Summary
כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.
Abstract
Phagocytosis ממלא תפקיד מרכזי בהגנה המארח, כמו גם רקמות פיתוח ותחזוקה, כרוכה rearrangements מהירה, קולטן בתיווך של שלד התא אקטין כדי ללכוד, אופפים לבלוע חלקיקים גדולים. למרות קולטנים phagocytic איתות המסלולים במורד הזרם, effectors, כגון GTPases רו, זוהו, שיפוץ cytoskeletal דינמי של אירועים ספציפיים קולטן בתיווך phagocytic נותרו בלתי ברורים. לפני ארבעה עשורים, שני מנגנונים נפרדים של phagocytosis, ומעוררות קולטן Fcγ (FcγR) - וגם המשלים קולטן (CR) - מתווכת phagocytosis, אותרו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה. איגוד של אימונוגלובולין G (IgG)-חלקיקי opsonized FcγRs מפעיל את חדירת קרום דק הרחבות, המהווים בתחילה כוס phagocytic כביכול סביב החלקיק לפני זה לחלוטין הופך סגור, כשנעלמת התא. לעומת זאת, המשלים opsonized חלקיקים מופיעים לשקוע פגוציט בעקבות איגוד כהשלמה קולטנים. שני מצבים אלה של phagocytosis, היווצרות גביע phagocytic שוקע בחול, הפכו וותיקה בספרות. עם זאת, ההבחנות בין שני המצבים יש מיטשטשים בדו חות phagocytosis קולטן בתיווך את המשלים עלול לגרום בליטות ממברנה שונים. עם הזמינות של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, מבחני phagocytosis נדרשים לאפשר חזותיים בזמן אמת 3D (תלת-ממדי) של קולטני phagocytic כמה ספציפית התחלקות ספיגת של חלקיקים בודדים. יותר נפוץ גישות המחקר של phagocytosis, כגון מבחני מובילים, להחמיץ את ההזדמנות כדי להבין מה קורה בבית הממשק של חלקיקים phagocytes. כאן נתאר מבחני phagocytic, תוך שימוש בצילום מואץ ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית, לאפשר הדמיה תלת-ממדית של אירועים phagocytic יחיד. בנוסף, אנו מתארים את מבחני חד משמעית תמונה קולטן Fcγ - או משלימים phagocytosis קולטן בתיווך.
Introduction
עשרים שנה לפני התצפית של Metchnikoff של תאי מזנכימה phagocytic כוכב ים הזחלים, בשנת 1882, ופיתוח עוקבות של התיאוריה שלו של phagocytosis1, תיאר ארנסט הקל, בשנת 1862, היבלעות של חלקיקי צבע קשי תמס דם תאים של תטיס fimbris (טתיס fimbria), מין של ים טורף הסלאג (ארנסט הקל. למות Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; דרוק und גיאורג פון הרסוביץ ריימר, ברלין, 1862). הוא תיאר באופן מפורש בליטות הקרום עוטף את החלקיקים, אשר היו לאחר מכן לתוך הציטופלסמה, שהצטברו סביב גרעין התא. יותר מ-100 שנה מאוחר יותר, מחקר חלוצי על ידי קפלן הציע כי היו לפחות שני מנגנונים נפרדים מורפולוגית של phagocytosis2. קפלן הראה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים זה העכבר הצפק מקרופאגים בלע כבשים opsonized-איג תא דם אדום באמצעות סיומות קרום דק אשר הגיע בחוזקה אפוף החלקיק, בתחילה והוליד דמוי ספל מבנה. גביע phagocytic היווצרות נדרש פלמור אקטין מאז זה היה יושב על ידי הרעלן פטרייתי חדיר תא cytochalasin B, חוסמות את הדינמיקה אקטין3. לעומת זאת, תאי דם אדומים כבשים opsonized עם המשלים הופיע לשקוע ישירות מקרופאג ללא הדור של קרום הרחבות, למרות, כמה תמונות, קפלים של קרום ניתן לראות את vacinity מיידית של החלקיקים טובעת. בניגוד למערך גביע phagocytic, המשלים קולטן בתיווך נקלט היה insenstive טיפול cytochalasin ב'2. בניסויים מתוארת על ידי קפלן, opsonization המשלים בוצע על ידי המקננת אימונוגלובולינים ז (IgM) שכותרתו כבשים כדוריות דם אדומות עם סרום של עכברים המשלים חשוכת-C5, אשר עוקף המוליזה על ידי הטרמינל המשלים תלויי-C5 משלימים מורכבים.
שני מצבים של phagocytosis, היווצרות גביע phagocytic, דשן, המזוהה על-ידי קפלן הפכו דעת ויצר שדה4,5,6,7,8,9 . עם זאת, התמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד בשימוש המחקר המקורי על ידי קפלן2, כמו גם מחקר דומה על ידי וייה רומא-לי קאס. et al. 10, מספקים רק תמונות של אירועים phagocytic. בסקירה האחרונה, Rougerie. et al. 11 הדגיש כי הבדלים מורפולוגיים בין FcγR ו- CR-בתיווך phagocytosis הבהרה ו, יתר על כן, ממברנה קפלים נצפו במהלך המשלים חלקיקים קולטן בתיווך ספיגת2. הדמיה לחיות תאים של יחיד אירועים phagocytic הנמשכים מן ללכוד חלקיקים כדי הפנמה, בשילוב עם גנטית שונה עכבר מודלים, יכולה לשפר באופן ניכר את ההבנה שלנו על איך phagocytes ללכוד לבלוע חלקיקים. גישה אחת יכול להיות לשימוש מיקרוסקופ כוח אטומי מהר (AFM) אשר מאפשר הדמיה טופוגרפית ברזולוציה גבוהה במיוחד (10 – 20 ננומטר) של תאים חיים. לאחרונה, מערכת מהירה AFM12 פותחה, אשר מתאימה הדמיה משטחים תא במהירות עם רעש נמוכה. טכניקה זו יש את היתרון הזה פרמטרים ברזולוציה גבוהה, טופוגרפית, מכני של חיים תאים ניתן למדוד במרווחי זמן קצרים (שניות), בניגוד סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר מחייבת את הקיבעון וייבוש נקודה קריטית של תאים. גישה נוספת היא זמן לשגות 3D מיקרוסקופיה קונפוקלית, אשר זמין נרחב, למרות phototoxicity ולהלבנה הם הגבלת גורמים במהלך הקלטות. גישה זו הוא תכליתי מאוד, מאפשרת אופטי חלוקתה עם רזולוציה מרחבית גבוהה ומאפשר גמישות יוצאת דופן תיוג עם מגוון מדהים של הגששים פלורסנט, כולל חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית. כאן נתאר מבחני phagocytosis באמצעות דיסק מסתובב זמן לשגות קונפוקלית לאפשר רזולוציה גבוהה ייתכן של אירועים phagocytic בתיווך קולטן ספציפי.
Protocol
הפרוטוקולים בצע את ההנחיות של ועדת האתיקה שלנו המחקר האנושי המקומי, כמו גם הנחיות טיפול בבעלי חיים.
1. בידוד של מקרופאגים הצפק העכבר תושב
- להקריב את העכבר (3-4 חודשים של גיל (מין או); למשל זן C57BL/6) באמצעות מנת יתר של איזופלוריין הרדמה נדיף (> 5% באוויר) או פחמן דו חמצני13, ואחריו נקע בצוואר הרחם. אינדוקציה של הרדמה, אליו יכול להידרש בקלות על-ידי אובדן בטעותו רפלקס14, וכן על ידי אובדן של רפלקס הנסיגה כפת.
- לאחר ניקוי הבטן של העכבר עם 80% אתנול במים, עושים חתך בעור קו האמצע ולחשוף לקיר הבטן המשמש כבסיס.
- למקם צנתר פלסטיק 24-G peritonium, שטיפה החלל עם האנק הקר של 2 x 4.5 מ"ל buffered תמיסת מלח (HBSS), ללא Ca2 + ו- Mg2 +באמצעות מזרק פלסטיק מ. תוך כדי הזרקת, להשאיר בערך 0.5 mL שיורית HBSS (5-4.5 מ ל (מוזרק) = 0.5 mL) במזרק במקרה הרקמה הוא נשאב לתוך קצה הצנתר וצריך להיות מגורש. להעביר את המתלים aspirated לתוך צינור עגול-התחתון פוליפרופילן 14 מ"ל צנטריפוגה ב x 300 גרם 6.5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: קצה הקטטר פלסטיק הוא בלאנט, אשר, בהשוואה למחט, ממזער לפגיעה תוכן הבטן. בדרך כלל, בעקבות עדין ועיסוי הבטן, ניתן לאחזר 8 mL תאים הצפק השעיה של חלל הצפק. - למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים הצפק 1 מ"ל נטולת ביקרבונט RPMI 1640 בינוני המכיל 20 מ מ Hepes, 10% לא פעיל חום העובר שור סרום, אנטיביוטיקה, כגון פניצילין (100 יחידות/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), שהוכנו על ידי דילול 100 x פניצילין/סטרפטומיצין מטריים. זה נותן בדרך כלל ריכוז בסביבות 6 x 106 תאים/מ ל....
הערה: כ- 30% של תאים מבודדים הצפק הם מקרופאגים, ואילו שאר התאים (קטן יותר) הם לימפוציטים, בעיקר בתאי B.
2. זריעת תאי הצפק בערוץ שקופיות
-
לאחר pipetting התליה תא למעלה ולמטה כדי להפחית את הצליעה, פיפטה הבולם µL 100 לתוך התעלה שמולאו מראש (נפח, 100 µL) של שקופית מצופים fibronectin ערוץ (ערוץ 100 µL יש המידות (אורך x רוחב x גובה): 50 מ מ x 5 מ מ 0.4 מ מ).
- Prefill התא על-ידי הוספת שאחד המאגרים שני של השקופית בערוץ 1 מ ל בתוספת-סרום RPMI 1640 (Hepes) בינוני, הטיית השקופית ולאחר מכן כ רפה בעברית המדיום מן המאגר במורד הזרם (איור 1).
- בועות אוויר הסרה לא רצויים, או רצועות ארוכות של האוויר, בערוץ על-ידי הוספת 1 – 2 מ"ל בינוני לאחד שני המאגרים, בחוזקה החלת כובע מאגר שאיבת האוויר באמצעות הלחץ האגודל קצבית על הכיפה ואז, במקרה הצורך, הטיית השקופית. לאחר סילוק אוויר, להטות את השקופית הכוללת מאגר uncapped (וגם המכילות בינוני) כלפי מטה לפני הסרת הכיפה כדי למנוע אוויר שאתה נשאב לתוך הערוץ.
- Prefill התא על-ידי הוספת שאחד המאגרים שני של השקופית בערוץ 1 מ ל בתוספת-סרום RPMI 1640 (Hepes) בינוני, הטיית השקופית ולאחר מכן כ רפה בעברית המדיום מן המאגר במורד הזרם (איור 1).
- דגירה השקופית בערוץ, עם תאים, תא לחה עבור 2 h ב 37 מעלות צלזיוס, בהעדר CO2 (CO2 אינה נדרשת מאז HCO3-/CO2 מאגר מערכת מוחלף על-ידי Hepes). השקופיות ערוץ יכול להיות ממוקם בנוחות על מתלה, המחזיקה שקופיות שמונה. בדרך כלל, 6-8 שקופיות מוכנות של עכבר אחד, למרות למעלה עד 10 או יותר הוא אפשרי.
-
להסיר את המדף ולהחליף המדיום 1640 RPMI (Hepes) של כל שקופית של ביקרבונט המכילות בינוני RPMI 1640, בתוספת 10% סרום שור עוברית, כמו גם פניצילין/סטרפטומיצין.
- להטות את השקופית, תשאף בינוני תחילה מן המאגר התחתון ולאחר מכן מן המאגר העליון. בשלב הבא, להוסיף 1 מ"ל של מדיום חדש באחד המאגרים, להטות את המדיום שקופיות, לשאוב מן המאגר במורד הזרם, אחרי זה יש זרמו דרך הערוץ.
- לאחר שלב זה לשטוף (exchange בינוני), למלא את השקופית בערוץ על-ידי הוספת 1 מ"ל בינוני באחד המאגרים.
הערה: לשטוף את השלבים באמצעות שקופיות ערוץ זה פשוט מאוד יעיל מבחינת פתרון exchange והסרת התאים הלא-חסיד. שימו לב כי המדיום RPMI 1640 (ביקרבונט) בדרך כלל מראש incubated עם 5% CO2 בלילה כדי להבטיח שיווי משקל תרמי ו- pH.
- דגירה התאים ללון ב- 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO2. ביצוע ניסויים למחרת היום.
3. בידוד תאי דם אדומים אנושי
- יום 2 (ביום השני של ניסויים; לאחר דגירה לילה של מקרופאגים הצפק מבודד), לאסוף את 1-2 מ ל דם ורידי היקפיים מתורם בריא, לתוך צינור heparinized. העברת 1 מ"ל לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL (פוליפרופילן) תחתית עגולה, צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-18 ° C (הגדרת אמפירי), ולהסיר את תגובת שיקוע (פלזמה והמעיל באפי).
- בעדינות תשאף µL 100 של כדוריות דם אדומות sedimented ומערבבים את אמצעי אחסון זה 1:1 ששונה RPMI 1640 (Hepes) בינונית (המתוארות להלן) בצינור microcentrifuge 2.0 mL התחתון עגול. תווית הצינור "1:1".
הערה: המדיום 1640 RPMI (Hepes) שימוש ביום 2 (עבור מבחני) לאחר בידוד תאים מכיל, בנוסף 10% לא פעיל חום העובר שור סרום, פניצילין (100 יחידות/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL) ו- 1 מ מ N-(2-mercaptopropionyl) גליצין (כדי להפחית phototoxicity). בינוני הוא ןלהל בינוני RPMI 1640 (Hepes) "שונה". - פיפטה µL 4 של התליה תא דם אדום מדולל 1:1 אל 2 מ"ל ששינה בינוני RPMI 1640 (Hepes), pipetted מראש לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL (חזור על שלב זה, קרי הכן טורפדו 2). תווית כל שפופרת "4:2000". במקום הצינורות "1:1" ו- "4:2000" על קרח.
4. תיוג של קרום פלזמה מקרופאג
- הסר את השקופיות ערוץ הזריעה החממה2 CO ולהחליף המדיום RPMI 1640 (ביקרבונט) של כל שקופית ששונה בינוני RPMI 1640 (Hepes). בשלב הבא, למקם את התאים תא לחה ב 37 מעלות צלזיוס, בהעדר CO2.
הערה: לאחר דגירה לילה, כביסה, רוב לימפוציטים יוסרו מן התעלה. הרוב המכריע של חסיד התאים הנותרים הם מקרופאגים, אשר ניתן לזהות מורפולוגית או על-ידי immunofluorescence מכתים באמצעות נוגדן anti-F4/80. בסביבות 95% של מקרופאגים הצפק תושב העכבר הם F4/80 חיובי. - לדלל fluorescently ירוק שכותרתו אנטי-העכבר F4/80 נוגדנים (מאוחסן ב 4 ° C) 1:40 ששונה בינוני RPMI 1640 (Hepes). קח שקופית, להטות את זה, פיפטה (ירידה על ידי טיפה) µL 100 של תערובת נוגדן לתוך הפתח של הערוץ 100 µL של השקופית (ראה איור 1). בינוני וביופסיה שזורם לתוך המאגר במורד הזרם. דגירה את התאים עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (סביבת humidified, בלי CO2). במהלך תקופת דגירה, תווית כדוריות דם אדומות האנושי (ראה סעיף 5).
הערה: כל הנאמר לעיל, CO2 אינה נדרשת מאז HCO3-/CO2 מאגר מערכת מוחלף על-ידי Hepes. - לאחר 20 דקות זמן הדגירה (שבמהלכו האדם כדוריות דם אדומות הם צבעונית ו opsonized), שטיפת בשקופית על-ידי הוספת 1 מ"ל ששינה בינוני RPMI 1640 (Hepes) באחד המאגרים וכ רפה בעברית המדיום אחרי זה יש זרמו דרך הערוץ, בהנחייתם של הטיית השקופית. להוסיף 1 מ"ל בינוני לאחסון לטווח קצר או להמשיך ניסוי (קרי, pipetting של חלקיקים (תאי דם אדומים opsonized) והדמיה phagocytosis מאת ספינינג זמן לשגות מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק).
5. תיוג קרום הפלזמה של כדוריות דם אדומות אנושי
- מתחילים תיוג של כדוריות דם אדומות האנושי מיד לאחר המקננת שקופית של מקרופאגים עם נוגדן anti-F4/80 fluorescently שכותרתו ירוק (אחרי סעיף 4.2). לאחר ערבוב עדין, לקחת 400 µL מאחד הצינורות "4:2000" (ראה סעיף 3.3), לוותר על זה לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL (סיבוב למטה). מאפשרים זמן ההשעיה לחמם כ 37 מעלות (ראה פיסקה להלן). להוסיף כתם כתום/אדום פלואורסצנטי קרום פלזמה 0.4 µL (aliquots המאוחסן ב-20 ° C), לערבב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
הערה: בלוק אלומיניום מחוממת, בתוך למינארי, זה שימושי מזעור אובדן חום במהלך הכשרת שקופיות. צינורות ניתן להציב לתוך בארות נשא של הרחוב חימום, נפרדת, או לוחית אלומיניום משולב, מחומם יכול לשמש מרחב עבודה. - לאחר תקופת הדגירה 5 דקות, הכן הצעד הראשון לשטוף על-ידי הוספת 1600 µL שונה RPMI 1640 (Hepes) בינונית (למלא את הצינורית microcentrifuge 2.0 mL).
- Centrifuge את הצינור ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C (הגדרת אמפירי). גלולה אדום קומפקטי צריך להיות גלוי על הקיר (קרי, מחוץ למרכז) בחלק התחתון של הצינור. לסובב את הצינור כך בגדר פונה כלפי מעלה, הסר בזהירות את כל תגובת שיקוע במרוכז (ב שני צעדים) באמצעות טיפ פיפטה 1 – 1.5 מ.
- לאחר כ רפה בעברית את תגובת שיקוע, להוסיף 2,000 µL ששינה 1640 RPMI (Hepes) בינוני, מערבבים היטב (עד resuspend את התאים), חזור על השלבים השאיפה לעיל, צנטריפוגה, תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר (של קרום פלזמה צבעונית, 2 x שטף כדוריות דם אדומות) עם 400 µL בינוני RPMI 1640 (Hepes) שונה. תווית הצינור PMS (קיצור של קרום פלזמה כתם).
הערה: לחלופין, אסתר succinimidyl של נגזרת pH רגישים rhodamine, אשר הופכת יותר חריפה פלורסנט ב- pH חומצי, יכול לשמש כדי לתייג אדם כדוריות דם אדומות. במקרה זה, עוצמת קרינה פלואורסצנטית בנוסף משמש כאמצעי של התבגרות phagosome אחרי חלקיקים כבר הפנימו.
6. opsonization (תיוג) של האדם כדוריות דם אדומות עם העכבר אימונוגלובולין G (אג)
- להוסיף 1 µL עכבר (IgG2b) monoclonal (שיבוט HIR2) נגד האדם CD235a נוגדנים (1 מ"ג/מ"ל) (מאוחסן ב-20 ° C) על הצינור עם התווית PMS (ראה סעיפים 5.2 – 5.5), המכיל קרום פלזמה צבעונית האנושי כדוריות דם אדומות, מושעה במדיום µL 400. CD235a (הידוע גם glycophorin A) היא sialoglycoprotein ממברנה שושלת היוחסין הספציפי erythroid.
-
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות הערה את opsonization של האדם כדוריות דם אדומות עם IgG גורם התלכדות (תא clumping). למרות התלכדות יכול לשמש חיווי חזותי של opsonization, זה לא רצויות עבור ההדמיה של אפקטים phagocytic בודדים. כדי לעקוף את התלכדות, לערבב שוב ושוב התליה תא (כל 1 דקות) באמצעות, למשל, משתנה 20 – 200 µL נפח פיפטה מוגדר 200 µL.
- לקראת סוף תקופת הדגירה 8 דקות, אם הרצוי, תשטוף השקופית macrophage, מודגרות עם ירוק fluorescently שכותרתו נוגדן anti-F4/80, עם 1 מ"ל ששינה בינוני RPMI 1640 (Hepes). להבטיח כי שני מאגרים של השקופית ערוץ חינם בינוני לאחר השלבים כביסה.
7. הדמיה של Phagocytosis של קרום פלזמה צבעונית, אג-מצופה האדם כדוריות דם אדומות
- לאחר 8 דקות הדגירה עם נוגדן anti-CD235a (סעיף 6.2), פיפטה 100 הבולם µL המכיל שהוכתמו קרום פלזמה ו IgG opsonized האנושי כדוריות דם אדומות לתוך הערוץ של שקופית המכילה מקרופאגים המסומנת ירוק F4 נגד פלורסנט / נוגדן 80 (שלב 4). לפיכך, אדום פלואורסצנטי, IgG-opsonized האנושי כדוריות דם אדומות יתווספו phagocytes פלואורסצנטי ירוק (מקרופאגים).
- ברגע אנושי כדוריות דם אדומות נוספו, הר השקופית ערוץ במיקרוסקופ קונפוקלי של הדיסק מסתובב (עם החממה הבמה מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס) הדמיה, לדוגמה, באמצעות 60 X / 1.49 שמן-טבילה המטרה העדשה. להתחיל הדמיה בהקדם האפשרי, שכן חלקיקי התחילו להתיישב בתוך 1 דקות.
הערה: באמצעות פלורסנט חרוזים בקוטר של 100 ננומטר, מדדנו, על ידי ניתוח של נקודת להפיץ פונקציות, XY רזולוציות של x = מיקרומטר 0.22, y = 0.23 מיקרומטר (488 ננומטר לייזר) ו- x = מיקרומטר 0.27, y = 0.27 מיקרומטר (561 ננומטר לייזר). עם זאת, כדי להפחית את photobleaching ואת phototoxicity במהלך זמן לשגות הדמיה ממוחשבת של תאים חיים, אנחנו מתפשרים רזולוציה מרחבית באמצעות 2 x 2 binning. Binning מגביר את רגישות (משפר את יחס אות לרעש), את קצב המסגרות המותרים, אבל על חשבון רזולוציה מרחבית. - השתמש מוקד מושלם (או דומה) מערכת למניעת סחיפה המוקד במהלך הקלטות. לאחר הפעלת המערכת המוקד מושלם, השתמש בפקד היסט להתמקד על גבי מקרופאג בליטות lamellipodial מיד מעל coverslip (ראה הערה להלן) של השקופית בערוץ. רמת המיקוד המתאים ל- Z = 0 מיקרומטר. קבל Z-במחסן מ-1 מיקרומטר מיקרומטר +16-0.8 צעדים מיקרומטר, המסתכם Z 22-פרוסות. Z-במחסן, לדוגמה, ניתן להשיג בקצב של מחסנית 1 (עבור כל ערוץ) כל 15 s עבור סכום כולל של 16 דקות.
הערה: פרקי זמן ממושכים הקלטה סובלים הפסדים של איכות תמונה, בעיקר בשל photobleaching. Z-במחסן נרכשים עבור כל אחד בין שני הערוצים: המקרופאגים הם צילמו באמצעות 488 ננומטר לייזר (ערוץ ירוק), כדוריות דם אדומות האנושי הם צילמו באמצעות לייזר nm 561 (ערוץ אדום). באמצעות גישה זו, תצוגות שונות של מקרופאגים בליעת IgG opsonized האנושי כדוריות דם אדומות-timepoints שונים ניתן להשיג (ראה לדוגמה, איור 2).
הערה: הגדרות אופייניות של המערכת (עם 2 x 2 binning) הם: הערוץ הירוק (20.5% לייזר (50 mW; 488 ננומטר) כוח, רגישות 101 (טווח, 0-255) וזמן חשיפה 200 ms); הערוץ האדום (10.5% לייזר (50 mW; 561 ננומטר) כוח, רגישות 101 (טווח, 0-255) וזמן חשיפה 98 ms).
הערה: החלק התחתון של השקופית הערוץ הוא פולימר עם עובי אותה וגם coverslip #1.5 זכוכית עם אותן תכונות אופטי זכוכית, אבל ראוי לציין, החומר יש את היתרון של חדירות גזים.
8. הדמיה של Phagocytosis של קרום פלזמה צבעונית, מצופים המשלים כדוריות דם אדומות אנושי
- Opsonize המשלים קרום פלזמה צבעונית ו IgG opsonized דם אדום אדם תאים באופן דומה סעיפים 5 ו- 6, פרט, במקום pipetting 4 µL של התליה תא דם אדום מדולל 1:1 אל 2 מ"ל ששינה בינוני RPMI 1640 (Hepes), כפי שמתואר בסעיף 3.3, פיפטה 4 µL לתוך בינוני RPMI 1640 (Hepes) 1 מ"ל שונה, בהתאם לתייג את הצינור 4:1, 000. כך, כדוריות דם אדומות האנושי הם עוד 2 x מרוכז.
- להמשיך השלבים בסעיפים 4 ו-5, אך החל לצאת עם 4:1,000 יותר מאשר מלאי 4:2,000 בדילול של כדוריות דם אדומות אנושי (4:1, 000, 4:2,000 להפנות דילולים עוקבות בתחילה 1:1 מדולל האנושי כדוריות דם אדומות שמתואר בסעיפים 3.1 ו- 3.2).
- להקריב C5 null עכבר (למשל, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; מעבדה ג'קסון) באמצעות אינהלציה איזופלוריין (> 5% באוויר) ואחריו עריפה, ולאסוף הדם. אנחנו בדרך כלל לטפטף כ 0.8 מ של דם לתוך תחתית עגולה מ 14 ל צינור פלסטיק מיד לאחר שאיפה איזופלוריין, עריפת ראש.
- לאחר 1 h, כאשר הדם שנקרש באופן מלא, להעביר את הנוזל שיורית לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כתוצאה מכך, בקפידה לאסוף את הנסיוב צהבהב. בדרך כלל, נוכל לשחזר לפחות 200 µL C5 סרום null. מניחים את הנסיוב null C5 על קרח.
- לאחר 4 דקות דגירה של קרום פלזמה צבעונית האנושי כדוריות דם אדומות עם IgG, להוסיף עוד 1 µL של נוגדן anti-CD235a (לתת 2 x מרוכזים), ואז לקחת 50 µL של התליה תא, לערבב את הכל צינור microcentrifuge mL 2.0 נפרד המכיל 50 µL C5 null סרום. ממשיכים לערבב שוב ושוב (כל 1 דקות) על ידי pipetting למעלה ולמטה, כמו סעיף 6.2, עבור עוד 4 דקות. לפיכך, לאחר שלב זה, כדוריות דם אדומות האנושי יש כבר מתפשט עם נוגדן anti-CD235a עבור סכום כולל של 8 דקות.
הערה: תקופת הדגירה 4 דקות עם סרום null C5 מספיקה להפעיל את המפל המשלים הקלאסית, opsonize כדוריות דם אדומות האנושי עם C3b, אשר הוא ביקע בפקטור אני כדי iC3b.
9. אישור של אג - ו C3b-opsonization של כדוריות דם אדומות אנושי
-
אשר opsonization האנושי כדוריות דם אדומות עם העכבר נוגדנים IgG (IgG2b; ראה סעיף 6.1) אנטי-CD235a על-ידי המקננת התאים עם עז אנטי עכבר (המשני) IgG נוגדן מצומדת כדי fluorophore ניאון ירוק או אדום.
- להוסיף 1 µL העכבר anti-CD235a נוגדנים IgG ו- 1 µL fluorescently שכותרתו אנטי-העכבר המשני נוגדן 400 µL השעיה של כדוריות דם אדומות אנושי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות. לאחר מכן, לשטוף פעמיים (כמו סעיפים 5.2 – 5.5).
- Resuspend בגדר תא עם 400 µL שונה RPMI 1640 (Hepes) µL 100 בינונית, פיפטה של ההשעיה לתוך ערוץ שקופית (ראה איור 1C) עבור קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית הדמיה.
הערה: התאים יהיה סבך (agglutinate) בעקבות כביסה, resuspension, אבל שוטף יש צורך להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע עקב נוגדנים משניים לא מאוגד.
-
לאשר opsonization של כדוריות דם אדומות אנושי, שכותרתו מראש עם העכבר IgG ואת מודגרות עם סרום העכבר null C5, עם C3b/iC3b שימוש, לדוגמה, עכבר אנטי-עכבר C3b/iC3b/C3c נוגדנים של נוגדנים משניים, לדוגמה, עז אנטי חולדה נוגדנים IgG מצומדת כדי fluorophore ניאון ירוק.
- חזור על השלבים בסעיף 8 באמצעות כדוריות דם אדומות אנושית וללא רבב.
- הוסף µL 0.25 fluorescently שכותרתו נוגדן אנטי עכבר C3b/iC3b/C3c לתערובת µL 100 (50 µL התווית על-ידי IgG האנושי כדוריות דם אדומות + 50 µL C5 העכבר null סרום), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות.
- לשטוף פעמיים, resuspend בגדר ב 100 בינוני RPMI 1640 (Hepes) µL ששינה והחלק פיפטה ההשעיה לתוך ערוץ (ראה איור 1C) עבור קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית הדמיה.
Representative Results
תרשים סכימטי של השקופית ערוץ המשמש עבור ההדמיה של phagocytosis ספינינג זמן לשגות מיקרוסקופיה קונפוקלית מוצג באיור1. תאי דם אדומים (hRBCs) אנושי מוכתמים דה מרקר קרום פלזמה ניאון אדום כתום CellMask, בעוד העכבר מבודד תושב מקרופאגים הצפק (Ms) מסומנים בתווית ירוקה פלורסנט מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אנטי-F4/80 נוגדנים ( איור 2), אשר משמש כסמן ספציפי של העכבר מקרופאגים והן כתווית קרום פלזמה. כדוריות דם אדומות האנושי יכול opsonized עם העכבר IgG (mIgG), או עכבר IgM (mIgM), על ידי המקננת התאים עם נוגדן anti-CD235a IgG (או IgM) (CD235a, הידוע גם glycophorin A, הוא חלבון הביעו במפורש על האדם כדוריות דם אדומות). זמן לשגות הדמיה ממוחשבת של מקרופאגים ניאון ירוק הציגה עם אדום פלואורסצנטי האנושי תאי דם אדומים מאפשר הדמיה של חלקיק בודד phagocytic אירועים (איור 2). תצפית קרובה של אירועים phagocytic יחיד מאפשרת פרטים של בליעה מאפשרת ללכוד חלקיקים. לדוגמה, לכידתו של mIgG opsonized האנושי תאי הדם האדומים על ידי filopodium macrophage, הקרנה דק, כמו אצבע, יכול להיות שנצפו (איור 3A; ראה גם Horsthemke. et al. 15). יתר על כן, סחיטת תא דם אדום אנושי במהלך היווצרות גביע phagocytic יכול להיות שנצפו (איור 3 א). על החדרת סרום העכבר טרי, mIgG-opsonized, או mIgM opsonized, אנושי כדוריות דם אדומות לעורר את המפל המשלים הקלאסית, המגיע לשיאו היווצרות קומפלקס התקפה ממברנה היילוד. קינטיקה של המוליזה בתיווך המשלים נמדד על ידי הדמיה תאים שהוכתמו כפול עם כתום CellMask ו- Calcein. ירוק ניאון Calcein cytosolic הוא שוחרר במהירות מתאי במהלך המוליזה (איור 3B).
איור 1: טיפול של שקופיות ערוץ מצופים fibronectin. (א) א ערוץ שקופית מורכב שני מאגרים המחוברים באמצעות ערוץ בעל הממדים 50 מ מ x 5 מ מ 0.4 מ מ. ערוץ שקופיות הן בתחילה שמולאו מראש על-ידי החלת בינוני 1-2 מ לאחד שני המאגרים הטיית השקופית. כמוסות (B) ניתן להניח על המאגרים לפני הדגירה. הפקקים יכול לשמש בנוחות לשאוב החוצה בועות אוויר לא רצויים לפני זריעה הערוץ עם תאים. (ג) האוויר הבועה נטולת 100 µL ערוץ יכול להיות מלא על-ידי ישירות pipetting בינוני לתוך הפה של ערוץ. שלב זה נועד, לדוגמה, מקרופאגים זרע לתוך שקופית או כדי להוסיף gfluorophore (ירוק ניאון)-מצומדת נוגדן anti-F4/80, אשר משמש תווית ממברנה, כמו גם סמן העכבר מקרופאג. (ד) לאחר pipetting חלקיקים, כגון opsonized האנושי כדוריות דם אדומות, לתוך ערוץ נזרע עם fluorescently צבעונית מקרופאגים, השקופית ניתן להניח על השלב של מיקרוסקופ הפוכה, ספינינג זמן לשגות דיסק קונפוקלית וניתן לבצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של phagocytosis. תרשים סכמטי (A) מציג את opsonization של קרום פלזמה צבעונית (פלורסנט אדום)-תאי דם אדומים-אנושי-(hRBCs) עם העכבר (ז) אנטי-CD235a אימונוגלובולין G (mIgG) נוגדנים, מצגת של hRBCs עם תוויות על העכבר מקרופאגים (Ms), מתויג (ירוק פלורסנט) עם ירוק נוגדן anti-F4/80 פלורסנט fluorophore מצומדת. (B) זמן לשגות תמונות (XZ תצוגות), מתקבל על ידי ספינינג קונפוקלית דיסק, מציג היווצרות גביע phagocytic, בליעה של hRBCs mIgG-opsonized. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) 3D שחזורים מציג מקרופאגים בליעת hRBCs mIgG-opsonized. התואמים XZ (עבור 3 של timepoints) מוצגים ברשת ב' spacings מייצגים 5.07 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מידיהם של חלקיק filopodium. תמונות בצילום מואץ, שהושג על ידי סחרור קונפוקלית דיסק, מציג macrophage העכבר לכידה של העכבר אימונוגלובולין G (mIgG)-opsonized האנושי תא דם אדום (hRBC) דרך filopodium (חיצים בחלונית העליונה), תחזית דמוי אצבע. שימו לב כי תא דם אדום מאבד את crenations שלה מוקדם במהלך היווצרות גביע phagocytic. יתר על כן, בגביע phagocytic מופיע לסחוט תא דם אדום מעטפת (המסומנים על ידי חצים בחלונית התחתונה). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הרוב המכריע של phagocytosis מבחני, במיוחד מובילים, מבחני תפוקה גבוהה, אינם מספקים ויזואליזציה של מה חלקיקים הם למעשה בשבי, אפוף בלע. חלוצי מחקרים על ידי וייה רומא-לי קאס. et al. 10 וקפלן2 בשנות השבעים הציע כי ארגון מחדש cytoskeletal שונה היו מעורבים של phagocytosis של IgG-opsonized לעומת חלקיקים opsonized המשלים (כבשים של כדוריות דם אדומות). כאן נתאר מבחני phagocytosis באמצעות ספינינג דיסק קונפוקלית המאפשרים הדמיה ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת של אירועים phagocytic יחיד. פגוציט המודל שלנו הוא העכבר תושב הצפק macrophage, שיכולה להיות מבודדת עם טיפול מינימלי, ונשתמש כדוריות דם אדומות אנושי טרי מבודדים כמו חלקיקים. עם זאת, מבחני phagocytosis יכול לחול על phagocytes אחרים, כגון מקרופאגים הנגזרות מח עצם העכבר או נויטרופילים, העכבר קווי macrophage התא, מקרופאגים נגזר מונוציט אנושי או דם היקפיים אנושי נויטרופילים. במקרה של phagocytes אנושי או העכבר נויטרופילים, אלטרנטיבה המסומנות fluorescently נוגדנים יהיה צורך, כגון תוויות fluorescently אנטי-CD14 נוגדנים (האדם ומונוציטים macrophages)16 או אנטי-Gr-1 (Ly - 6 גרם) נוגדנים (עכבר נויטרופילים).
Unopsonized האנושי כדוריות דם אדומות, כמו כבשים משמשת כדוריות דם אדומות, שהם מבינים במובן כי תאים אלה לא (או, לפחות, מאוד נדיר) בלע על ידי מקרופאגים הצפק העכבר. הדבר מבטיח, בניגוד חרוזי פוליסטירן, פעילות רקע נמוך. כדוריות דם אדומות האנושי יכול opsonized בנוחות עם immunoglobulins באמצעות העכבר IgG או IgM נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD235a (glycophorin A), סמן ספציפיות של האדם אריתרוציטים (כדוריות דם אדומות), מבשרי erythroid17, 18. במבחני מקבילים, שכותרתו fluorescently העכבר אנטי איג או IgM משני נוגדנים יכול להיות מיושם לאשר opsonization. השיעורים נוגדנים IgG ו- IgM הם hemagglutinins, חומרים (נוגדנים) הגורמות תאי דם אדומים agglutinate. כדי להימנע התלכדות, אנחנו לסירוגין לערבב התליה תא במהלך תקופת דגירה 8 דקות עם נוגדן anti-CD235a, ולאחר מכן אנחנו להוסיף ההשעיה מעורבים ישירות לשקופית המכילה מקרופאג ערוץ (שקופית מצופים fibronectin) ללא צעד לשטוף . שטיפת צעדים לערב שקיעת כדוריות דם אדומות על ידי צנטריפוגה, המקדם חריפה התלכדות. לפני opsonizing האנושי כדוריות דם אדומות, מתייגים קרום פלזמה גשש פלורסנט lipophilic כתום/אדום. המכשיר הזה היא פלורסנט במאור פנים עם תחילת הקלטות זמן לשגות, אך האות מתפוגג בהדרגה, כנראה בעיקר בשל photobleaching19. בנוסף, מאקרופאגים הציפוי fibronectin של השקופית עלולים להיות חלש כתום/אדום פלואורסצנטי במהלך הקלטות. בעיה זו נובעת ככל הנראה כביסה לא מספיק תאי דם אדומים אנושי לאחר תיוג. במקום להשתמש בסמן lipophilic קרום פלזמה פלורסנט, כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיקרא עם נגזרת rhodamine רגיש pH באמצעות שלה אמין succinimidyl תגובתי אסתר15,20. זה יש את היתרון של המאפשר ויזואליזציה של התבגרות phagosome מאז עוצמת קרינה פלואורסצנטית עולה עם הפחתת pH15,20, אבל גישה זו יש החיסרון הנמצאות אסתר תגובתי ההכנות כעת יקר ולא יציב לאחר שיחזור במדיום מימית.
אג-opsonized כדוריות דם אדומות האנושי בלע ויה FcγRs, אשר יכול להיות אישרו שימוש מקרופאגים הצפק מבודד מן NOTAM21 או Fcer1g- / - עכברים (Fcer1g נוק אאוט). מקרופאגים NOTAM לאגד IgG opsonized כדוריות דם אדומות אנושי, אבל חוסר ITAM (מוטיב הפעלה מבוססת-טירוזין immunoreceptor) - מתווכת איתות הנדרש כדי לגרום phagocytosis, ואילו Fcer1g נוקאאוט מקרופאגים שאינם מבטאים משטח FcγRs. איג - או IgM-opsonized כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיות בנוסף opsonized עם C3b (אשר הוא ביקע את iC3b) על ידי המקננת התאים עם סרום טרי מבודד מן עכבר null המשלים C5 (סרום פראי-סוג גורם המוליזה). Opsonins IgG ו- IgM להפעיל את המפל המשלים הקלאסית, מה שמוביל להיווצרות נקבוביות (ממברנה התקפה מתחמי) והמסה התא. ב עכברים שחסרו המשלים C5, המפל המשלים ממשיך כהשלמה C3 המחשוף, אבל C5 convertase חסר את המצע הנדרש כדי לעודד את המעבר מסוף. פיתחנו מבחני פשוטה כדי למדוד את קינטיקה של המפל המשלים. בקיצור, תאי דם אדומים האנושי יכול להיות משותף שכותרתו עם אדום פלואורסצנטי, קרום פלזמה סמן את fluorophore ירוק ניאון, cytosolic. על היווצרות של ההתקפה ממברנה מורכבים, שהוקמה על ידי מרכיבי המשלים C5-C9, fluorophore cytosolic זה במהירות (בשניות) איבד מן ציטוזול. ויזואליזציה של הפונקציה סוף-אפקטור (cytolysis) של המפל המשלים ציינו כי 4 דקות זמן הדגירה מספיקה עבור C3b/iC3b opsonization של האדם כדוריות דם אדומות. מבחני מקבילים, C3b/iC3b ציפוי של כדוריות דם אדומות האנושי יכול להיות מוערך בקלות לאחר החלת תערובת של אנטי-העכבר C3b, fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים. במקרה זה, צעד שטיפת נדרש להסיר נוגדנים פלורסנט לא מאוגד. למרות הצעד שטיפת כרוך תא sedimentaion על ידי צנטריפוגה, המקדם התלכדות, opsonization מצליח להיות מוערך בקלות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המשלים קולטן בתיווך phagocytosis יכול לדימות מאת IgG גם החלה- / iC3b-opsonized דם אדום אדם תאים NOTAM או Fcer1g- / - מקרופאגים או על ידי החדרת IgM- / iC3b-opsonized דם אדום אדם תאים מקרופאגים פראי-סוג. IgM-opsonized תאי דם לא יזהו את ITAM המכילים FcγRs (FcγRI, FcγRIII ו- FcγRIV) הדרושה של phagocytosis של חלקיקים IgG-opsonized22.
לשיקוף phagocytic אירועים, קרום הפלזמה של מקרופאגים יכול להיקרא עם נוגדן anti-F4/80 מצומדת fluorophore ניאון ירוק, אשר משמש גם כסמן ספציפי של העכבר מקרופאגים. כדוריות דם אדומות אנושי שיכול להתבצע אדום פלורסנט על ידי דגירה עם סמן קרום פלזמה פלורסנט כתום/אדום, כפי שפורט לעיל. סמן קרום פלזמה lipophilic זה מונע פוטנציאלית השפעות תוויות נוגדן מבוססי מבלבלים. אדום פלואורסצנטי האנושי כדוריות דם אדומות, עם או בלי opsonization, יכול pipetted ישירות לתוך ערוץ 100 µL של שקופית ערוץ ו 3D בצילום מואץ עם תמונה דרך 60 X / 1.49 שמן טבילה (או דומה) המטרה עדשה המבוצעת באמצעות של 488 ננומטר וקווים 561 ננומטר לייזר , בהתאמה, של ספינינג דיסק המיקרוסקופ קונאפוקלית (או דומה). היא מפתה כדי למטב את המערכת עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה, אך רכישת Z חוזרות ונשנות-מעל 16 דקות במחסן או אז עלול לגרום ניכר photobleaching ו- phototoxicity. בחרנו להשתמש binning כדי לקדם את יחס אות לרעש טוב, לאפשר הפחתות עירור העוצמה ו/או פעמים חשיפה, אך כתוצאה מכך רזולוציה אופטית 2 x 2. בנוסף, כדי להפחית את phototoxicity, אנו מוסיפים מנבלות של מינים חמצן תגובתי למדיום. מחקרים עתידיים, מבחני יכול להיות שונה כדי תמונה של phagocytosis תאי דם אדומים מוות אנושי. יישום Ca2 + ionophore, כגון A23187, יכול לשמש כדי לגרום phosphatidylserine הוצאתו23, "לאכול אותי" אות, סימן ההיכר של אפופטוזיס מוקדם24,25.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים חה 3271/4-1 ו- HA 3271/4-2 מ DFG (פתוח), ואת המענק FF-2016-05 מ סיפורה ה 1003 (אשכול של מצוינות 1003), תאים בתנועה (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
