज्वार bicolor, Zea mays, और Triticum aestivumसहित 18 monocot प्रजातियों में से मिट्टी15। इस विधि भी अंय मार्कर जीन के साथ प्रयोग के लिए मांय किया गया है, के रूप में agave microbiome के अध्ययन में कवक ITS2 मार्कर जीन का अध्ययन करने के लिए अपनी सफल आवेदन द्वारा प्रदर्शित16,17 और स्ट्रॉबेरी microbiome 18.

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Protocol

1. संग्रह और जड़ Endosphere, Rhizosphere, और मिट्टी के नमूनों की जुदाई

  1. क्षेत्र में प्रवेश करने से पहले, आटोक्लेव ultrapure पानी (नमूना प्रति पानी की कम से ९० मिलीलीटर) को निष्फल । epiphyte हटाने बफर तैयार (प्रति नमूना कम से 25 मिलीलीटर) जोड़कर KH के2पो4, के ८.७५ जी2HPO4, और ट्राइटन एक्स के 1 मिलीलीटर-१००, 1 के लिए बाँझ पानी की एल. ०.२ µm ताकना आकार के साथ एक वैक्यूम फिल्टर का उपयोग कर बफर निष्फल ।
    1. चरणों के लिए १.२ से १.५, हर समय इथेनॉल के साथ निष्फल साफ दस्ताने पहनते हैं और प्रत्येक नमूने के बीच दस्ताने की जगह के लिए संक्रमण को रोकने के । ७०% इथेनॉल के साथ सभी उपकरण निष्फल और साफ सभी उपकरणों के नमूनों के बीच । नमूना लेने से पहले, अपने प्रयोग के लिए इष्टतम नमूना गहराई का निर्धारण, और सभी मिट्टी और जड़ संग्रह के साथ संगत हो ।
  2. थोक मिट्टी के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए, एक इथेनॉल निष्फल मिट्टी कोर कलेक्टर का उपयोग करने के लिए मिट्टी है कि संयंत्र के आधार से एक कोर लगभग 23 से 30 सेमी इकट्ठा करके पौधों की जड़ों से मुक्त है प्राप्त करने के लिए ।
  3. एक प्लास्टिक की थैली के लिए मिट्टी हस्तांतरण, कोमल मिलाते द्वारा मिट्टी homogenize, और मिट्टी के नमूने के एक aliquot हस्तांतरण (लगभग ६०० मिलीग्राम) को भरने के लिए एक 2 मिलीलीटर ट्यूब । तुरंत सूखी बर्फ या फ्लैश पर 2 मिलीलीटर ट्यूब जगह तरल एन2 में ट्यूब फ्रीज जब तक डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार (चरण 2) ।
    1. कुछ वातावरण में, आसपास की मिट्टी संयंत्र सामग्री शामिल कर सकते हैं । इस मामले में, एक निष्फल 2 मिमी छलनी मिट्टी से पौधे के मलबे को अलग करने के लिए यह प्लास्टिक की थैली में रखने से पहले का उपयोग करें ।
  4. जड़ और rhizosphere इकट्ठा करने के लिए, एक इथेनॉल निष्फल फावड़ा का उपयोग करने के लिए संयंत्र खुदाई, देखभाल लेने के लिए संभव के रूप में जड़ के रूप में ज्यादा प्राप्त करते हैं । गहराई संयंत्र पर निर्भर है । जबकि छोटे पौधों जैसे गेहूं को कई सेंटीमीटर खुदाई करके हटाया जा सकता है, ऐसे ज्वार जैसे बड़े पौधों को 30 सेमी या उससे अधिक की आवश्यकता हो सकती है । धीरे जड़ों से अतिरिक्त मिट्टी हिला जब तक वहां लगभग है 2 मिट्टी की जड़ की सतह का पालन करने के मिमी ।
    नोट: छोटे पौधों के साथ काम करते समय ध्यान रखना, नाजुक जड़ों के साथ, या सूखी, उच्च मिट्टी सामग्री मिट्टी में । आदर्श रूप में, वहां केवल मिट्टी की एक पतली परत को मिलाने के बाद जड़ों पर शेष होना चाहिए । यदि मिट्टी के बड़े समुच्चय रहते हैं, एक रबर हथौड़ा धीरे गोली के आधार मार द्वारा मिट्टी उखाड़ फेंकना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि इस प्रक्रिया के बाद शेष मिट्टी की मात्रा से अधिक है या 2 मिमी से कम हो जाता है, अनुमानित मोटाई नोट किया जाना चाहिए ।
  5. बड़े पौधों के लिए, बाँझ कैंची और/या कतरनी का उपयोग करने के लिए जड़ों की एक प्रतिनिधि उपधारा में कटौती और एक ५० मिलीलीटर शंकु शीशी में जड़ ऊतक के ५०० मिलीग्राम की एक ंयूनतम जगह । छोटी घास के लिए, पूरी जड़ प्रणाली को शीशी में रखें । जड़ें कवर करने के लिए पर्याप्त epiphyte हटाने बफर जोड़ें, तो तुरंत सूखी बर्फ पर नमूना जगह या फ्लैश तरल एन2में नमूना फ्रीज ।
    नोट: ध्यान रखें कि ५० मिलीलीटर शंकु शीशी को न भरें, क्योंकि यह वाशिंग स्टेप को मुश्किल बना देगा । पर्याप्त खाली जगह ऐसी होनी चाहिए कि epiphyte बफर तल तक प्रवाहित कर सके, शीशी भर जड़ों को चारों ओर से घेर ले, और ऊपर ढक जाए । क्योंकि कुछ घास अधिक जड़ बायोमास है एक ५० मिलीलीटर शंकु शीशी में फिट होगा, जड़ों की एक उपधारा एकत्र किया जाना चाहिए । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जड़ों को काटने endophytic बैक्टीरिया को ले जा सकता है rhizosphere अंश में बाहर धोया जा रहा है, तो जड़ों को तोड़ने के ंयूनतम किया जाना चाहिए । यदि नमूने तुरंत लैब लौटने के बाद संसाधित नहीं हैं, वे पर संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c ।
  6. rhizosphere को जड़ों से अलग करने के लिए, बर्फ पर जड़ नमूने गल, तो 30 एस के लिए १६० डब्ल्यू की दालों के साथ 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जड़ नमूनों sonicate, 30 एस से अलग कर दिया, एक ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) में जड़ों हस्तांतरण, साफ ५० मिलीलीटर ट्यूब बाँझ संदंश का उपयोग कर । बफर और मिट्टी के साथ मूल ट्यूब का निपटारा मत करो, जो rhizosphere अंश है (चित्रा 1) ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस, ४,००० एक्स जी में 10 मिनट के लिए बफर और rhizosphere युक्त ट्यूब केंद्रापसारक supernatant, फ्लैश फ्रीज में rhizosphere अंश युक्त ट्यूब तरल एन2, और दुकान पर rhizosphere अंश-८० ° c जब तक डीएनए के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार निष्कर्षण (चरण 2) ।
  8. जड़ों को धोने के लिए, लगभग 20 मिलीलीटर ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) बाँझ पानी जड़ अंश करने के लिए जोड़ें । जोरदार (हाथ या मिक्सर से, 15-30 s के लिए) मिलाते हुए जड़ धो, और फिर पानी नाली ।
  9. जब तक कोई मिट्टी जड़ की सतह पर नहीं रहती, तब तक कम से दो बार इस चरण को दोहराएँ. यदि डीएनए निष्कर्षण (कदम 2) तुरंत नहीं किया जाता है, बाँझ एल्यूमीनियम पंनी में जड़ों लपेटो, फ्लैश तरल एन2में जड़ों फ्रीज, और डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: चरण 2 और 3 के दौरान, स्वच्छ दस्ताने इथेनॉल के साथ निष्फल हर समय पर पहना जाना चाहिए और सभी काम एक इथेनॉल के साथ निष्फल सतह पर किया जाना चाहिए ।

  1. मिट्टी और rhizosphere नमूनों से डीएनए निकालें ।
    1. एक बाँझ रंग का प्रयोग जल्दी से मिट्टी और rhizosphere के २५० मिलीग्राम चरणों १.३ और १.७ से एक वाणिज्यिक डीएनए अलगाव मिट्टी से निष्कर्षण के लिए डिजाइन किट में प्रदान की गई है, तो डीएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ना किट आपूर्तिकर्ता का उपयोग प्रोटोकॉल.
    2. डीएनए आइसोलेशन किट द्वारा आपूर्ति की रेफरेंस बफर में डीएनए को eluting के बाद, डीएनए को-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जब तक कि चरण 3 के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार हो ।
  2. जड़ नमूनों से डीएनए निकालें ।
    1. ठंडा एक निष्फल मोर्टार और मूसल का उपयोग कर तरल एन2। रूट ऊतक के ७०० मिलीग्राम के लिए बाहर ६०० उपाय और मोर्टार में ऊतक जगह है । ध्यान से, जड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त तरल एन2 जोड़ें ।
    2. जड़ों को छोटे टुकड़ों में पीस लें । तरल एन2 और पीस जोड़ने की प्रक्रिया को जारी रखें, जब तक जड़ों को एक महीन पाउडर न दिया जाए (कम से दो बार, नमूनों के बीच सुसंगत हो) । सुनिश्चित करें कि इस चरण के दौरान रूट ऊतक गल नहीं है ।
      चेतावनी: तरल एन2के साथ काम करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (लैब कोट, सुरक्षात्मक eyewear, और क्रायोजेनिक दस्ताने) का प्रयोग करें ।
      नोट: एक कम गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण के लिए, यह पाउडर में अतिरिक्त जड़ों पीसने और पाउडर की दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस फायदेमंद हो सकता है ।
    3. जल्दी, इससे पहले कि जड़ पाउडर गल शुरू होता है, एक बाँझ रंग का उपयोग करने के लिए बर्फ पर पूर्व तौला १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में रूट पाउडर हस्तांतरण. ट्यूब और पाउडर का वजन रिकॉर्ड करें । आमतौर पर, ३००-४०० मिलीग्राम पाउडर का अंतरण किया जाता है ।
    4. एक बाँझ रंग का प्रयोग जल्दी से हस्तांतरण करने के लिए १५० मिलीग्राम की जड़ पाउडर संग्रह ट्यूब करने के लिए मिट्टी से निष्कर्षण के लिए बनाया गया एक वाणिज्यिक डीएनए आइसोलेशन किट में प्रदान की गई, तो किट आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल का उपयोग डीएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ना.
      नोट: कुछ जड़ नमूनों के लिए, वहां डीएनए गोली है, जो पीसीआर के दौरान डीएनए के प्रवर्धन रोकता है, खासकर जब एक अलग डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल (जैसे, CTAB निष्कर्षण) प्रयोग किया जाता है में शेष ऑर्गेनिक्स के एक उच्च एकाग्रता हो सकता है । यदि आवश्यक हो तो पर्यावरण डीएनए क्लीन अप किट में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए डीएनए को साफ करें ।
  3. एक उच्च संवेदनशीलता benchtop fluorometer का उपयोग कर सभी डीएनए नमूनों की एकाग्रता को मापने ।
    1. जोड़ें 1-20 µ प्रत्येक eluted डीएनए नमूने के एल ट्यूबों में dsDNA उच्च संवेदनशीलता परख किट में प्रदान की । fluorometer कार्य समाधान जोड़ें (1:200 डाई: बफर) अप करने के लिए २०० µ एल
    2. डीएनए मानक 1 (0 एनजी/µ एल डीएनए) या 10 µ एल के 10 µ एल युक्त दो अतिरिक्त ट्यूबों तैयार मानक 2 के (१०० एनजी/µ एल), और प्रत्येक मानक के लिए µ काम समाधान के १९० fluorometer एल जोड़ें ।
    3. मानकों और प्रत्येक नमूने की एकाग्रता को मापने । यह स्वचालित रूप से नहीं किया जाता है, तो दो मानकों के एक रैखिक प्रतिगमन द्वारा अवशोषण उत्पादन से डीएनए एकाग्रता की गणना.

3. Amplicon पुस्तकालय की तैयारी और सबमिशन

  1. प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए सामग्री सेट करें ।
    1. 4 ° c पर गल डीएनए नमूने और उंहें कदम 3 भर में बर्फ पर रखो । पीसीआर प्लेट (तालिका 2) पर स्थान के कारण पूर्वाग्रह को कम करने के लिए डीएनए नमूनों के आदेश यादृच्छिक करें ।
    2. एक ९६-खैर पीसीआर प्लेट में, आणविक ग्रेड पानी में प्रत्येक नमूने से डीएनए पतला करने के लिए 5 एनजी/µ एल के कुल मात्रा में 20 µ एल जोड़ने के लिए आणविक ग्रेड पानी के 20 µ एल जोड़ (रिक्तियों) (तालिका 2) के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चार कोने कुओं के लिए.
    3. या तो पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब या एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में बारकोड प्राइमरों (10 µ मीटर) की व्यवस्था ऐसी है कि वे एक मल्टी चैनल पिपेट के साथ जोड़ा जा सकता है (चित्रा 2) ।
    4. तपसिल में प्रत्येक डीएनए सैंपल को बढ़ाना है तो पर्याप्त पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें । तैयार १.५ µ एल के BSA (20 मिलीग्राम/एमएल), ३७.५ µ एल के पूर्व बनाया 2x मास्टर मिक्स (पीसीआर बफर से बना है, MgCl2, dNTPs, और Taq डीएनए पोलीमरेज़), ०.५७ µ एल के chloroplast ॄणा (१०० µ मीटर), ०.५७ µ एल के mitochondrial ॄणा (१०० µ मीटर), और आणविक ग्रेड जल के २५.८६ µ एल.
    5. मल्टीचैनल पिपेट जलाशय के एक बाँझ 25 मिलीलीटर में मास्टर मिश्रण डालो और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक नया ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में मास्टर मिश्रण के ६६ µ एल वितरित.
      नोट: मास्टर मिश्रण के लिए एजेंट की मात्रा की गणना करते समय, यह भी प्लेट प्रति 4 खाली कुओं को शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    6. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, मास्टर मिक्स प्लेट के लिए 5 एनजी/µ एल डीएनए (सामान्यीकृत डीएनए प्लेट से) के 6 µ एल जोड़ें । तो मास्टर प्लेट १.५ µ एल के 10 µ एम आगे प्राइमर ऐसी है कि प्रत्येक कॉलम एक अलग आगे बारकोड है, और १.५ µ एल के 10 µ एम रिवर्स प्राइमर ऐसी है कि प्रत्येक पंक्ति में एक अलग रिवर्स बारकोड है (चित्रा 2) जोड़ें ।
      नोट: प्राइमर जोड़ने से पहले, यादृच्छिक प्लेटें और मास्टर मिश्रण अपने या ITS2 कवक जीन बढ़ाना इस्तेमाल किया जा सकता है अगर अलग प्राइमरों जोड़ा गया । यदि यह मामला है, एक समान प्राइमर डिजाइन किया जा सकता है ।
    7. नीचे प्लेट संक्षेप में ३,००० x g पर स्पिन एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए धीरे मिश्रण है, तो प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 µ एल के साथ तीन प्लेटों में विभाजित ।
      नोट: हालांकि तीन प्रतिकृति सख्ती से आवश्यक नहीं हैं, यह तकनीकी परिवर्तनशीलता के प्रभाव को घटाता है ।
  2. प्रत्येक थाली में डीएनए को बढ़ाना एक thermocycler निंनलिखित स्थितियों के लिए सेट का उपयोग कर: १८० s ९८ ° c, के 30 चक्र: ९८ ° c के लिए ४५ s (denaturing), ७८ ° c के लिए 10 s (ॄणा एनीलिंग), ५५ ° c के लिए ६० s (प्राइमरी एनीलिंग), और ७२ ° c के लिए ९० s (विस्तार) , तो ६०० एस ७२ डिग्री सेल्सियस के बाद एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ कदम । प्रवर्धन के बाद, पूल तीन एक एकल ९६-अच्छी तरह से थाली में प्लेटों की नकल ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट रीडर में उच्च संवेदनशीलता fluorometer रिएजेंट का उपयोग डीएनए यों तो ।
    1. एक ९६-अच्छी तरह से microplate के लिए प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 2 µ एल जोड़ें fluorometer काम समाधान (1:200 डाई: बफर) के ९८ µ एल के साथ साथ । 4 कुओं को मानक के रूप में शामिल करें: डीएनए मानक 1 के 5 µ एल (0 एनजी/µ एल डीएनए), 1 मानक 2 के µ एल (10 एनजी/µ l), 2 µ एल के मानक 2 (20 एनजी/µ एल), और 5 µ एल के मानक 2 (५० एनजी/µ एल) । तो १०० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए fluorometer कार्य समाधान जोड़ें
      नोट: प्रत्येक नमूना एक प्लेट रीडर उपलब्ध नहीं है, तो चरण २.३ में वर्णित के रूप में एक benchtop fluorometer का उपयोग कर मापा जा सकता है ।
    2. चार मानकों के एक रैखिक प्रतिगमन द्वारा अवशोषण उत्पादन से डीएनए एकाग्रता की गणना.
    3. सफलतापूर्वक परिवर्धित बारकोड उत्पादों के लिए (उन है कि एक एकाग्रता से अधिक 15 एनजी/µ एल), पूल १०० प्रत्येक नमूने के एनजी एक एकल १.५ मिलीलीटर ट्यूब में (तालिका 2) ।
    4. किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम में = average () फ़ंक्शन का उपयोग करके पूल में जोड़े गए नमूनों की औसत मात्रा परिकलित करें । "रिक्त" पीसीआर उत्पादों की मात्रा को परित नमूनों में जोड़ें ।
      नोट: के बाद से "खाली" पीसीआर उत्पादों को अपने स्वयं के अद्वितीय बारकोड संयोजन है, वे किसी भी प्रयोगशाला संदूषणों के लिए जांच करने के लिए अनुक्रम किया जा सकता है ।
  4. कदम २.३ में वर्णित के रूप में एक benchtop fluorometer का उपयोग कर परित उत्पाद की एकाग्रता को मापने, और ६०० डीएनए के एनजी ले और आणविक ग्रेड पानी में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में १०० µ एल के एक अंतिम मात्रा को पतला । -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष परित उत्पाद संग्रह ।
  5. एक ९६-कुछ अपवादों के साथ अच्छी तरह से प्रारूप में paramagnetic शुद्धि मोतियों के साथ स्थापित पीसीआर शोधन प्रक्रिया का पालन करके ६०० एनजी डीएनए aliquot धो लें ।
    1. ७०% इथेनॉल के एक ताजा ६०० µ l aliquot बनाओ । चुंबकीय मोतियों की बोतल मिलाने के लिए फिर से निलंबित मोतियों कि नीचे करने के लिए बसने ।
    2. के लिए मनका समाधान के 1x volume (१०० µ एल) जोड़ें डीएनए के ६०० एनजी aliquot । pipetting द्वारा अच्छी तरह से 10 बार मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस (या जब तक समाधान स्पष्ट है) को हल से मोती अलग है । हालांकि ट्यूब अभी भी चुंबकीय स्टैंड में है, महाप्राण स्पष्ट supernatant चुंबकीय मोतियों को छूने के बिना ध्यान से, और स्पष्ट supernatant त्यागें ।
      नोट: इस बिंदु पर, amplicon उत्पादों चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य कर रहे हैं । किसी भी मोती है कि परेशान या आकांक्षा के दौरान खो रहे है डीएनए का नुकसान में परिणाम होगा ।
    4. चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब छोड़ दो और ट्यूब के लिए ७०% इथेनॉल के ३०० µ एल जोड़ें; इथेनॉल और त्याग के बाहर 30 एस महाप्राण के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । इस प्रक्रिया को दोहराएँ, और दूसरी धोने के बाद सभी इथेनॉल निकालें. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब निकालें, और 5 मिनट के लिए शुष्क हवा ।
    5. सूखे मोतियों को आणविक ग्रेड पानी के 30 µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण 10 बार । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन वापसी 1 मिनट के लिए चुंबकीय खड़े करने के लिए ट्यूब समाधान से मोतियों को अलग करने के लिए । eluate एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: चुंबकीय मोती अनुप्रवाह प्रतिक्रियाओं को प्रभावित नहीं करेगा ।
  6. कदम २.३ में वर्णित के रूप में एक benchtop fluorometer का उपयोग कर साफ, परित डीएनए की अंतिम एकाग्रता को मापने । 30 µ एल, या एकाग्रता और अनुक्रमण सुविधा द्वारा पसंद की मात्रा के लिए एक अंतिम मात्रा में 10 एनएम के लिए एक aliquot पतला ।
  7. एक NGS मंच पर डीएनए अनुक्रम के लिए एक अनुक्रमण सुविधा की सेवाओं का उपयोग, 2 x ३०० bp युग्मित अंत अनुक्रमण.

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Representative Results

अनुशंसित प्रोटोकॉल निष्पादित कर रहा है एक dataset अनुक्रमणित युग्मित-end पढ़ता जो वापस प्रत्येक नमूने के लिए मिलान किया जा सकता और या तो एक बैक्टीरियल संचालन वर्गीकरण इकाइयां (ओटू) या सटीक अनुक्रम संस्करण (ईएसवी, के रूप में भी संदर्भित करने के लिए amplicon अनुप्रवाह विश्लेषण के आधार पर अनुक्रम संस्करण (ASV) और उप-संचालन वर्गीकरण इकाई (sOTU)), । आदेश में उच्च गुणवत्ता अनुक्रम डेटा प्राप्त करने के लिए, देखभाल के नमूने के बीच निरंतरता बनाए रखने और नमूना प्रसंस्करण या पुस्तकालय की तैयारी के दौरान किसी भी संभावित पूर्वाग्रह की शुरूआत को कम करने के लिए हर कदम पर लिया जाना चाहिए । इकट्ठा करने के बाद, प्रसंस्करण, और नमूने से डीएनए निकालने (1 और 2 कदम), जिसके परिणामस्वरूप eluate स्पष्ट और कार्बनिक कि प्रवर्धन रोकना होगा से मुक्त दिखाई देना चाहिए । जबकि पवित्रता एक microvolume spectrophotometer के माध्यम से प्रत्येक डीएनए नमूने को मापने के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, हमने पाया है कि मिट्टी डीएनए निष्कर्षण किट मज़बूती से सभी दूषित पदार्थों को हटा । अनुमान लगाने योग्य डीएनए की गुणवत्ता के परिणामस्वरूप, ठहराव तरीकों कि विशेष रूप से बांध डीएनए यूवी अवशोषक के आधार पर उन लोगों की तुलना में अधिक उपयुक्त हैं कि प्रतिदीप्ति-आधारित रंजक पर निर्भर करते हैं19,20,21. पहले पीसीआर प्रवर्धन, मिट्टी और rhizosphere नमूने औसत लगभग 10 एनजी/µ एल डीएनए, जबकि रूट नमूनों आम तौर पर लगभग 30 के एक मतलब एकाग्रता है एनजी/µ l (तालिका 2) ।

पर्यावरण डीएनए (चरण 3) के प्रवर्धन के बाद, सफलता या विफलता एक प्लेट रीडर पर benchtop fluorometer रिएजेंट के माध्यम से पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, यदि उपलब्ध है, या मैंयुअल रूप से (तालिका 2) । हमारे अनुभव में, सफल प्रवर्धन कि उच्च गुणवत्ता amplicon डेटा उपज में परिणाम 15 से अधिक एनजी/µ एल पीसीआर उत्पादों । एक प्लेट पर एक से अधिक विफलताओं हैं, तो संयंत्र और नमूना प्रकार विफल नमूनों की स्थिति व्यवस्था समस्या का पता लगाने में मदद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, अगर वे सभी प्लेट पर सटे हैं, यह पिपेट त्रुटि का संकेत हो सकता है, जबकि अगर वे सभी एक ही पंक्ति या कॉलम में हैं, यह एक विशिष्ट प्राइमर के साथ मुद्दों का सुझाव सकता है । यदि वे सभी एक ही नमूना प्रकार के हैं, यह नमूना प्रसंस्करण या डीएनए निष्कर्षण के साथ समस्याओं का सुझाव हो सकता है.

यह है कि वे chloroplast और mitochondrial 16S जीन के प्रवर्धन ब्लॉक होगा सत्यापित करने के क्रम में प्रयोगात्मक डिजाइन के दौरान अपने विशिष्ट संयंत्र प्रणाली bioinformatically के साथ सार्वभौमिक PNAs की अनुकूलता की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रवर्धन चरण के बाद, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या PNAs सफलतापूर्वक mitochondrial और chloroplast टेंपलेट्स से बाउंड है; यह केवल sequencing (चित्रा 3) के बाद पता चला है । मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि PNAs प्रभावी ढंग से contaminant प्रवर्धन, प्रत्येक chloroplast और mitochondrial 16S rRNA जीन के लिए ॄणा अनुक्रम का एक संरेखण ब्लॉक होगा (वहां एकाधिक प्रतियां हो सकता है) के लिए संयंत्र की मेजबानी की जांच की जा रही किसी भी बेमेल खुलासा नहीं होना चाहिए . यहां तक कि एक बेमेल 13 बीपी ॄणा अनुक्रम के लिए, विशेष रूप से ॄणा दबाना के बीच में, काफी प्रभावशीलता को कम कर सकते हैं, के रूप में प्रदान की chloroplast ॄणा अनुक्रम के मामले में और chloroplast 16S rRNA जीन के Lactuca sativa (सलाद पत्ता) ( चित्रा 3) ।

के बाद से प्रवर्धित डीएनए के एक बराबर राशि नमूना प्रति जमा किया है, वहाँ एक लगभग भी संख्या में पढ़ता है के बाद नमूना प्रति प्राप्त अनुक्रमण और छंटाई उनके बारकोड्ड सूचकांक पर आधारित पढ़ता है (चित्रा 4). इनमें से अधिकांश पढ़ता बैक्टीरियल taxa से मेल खाना चाहिए । किसी भी eukaryotic, mitochondrial, या chloroplast मेल को छोड दिया जाना चाहिए । विश्लेषण पाइपलाइन और वर्गीकरण चुना डेटाबेस के आधार पर, chloroplast और mitochondrial पढ़ता गलती से बैक्टीरियल वंश को सौंपा जा सकता है, अक्सर Cyanobacteria और Rickesttia, क्रमशः (चित्रा 3) । मैनुअल उपचारात्मक की डिग्री अक्सर इन आम गलत कार्य के लिए जांच करने के लिए विवेकपूर्ण है । विशिष्ट विवरण विश्लेषण के विकल्प पर निर्भर करेगा, लेकिन सापेक्ष बहुतायत प्रोफाइल आम तौर पर समान होना चाहिए (कोई महत्वपूर्ण अंतर) जैविक प्रतिकृति और मिट्टी, rhizosphere के बीच काफी अलग है, और जड़ के नमूनों (चित्रा 5 ). यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि जब वहां जैविक प्रतिकृति के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है, यह करने के लिए आवश्यक है इकट्ठा करने के लिए तीन से कम प्रति प्रतिकृति ।

इन प्रयोगों में प्राप्त डेटा की व्याख्या के लिए तरीके माइक्रोबियल ecologists के बीच गर्मागर्म बहस कर रहे हैं । हाल ही में जब तक, amplicon अनुक्रम विश्लेषण समूह OTUs में पढ़ता पर निर्भर किया गया है । हालांकि, इन समस्याग्रस्त है क्योंकि: 1) वे ९७% समानता की एक कुछ मनमाना सीमा पर आधारित हैं, 2) विविधता अक्सर आंका जाता है, और 3) वहां कम वर्गीकरण संकल्प किया जा सकता है । हाल ही में विकसित उपकरण जैसे DADA2, धुंधला, और UNOISE222,23,24 को सॉर्ट करने में सक्षम है ESVs, जो कुछ समस्याओं को हल प्रस्तुत जब OTUs का उपयोग कर । ESVs का उपयोग करने के लिए निरंतर शामिल हैं: 1) एक प्रजाति के भीतर rRNA प्रतियां में अंतर के कारण विविधता में कृत्रिम बढ़ जाती है, और 2) पीसीआर और अनुक्रमण त्रुटियों के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि हुई25,26।

Figure 1
चित्र 1: रूट और rhizosphere अंशों का पृथक्करण. फ़्लोचार्ट रूट नमूनों से rhizosphere को अलग करने के लिए चरणों को प्रदर्शित करने, उसके बाद किसी भी शेष rhizoplane जीवों को निकालने के लिए बाँझ पानी के साथ जड़ों को धोने के द्वारा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रवर्धन और प्लेट के भीतर वितरण के लिए स्टॉक प्राइमर लेआउट का उदाहरण । स्टॉक प्राइमरों (1 टेबल) ९६ के भीतर इष्टतम वितरण के लिए पट्टी ट्यूबों में तैयार किया जा सकता है अच्छी तरह से प्लेटें (प्राइमरों की प्रत्येक पट्टी एक अलग रंग से प्रतिनिधित्व कर रहा है; आगे प्राइमरों के लिए बैंगनी 1-8, फॉरवर्ड प्रीस के लिए नारंगी 9-16, रिवर्स प्राइमरों के लिए ब्लू 1-12 , और रिवर्स प्राइमरों के लिए ग्रीन 13-16.) इस मामले में, 16 आगे और 16 रिवर्स प्राइमरों एक मल्टी चैनल पिपेट के साथ कुशलतापूर्वक वितरित किया जा सकता है कि इस तरह के एक अच्छी तरह से एक अद्वितीय बारकोड संयोजन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: परिणाम है कि सुझाव chloroplast ॄणा अप्रभावी है. rhizosphere से प्रतिनिधि परिणाम ("Rhizo"), जड़, और सलाद से मिट्टी के नमूनों कि गैर इलाज किया गया (NT) या इलाज (VT) एक जैविक मृदा संशोधन के साथ । अधिकांश पादपों के chloroplast संदूषण को अवरोधित करने के लिए ॄणा अनुक्रम का उपयोग GGCTCAACCCTGGACAG27है । हालांकि, सलाद chloroplast 16S राइबोसोमल आरएनए जीन (GGCTCAACTCTGGACAG) में एक बेमेल होता है । यह ॄणा अप्रभावी renders, के एक उच्च सापेक्ष बहुतायत में जिसके परिणामस्वरूप rhizosphere और रूट नमूनों में Cyanobacteria के लिए मैच पढ़ता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: किसी लाइब्रेरी में नमूनों के बीच पठन गणनाओं का वितरण. बार चार्ट पढ़ने के विभिंन नमूनों (सलाखों, x-अक्ष) से पढ़ें गिनती (y-अक्ष) की संख्या दिखा रहा है, में बारकोड संयोजन से मिलान । प्रति नमूना पढ़ता की संख्या लायब्रेरी में कितने नमूने हैं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं; यह सबसेट १९२ नमूनों की एक लाइब्रेरी में अनुक्रम किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: जड़, rhizosphere, और मिट्टी समुदायों में शीर्ष 12 वर्गों के सापेक्ष बहुतायत । स्टैक्ड पट्टी एक प्रतिनिधि 16S dataset में उपस्थित वर्गों के सापेक्ष बहुतायत दिखा रहा है चार्ट प्रत्येक नमूना प्रकार (बल्क मृदा, rhizosphere, और रूट endosphere) के लिए 6 प्रतिकृतियां शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1:16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को बढ़ाना के लिए प्राइमरों । प्राइमरों से बना है, क्रमिक रूप से: एक एडाप्टर के लिए एक आम NGS मंच, एक अद्वितीय बारकोड, NGS के लिए प्राइमर, चर लंबाई का एक स्पेसर क्षेत्र अनुक्रमण के लिए फ्रेम शिफ्ट करने के लिए, और एक सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमर कि प्रवर्धक या तो 341F या 16S rRNA जीन के 785R. जरूरत प्राइमरों की संख्या कितने नमूनों पुस्तकालय प्रति अनुक्रम रहे हैं पर निर्भर है; 16 फॉरवर्ड और 16 रिवर्स प्राइमरों का एक संयोजन २४४ नमूनों के लिए पर्याप्त है (12 के साथ २५६ प्राइमरी संयोजन पीसीआर (चित्रा 2) के दौरान खाली कुओं के लिए इस्तेमाल किया) । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 2: यादृच्छिक डीएनए नमूनों का सामान्यीकरण करने से पहले और प्रवर्धन के बाद. उदाहरण कार्यपत्रक यादृच्छिक क्रम में नमूने सूचीबद्ध करता है और एक एकल ९६-वेल प्लेट पर उनके स्थान का संकेत देता है, जो इसे असाइन किए गए प्राइमरी संयोजन को भी निर्धारित करती है. नीचे पंक्ति में सूत्र के लिए प्रत्येक नमूने के १०० एनजी जोड़ने के लिए गणना का वर्णन सामान्यीकृत प्लेट, प्लस पानी की मात्रा तक पहुंचने के लिए 20 µ l निंनलिखित प्रवर्धन, प्रत्येक सफल उत्पाद के १०० एनजी की मात्रा की गणना और एक अंतिम पूल में जोड़ा है । अंतिम पूल में जोड़ने के लिए "रिक्त" पीसीआर उत्पाद की मात्रा अंय नमूनों की औसत है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: नमूना संग्रह के दौरान न्यूनतम रूट बायोमास के सन्निकटन. जब जड़ें इकट्ठा करने के लिए, ऊतक के कम से ५०० मिलीग्राम इकट्ठा करने की कोशिश । यहां, एक युवा चारा संयंत्र से एकत्र जड़ों (दोनों ए और बी में छोड़ दिया) और एक युवा चावल संयंत्र (दाएं) के बगल में दिखाए जाते है (a) और अंदर (ख) ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों । दोनों नमूनों लगभग 1 जी तौलना, तथापि, यह ध्यान दें कि इस वजन rhizosphere और जड़ भी शामिल है महत्वपूर्ण है, और rhizosphere वजन है, इस मामले में, लगभग आधे कुल वजन । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल रूट endosphere, rhizosphere, और मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय रचनाओं की खोज के लिए एक स्थापित पाइपलाइन को दर्शाता है, नमूना प्रसंस्करण और बहाव अनुक्रमण के लिए नमूना क्षेत्र से । जड़ से जुड़े microbiomes का अध्ययन अद्वितीय चुनौतियों प्रस्तुत, मिट्टी से नमूना में निहित कठिनाइयों को भाग में कारण. मिट्टी भौतिक और रासायनिक गुणों के मामले में उच्च चर रहे हैं, और विभिंन मिट्टी की स्थिति के रूप में थोड़ा के रूप में कुछ मिलीमीटर28,29से अलग किया जा सकता है । इस नमूने जो आसन्न नमूना साइटों काफी अलग माइक्रोबियल समुदाय रचनाओं और गतिविधियों30,31होने से एकत्र कर रहे हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, मिट्टी कोर लेनेवालों और फावड़ियों का उपयोग लगातार नमूना गहराई और डीएनए निष्कर्षण से पहले homogenization बनाए रखने के लिए रूट microbiome अध्ययन के भीतर reproducibility के लिए आवश्यक हैं । यह भी कुशलतापूर्वक rhizosphere और जड़ भागों अलग करने के लिए आवश्यक है; जड़ की सतह नसबंदी के एक कठोर विधि का उपयोग संभावित लाइसे endophytes जड़ों के भीतर डीएनए निष्कर्षण से पहले कर सकते हैं, जबकि एक अधिक रूढ़िवादी धोने जड़ सतह से सभी रोगाणुओं को दूर नहीं हो सकता है7. नकारात्मक प्रभाव या अनुक्रमण परिणामों को बाधित कर सकते हैं कि एक अन्य महत्वपूर्ण कारक बैक्टीरियल संदूषण है, जो कई स्रोतों से आ सकते हैं और नमूना पर्यावरण बैक्टीरिया३२,३३से अलग करने के लिए कभी-कभार असंभव है. इस कारण से, नमूना उपकरण, प्रयोगात्मक सामग्री, और काम के वातावरण के सावधान नसबंदी के लिए संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

नमूना लेने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त करने के सफल बहाव विश्लेषण के लिए एक उच्च प्राथमिकता है । हमारे अनुभव में, CTAB-आधारित निष्कर्षण के माध्यम से इस तरह के रूप में वैकल्पिक तरीकों के माध्यम से क्षेत्र हो जड़ नमूनों से डीएनए निष्कर्षण, अक्सर rhizosphere और मिट्टी के नमूनों की तुलना में humic एसिड और अन्य यौगिकों की काफी अधिक मात्रा में होते हैं । इन यौगिकों पीसीआर प्रवर्धन के दौरान डीएनए पोलीमरेज़ की एंजाइमी गतिविधि को रोकने के लिए, यहां तक कि कम सांद्रता३४,३५पर कर सकते हैं । डीएनए निष्कर्षण जड़ नमूनों पर मिट्टी के लिए डिजाइन किट का प्रयोग, के रूप में एक CTAB निष्कर्षण के लिए विरोध के बाद एक phenol क्लोरोफॉर्म साफ-अप, प्रभावी ढंग से humic एसिड के नमूनों से छुटकारा पा सकते है और उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए में परिणाम होगा३६,३७, ३८,३९. तदनुसार, हम रूट नमूनों के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लक्ष्य के लिए संयंत्र जड़ों से माइक्रोबियल जीनोमिक डीएनए प्राप्त है । इस प्रकार, पूरी तरह से और लगातार जड़ पीसने के लिए नीचे संयंत्र ऊतक तोड़ महत्वपूर्ण है और माइक्रोबियल कोशिकाओं लाइसे दबाव और समय पीसने में भिंनता के कारण नमूनों के बीच पूर्वाग्रह शुरू करने के बिना माइक्रोबियल डीएनए जारी करने के लिए ।

डीएनए के नमूनों से सावधान निष्कर्षण के बाद, वहां दो मुख्य स्रोत है समस्याओं के लिए प्रवर्धन के दौरान: 1) संयंत्र endosymbionts के साथ संयंत्र के ऊतकों के संदूषण (chloroplast और mitochondria) और 2) 16S rRNA क्षेत्र के चयन बढ़ाना है । chloroplast या mitochondria 16S rRNA अनुक्रम से प्रवर्धन उत्पंन कर सकते है > रूट नमूनों में अनुक्रम के 80%४०, और पत्ती के ऊतकों में अधिक है, हालांकि संदूषण की मात्रा प्राइमरों के चुनाव पर निर्भर है । इस प्रकार, ॄणा clamps संयंत्र मेजबान chloroplast और mitochondrial 16S संदूषण27,४१को दबाने के लिए पीसीआर कदम के दौरान आवश्यक हैं । हालांकि, विभिन्न प्रजातियों के पौधे chloroplast और mitochondrial 16S अनुक्रम27में भिन्नता हो सकती है; इसलिए, यह chloroplast के अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है और संयंत्र के mitochondrial 16S जीन पुस्तकालय अनुक्रमण से पहले अध्ययन किया जा रहा, क्रम में अगर वैकल्पिक ॄणा ओलिगोस्पर्मिया की जरूरत है निर्धारित करने के लिए (चित्रा 3) । इसके अतिरिक्त, 16S rRNA जीन नौ hypervariable क्षेत्रों से होते हैं । विभिंन परिणामों के आधार पर एक ही समुदाय से प्राप्त किया जा सकता है जिस पर hypervariable क्षेत्र४२परिलक्षित होता है । पिछले अध्ययनों V4 क्षेत्र पाया है वर्गीकरण४३ निर्दिष्ट करने के लिए सबसे विश्वसनीय में से एक है और यह अंय व्यापक microbiome सर्वेक्षणों के लिए इस्तेमाल किया गया है11। लक्ष्य के V3-V4 क्षेत्र के लिए लंबी परिवर्तनशीलता बढ़ाने और वर्गीकरण रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने के लिए यहाँ सुझाया गया है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम पर्यावरण के नमूनों की माइक्रोबियल समुदाय रचनाओं के अध्ययन के लिए 16S rRNA amplicon sequencing अगली पीढ़ी sequencing (NGS) के माध्यम से प्रदर्शन करने के लिए एक पाइप लाइन का प्रदर्शन किया12. हम वंशावली रूपरेखा के लिए एक उपकरण के रूप में amplicon अनुक्रमण का उपयोग करने की सलाह देते हैं, क्योंकि यह अपेक्षाकृत सस्ती है, उच्च प्रवाह, और व्यापक गणना विशेषज्ञता या संसाधनों का विश्लेषण करने की आवश्यकता नहीं है । जबकि हमारे विधि microbiome के जीवाणु अंश का विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित है, यह आसानी से कवक की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल चरण 2 के माध्यम से समान है, और चरण 3 में ही अंतर है क्या प्राइमरों प्रवर्धन के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा । हालांकि, यह कुछ भी नहीं है कि amplicon आधारित profiling सीमाओं के बिना नहीं है लायक है । एक एकल मार्कर जीन अनुक्रमण द्वारा, कोई जानकारी समुदाय की कार्यात्मक क्षमता के बारे में प्राप्त की है । साथ ही, वर्गीकरण रिज़ॉल्यूशन काफी कम हो सकता है, विशेष रूप से जब वातावरणों से uncharactered रोगाणुओं का एक उच्च प्रतिशत के साथ sequencing । हालांकि, sequencing प्रौद्योगिकियों तेजी से विकसित कर रहे हैं, और हम अन्य अनुक्रमण प्लेटफार्मों के साथ उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल ढलने से इन कमियों में से कुछ के साथ सौदा करने की क्षमता की आशंका. अंत में, के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, शॉटगन metagenomics और metatranscriptomics आसानी से मिट्टी और rhizosphere के नमूनों पर प्रदर्शन किया जा सकता है, और तरीकों संयंत्र के ऊतकों से संयंत्र संदूषण को खत्म करने के लिए वर्तमान में पता लगाया जा रहा है । प्रयोगात्मक डिजाइन जो जोड़ी amplicon आधारित दृष्टिकोण और अंय metagenomic तकनीक विशेष रूप से जटिल समुदायों में प्रभावी हो सकता है जहां उच्च प्रजातियों विविधता और taxa का असमान प्रतिनिधित्व सही से शॉटगन डेटा को रोका जा सकता है निस्र्पक कम प्रमुख सदस्य हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम USDA-ARS द्वारा वित्त पोषित किया गया (CRIS 2030-21430-008-00D) । टीएस NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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References

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जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng,… More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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