Summary
Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.
Abstract
Fagocytose speelt een belangrijke rol in de verdediging van de gastheer, alsmede in weefsel ontwikkeling en onderhoud, en houdt van snelle en receptor-gemedieerde herschikkingen van het cytoskelet van de actine vastleggen, omhullen en grote deeltjes verzwelgen. Hoewel fagocytische receptoren, stroomafwaarts signaalroutes en effectoren, zoals Rho GTPases, zijn geïdentificeerd, de dynamische cytoskeletal verbouwing van specifieke receptor-gemedieerde fagocytische gebeurtenissen blijven onduidelijk. Vier decennia geleden, twee verschillende mechanismen van fagocytose, wordt geïllustreerd door de Fcγ receptor (FcγR)- en aanvulling receptor (CR) - gemedieerde fagocytose, werden geïdentificeerd met behulp van scanning elektronen microscopie. Binding van immunoglobuline G (IgG)-opsonized deeltjes FcγRs activeert het uitsteeksel van dunne membraan uitbreidingen, die in eerste instantie een zogenaamde fagocytische kopje rond het deeltje vormen voordat het wordt volledig omsloten en in de cel teruggetrokken. In tegenstelling, lijken aanvulling opsonized deeltjes te zinken in de fagocytensysteem na binden aan receptoren aan te vullen. Deze twee modi van fagocytose, fagocytische cup vorming en zinken in geworden goed ingeburgerd in de literatuur. Echter is het onderscheid tussen de twee modi vervaagd door rapporten die aanvulling receptor-gemedieerde fagocytose veroorzaken verschillende membraan uitsteeksels. Met de beschikbaarheid van hoge resolutie beeldvormende technieken, fagocytose testen nodig zijn waarmee real-time 3D (driedimensionaal) visualisatie van hoe specifieke fagocytische receptoren bemiddelen de opname van individuele deeltjes. Meer gebruikte benaderingen voor de studie van fagocytose, zoals eindpunt testen, missen de kans om te begrijpen wat er gebeurt op het raakvlak van deeltjes en fagocyten. Hier beschrijven we fagocytische assays, gebruik van time-lapse draaiende schijf confocale microscopie, waarmee 3D beeldvorming van interne fagocytische gebeurtenissen. Daarnaast beschrijven we testen te ondubbelzinnig beeld Fcγ receptor - receptor-gemedieerde fagocytose aanvullen.
Introduction
Twintig jaar eerder Metchnikoff de observatie van fagocytische mesenchym cellen in starfish larven, in 1882, en verdere ontwikkeling van zijn theorie van fagocytose1, beschreven Ernest Haeckel, in 1862, de engulfment van kleurstof onoplosbare deeltjes door bloed cellen van Thetis fimbris (Tethys fimbria), een soort roofzuchtige zeeslak (Ernest Haeckel. Radiolarien (Rhizopoda radiaria) sterven: Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlijn, 1862). Hij beschreef expliciet membraan uitsteeksels onder omslag steken de deeltjes, die vervolgens werden overgenomen in het cytoplasma en verzameld rond de celkern. Meer dan 100 jaar later, een baanbrekende studie van Kaplan gesuggereerd dat er ten minste twee morfologisch verschillende mechanismen van fagocytose2. Kaplan toonde door middel van scanning elektronen microscopie die muis peritoneale macrofagen ingeslikt een IgG-opsonized schapen rode bloedcellen met behulp van dunne membraan uitbreidingen die bereikt omhoog en strak gehuld het deeltje, die in eerste instantie aanleiding geven tot een cup-achtige structuur. Fagocytische cup vorming vereist actine polymerisatie, aangezien het werd afgeschaft door de cytochalasin van de cel-permeabele schimmel toxine B, bekend voor het blokkeren van actine dynamics3. In tegenstelling, leek schapen rode bloedcellen opsonized met aanvulling te zinken rechtstreeks in de macrofaag zonder de generatie van membraan extensies, hoewel in sommige afbeeldingen, membraan ruches kunnen worden gezien in de onmiddellijke waterleiding van de zinkende deeltjes. In tegenstelling tot de vorming van de fagocytische cup was aanvulling receptor-gemedieerde zinken in insenstive cytochalasin B behandeling2. In de experimenten beschreven door Kaplan, aanvulling opsonization werd uitgevoerd door het broeden van immunoglobuline M (IgM) label schapen rode bloedcellen met serum van aanvulling C5-deficiënte muizen, die hemolyse door de aanvulling C5-afhankelijke terminal omzeilt Als aanvulling op een complex.
De twee modi van fagocytose, fagocytische cup vorming en zinken, geïdentificeerd door Kaplan geworden gevestigde advies in het veld4,5,6,7,,8,9 . Echter, de ultra-hoge resolutie opnamen gebruikt in de originele studie door Kaplan2, evenals een gelijkaardige studie door Munthe-Kaas et al. 10, alleen bieden momentopnamen van fagocytische gebeurtenissen. In een recente review, Rougerie et al. 11 benadrukt dat morfologische verschillen tussen FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose nog moeten worden verduidelijkt, en, bovendien, membraan ruches in aanvulling receptor-gemedieerde deeltje opname2hebben geconstateerd. Live-cel beeldvorming van interne fagocytische evenementen variërend van deeltje vastleggen om internalisering, gecombineerd met genetisch gemodificeerde muismodellen, kunnen ons begrip van hoe de fagocyten vangen en inslikken deeltjes aanzienlijk verbeteren. Een aanpak zou gebruiken snel atomaire kracht microscopie (AFM) waarmee de ultrahoge resolutie (10 – 20 nm) topografische beeldvorming van levende cellen. Onlangs, een snelle AFM systeem12 heeft ontwikkeld, die is geschikt voor imaging cel oppervlakken snel met geringe geluidssterkte. Deze techniek heeft het voordeel dat met een hoge resolutie, topografische en mechanische parameters van levende cellen kunnen worden gemeten met korte tussenpozen (seconden), in tegenstelling tot scanning elektronen microscopie, die vereist dat de vastlegging en de kritische punt drogen van cellen. Een andere benadering is time-lapse 3D confocale microscopie, die wijd-beschikbaar, is hoewel fototoxiciteit en bleken zijn factoren beperking tijdens opnamen. Deze benadering is zeer veelzijdig en kunt optische afdelen met hoge ruimtelijke resolutie en buitengewone flexibiliteit in labelen met een duizelingwekkende aantal fluorescerende sondes, met inbegrip van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen. Hier beschrijven we fagocytose testen met behulp van time-lapse draaiende schijf confocale microscopie waarmee hoge Spatio resolutie van specifieke receptor-gemedieerde fagocytische gebeurtenissen.
Protocol
De protocollen volgen de richtlijnen van onze lokale menselijke onderzoek ethisch comité, alsmede de dierenverzorgers richtsnoeren.
1. isolatie van Resident muis peritoneale macrofagen
- Offeren van de muis (3-4 maanden van leeftijd (of geslacht); bv C57BL/6 stam) met behulp van een overdosis van de vluchtige verdoving Isofluraan (> 5% in lucht) of kooldioxide13, gevolgd door cervicale dislocatie. Inductie van de anesthesie kan gemakkelijk worden beoordeeld door verlies van de wetswijziging reflex14, alsmede door verlies van paw terugtrekking reflex.
- Na het schoonmaken van de buik van de muis met 80% ethanol in water, maken een middellijn huid incisie en de onderliggende buikwand blootstellen.
- Plaats een 24-G kunststof katheter in de peritonium en de lavage de holte met 2 x 4.5 mL ijskoud Henks gebufferde zoutoplossing (HBSS), zonder Ca2 + en Mg2 +via een kunststof spuit 5 mL. Terwijl het injecteren, verlaten ongeveer 0,5 mL residuele HBSS (5-4.5 mL (geïnjecteerd) = 0,5 mL) in de spuit in geval weefsel wordt meegezogen in het puntje van de katheter en moet worden uitgezet. Spoel de aanzuiging suspensie in een 14 mL polypropyleen ronde-onderkant-buis en centrifuge op 300 x g gedurende 6,5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De tip van de plastic katheter is blunt, die, vergeleken met een naald, minimaliseert letsel aan de buik inhoud. Typisch, volgende zachte buik massage, 8 mL peritoneale celsuspensie worden teruggehaald uit de peritoneale holte. - Verwijder het supernatant en resuspendeer de peritoneale cellen in 1 mL natriumbicarbonaat-vrije RPMI 1640 medium met 20 mM Hepes, 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum en antibiotica, zoals penicilline (100 eenheden/mL) en streptomycine (100 µg/mL), opgesteld door 100 x penicilline/streptomycine 1:100 te verdunnen. Dit geeft meestal een concentratie van ongeveer 6 x 106 cellen/mL.
Opmerking: Ongeveer 30% van de geïsoleerde peritoneale cellen zijn macrofagen, terwijl de andere (kleinere) cellen lymfocyten, voornamelijk B cellen zijn.
2. zaaien van peritoneale cellen in kanaal dia 's
-
Na de celsuspensie omhoog en omlaag om te verkleinen samendoen pipetteren, Pipetteer 100 µL schorsing in het ingevulde kanaal (volume, 100 µL) van de dia van een fibronectine beklede kanaal (een 100 µL-kanaal heeft de afmetingen (lengte x breedte x hoogte): 50 x 5 mm 0,4 mm).
- Prefill de zaal door 1 mL serum-aangevuld RPMI 1640 (Hepes) medium toe te voegen aan een van de twee stuwmeren van de dia kanaal, kantelen van de dia en klik vervolgens aspirating het medium uit het stroomafwaarts reservoir (Figuur 1).
- Verwijder ongewenste luchtbellen of lange stroken van lucht, in het kanaal door 1-2 mL medium toe te voegen aan een van de twee stuwmeren, strak toe te passen een reservoir dop en dan pompen uit de lucht door de druk van de ritmische duim over het GLB en eventueel kantelen de dia. Na uitzetting van lucht, tilt de dia met de afgetopte reservoir (en bevattende medium) neerwaartse voordat het verwijderen van het GLB om te voorkomen dat de lucht gezogen terug in het kanaal.
- Prefill de zaal door 1 mL serum-aangevuld RPMI 1640 (Hepes) medium toe te voegen aan een van de twee stuwmeren van de dia kanaal, kantelen van de dia en klik vervolgens aspirating het medium uit het stroomafwaarts reservoir (Figuur 1).
- Incubeer de kanaal dia, bezaaid met cellen, in een vochtige kamer voor 2 uur bij 37 ° C in afwezigheid van CO2 (CO2 is niet verplicht sinds de HCO3-/CO2 buffersysteem is vervangen door Hepes). De kanaal-dia's kunnen gemakshalve worden geplaatst op een rek, waarin acht dia's. 6 – 8 dia's zijn meestal bereid uit één muis, hoewel van 10 of meer mogelijk is.
-
Verwijderen van het rek en het RPMI 1640 (Hepes) medium in elke dia voor RPMI 1640 middellange met bicarbonaat, aangevuld met 10% foetale runderserum, evenals penicilline/streptomycine uit te wisselen.
- Kantelen van de dia en gecombineerd medium eerst uit het onderste reservoir en vervolgens uit het bovenste reservoir. Daarna, voeg 1 mL van het nieuwe medium toe aan een van de stuwmeren, kantelen van de dia en aspirate medium uit de stroomafwaartse reservoir, nadat het door het kanaal is gestroomd.
- Na deze stap wassen (middellange exchange), de kanaal-dia te vullen door toevoeging van 1 mL medium aan een van de stuwmeren.
Opmerking: Wassen stappen met behulp van kanaal dia's is zeer eenvoudig en efficiënt in termen van de uitwisseling van de oplossing en niet-aanhanger cellen verwijderen. Merk op dat het medium RPMI 1640 (bicarbonaat) normaal vooraf bebroede met 5% CO2 's nachts om thermische en pH evenwicht.
- Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Het uitvoeren van experimenten op de volgende dag.
3. isolatie van menselijke rode bloedcellen
- Op dag 2 (tweede dag van experimenten; na overnachting incubatie van de geïsoleerde peritoneale macrofagen), 1-2 mL perifeer veneuze bloed van een gezonde donor, in een heparinized buis verzamelen. Breng 1 mL in een ronde bodem 2,0 mL (polypropyleen) microcentrifuge buis, centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij 18 ° C (empirische instelling), en verwijder de bovendrijvende substantie (plasma en buffy coat).
- Zachtjes gecombineerd 100 µL van de gesedimenteerd rode bloedcellen en meng dit volume 1:1 met gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium (hieronder beschreven) in een ronde bodem 2,0 mL microcentrifuge buis. Label de buis "1:1".
Opmerking: Het RPMI 1640 (Hepes) medium gebruikt op dag 2 (voor testen) na isoleren cellen bevat, naast de 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, penicilline (100 eenheden/mL), streptomycine (100 µg/mL) en 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glycine (te verminderen Fototoxiciteit). Dit medium is hierna te noemen "gewijzigde" RPMI 1640 (Hepes) medium. - Pipetteer 4 µL van de 1:1 verdunde rode bloedcellen schorsing in 2 mL gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium, vooraf afgepipetteerde in een tube van 2,0 mL microcentrifuge (Herhaal deze stap, d.w.z. bereiden 2 buizen). Label elke buis "4:2000". Plaats de buizen "1:1" en "4:2000" op het ijs.
4. etikettering van het plasmamembraan Macrophage
- De geplaatste kanaal dia's te verwijderen uit de incubator van CO2 en het RPMI 1640 (bicarbonaat) medium in elke dia voor gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium uit te wisselen. Vervolgens plaatst u de cellen in een vochtige kamer bij 37 ° C in afwezigheid van CO2.
Opmerking: Na overnachting incubatie en wassen, allermeest naar de lymfocyten worden verwijderd uit het kanaal. De meeste van de resterende Adherente cellen zijn macrofagen, die morfologisch of door immunofluorescentie kleuring met behulp van anti-F4/80 antilichaam kunnen worden geïdentificeerd. Ongeveer zijn 95% van de muis resident peritoneale macrofagen F4/80 positieve. - Verdun fluorescently groene gelabelde anti-muis F4/80 antilichaam (opgeslagen bij 4 ° C) 1:40 in gewijzigde RPMI 1640 (Hepes) medium. Nemen van een dia, kantelen en Pipetteer 100 µL van de (druppel voor druppel) van de antilichaam-mengsel in de opening van het kanaal van de 100 µL van de dia (Zie Figuur 1). Gecombineerd medium dat mondt uit in het stroomafwaarts reservoir. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C (bevochtigde omgeving, zonder CO2). Label tijdens de incubatietijd, de menselijke rode bloedcellen (zie sectie 5).
Opmerking: Zoals zinspeelde op bovenstaande, CO2 is niet vereist sinds het HCO3-/CO2 buffersysteem is vervangen door Hepes. - Na 20 min incubatietijd (waarin menselijke rode bloedcellen zijn gekleurd en opsonized), was de dia door toevoeging van 1 mL RPMI 1640 (Hepes) middellange tot één van de reservoirs en de aspirating van het medium bewerkt, nadat het is gestroomd via het kanaal, vergemakkelijkt door de dia te kantelen. Voeg 1 mL medium voor korte termijn opslag of overgaan tot een experiment (dat wil zeggen, pipetting in deeltjes (opsonized rode bloedcellen) en imaging fagocytose door time-lapse draaiende schijf confocale microscopie).
5. het labelen van het Plasma-membraan van menselijke rode bloedcellen
- Om te beginnen de etikettering van menselijke rode bloedcellen onmiddellijk na een dia aan van macrofagen met groene fluorescently geëtiketteerde anti-F4/80 antilichaam aan het broeden (na punt 4.2). Na het zacht mengen, neem 400 µL van een van de buizen van de "4:2000" (zie punt 3.3) en afzien van het in een buis (ronde onderkant) 2,0 mL microcentrifuge. Tijd voor de schorsing te warm tot ongeveer 37 ° C (zie alinea hieronder). Toevoegen van 0.4 µL oranje/rood fluorescerende plasmamembraan vlek (aliquots opgeslagen bij-20 ° C), meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
Opmerking: Een verwarmde aluminium blok, geplaatst binnen de laminaire flow-kap, is handig voor het minimaliseren van warmteverlies bij de voorbereiding van de dia's. Buizen kunnen worden geplaatst in boring putjes van het blok van de verwarming en een separaat of geïntegreerd, verwarmde aluminiumplaat kan dienen als een werkruimte. - Na de incubatieperiode 5 min bereiden u eerst wassen door toevoeging van 1600 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium (om te vullen de 2,0 mL microcentrifuge buis).
- Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 min bij 18 ° C (empirische instelling). Een compacte rode pellet moet zichtbaar zijn op de muur (dat wil zeggen, uit het midden) van de onderkant van de buis. Draai de buis zo dat de pellet naar boven zijn gericht en verwijder voorzichtig alle van het supernatans achtereenvolgens (in twee stappen) met behulp van een 1-1.5 mL pipet tip.
- Na aspirating het supernatant, 2.000 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) middellange, mix (om resuspendeer de cellen) toevoegen en herhaal de bovenstaande stappen voor centrifugeren en supernatant aspiratie.
- Resuspendeer de pellet (van plasmamembraan gekleurd en 2 x gewassen rode bloedcellen) met 400 µL van gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium. Label de buis PMS (afkorting voor plasmamembraan vlek).
Opmerking: U kunt ook de succinimidyl ester van een pH-gevoelige rhodamine derivaat, die meer wordt sterk fluorescerende bij zure pH, kan worden gebruikt om menselijke rode bloedcellen label. In dit geval, fungeert de intensiteit van de fluorescentie daarnaast als een maatregel van phagosome rijping nadat deeltjes hebben zijn geïnternaliseerd.
6. opsonization (etikettering) van menselijke rode bloedcellen met muis immunoglobuline G (IgG)
- Voeg 1 µL muis (IgG2b) monoclonal (kloon HIR2) anti-menselijke CD235a (1 mg/mL) antilichaam (opgeslagen bij-20 ° C) aan de buis PMS (Zie secties 5.2 – 5.5), aangeduid met plasmamembraan gekleurd menselijke rode bloedcellen geschorst in 400 µL medium. CD235a (ook bekend als glycophorin A) is een erythroid afstamming-specifieke membraan-sialoglycoprotein.
-
Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten opmerking dat opsonization van menselijke rode bloedcellen met IgG oorzaken agglutinatie (cel samendoen). Hoewel agglutinatie als een visuele indicator van opsonization dienen kan, is het onwenselijk zijn voor de beeldvorming van afzonderlijke fagocytische effecten. Ingesteld op 200 µL te omzeilen agglutinatie, herhaaldelijk Meng de celsuspensie (elk 1 min) gebruikt, bijvoorbeeld een variabele 20-200 µL volume pipet.
- Tegen het einde van de incubatieperiode 8 min, als gewenste, wassen op de macrofaag dia, geïncubeerd met groene fluorescently-label anti-F4/80 antilichaam, met 1 mL gemodificeerde RPMI 1640 (Hepes) medium. Zorgen ervoor dat beide reservoirs van de dia kanaal vrij van medium na de stappen wassen.
7. de fagocytose van plasmamembraan imaging gekleurd en IgG-gecoate menselijke rode bloedcellen
- Na de incubatie 8 min met anti-CD235a antistof (punt 6.2) Pipetteer 100 µL schorsing met plasmamembraan-gekleurd en IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen in het kanaal van een dia waarin macrofagen gemarkeerd met groen fluorescent anti-F4 / 80 antilichaam (stap 4). Dus worden rood fluorescerende, IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen toegevoegd aan de groen fluorescente fagocyten (macrofagen).
- Zodra de menselijke rode bloedcellen bijgekomen, mount de kanaal dia op een draaiende schijf confocal microscoop (met de fase incubator ingesteld op 37 ° C) voor imaging, bijvoorbeeld via een 60 X / 1,49 olie-immersie objectief. Start zo snel mogelijk, imaging aangezien deeltjes beginnen te vestigen binnen 1 min.
Opmerking: Het gebruik van fluorescerend parels met een diameter van 100 nm, we gemeten, door analyse van punt verspreiding functies, XY resoluties voor x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm laser) en x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm laser). Echter, verklein photobleaching en fototoxiciteit tijdens time-lapse 3D beeldvorming van levende cellen en wij compromissen sluiten ruimtelijke resolutie met behulp van 2 x 2 weggooien. Weggooien verhoogt de gevoeligheid (verbetert de signal-to-noise verhouding) en de toegestane framesnelheid, maar ten koste van ruimtelijke resolutie. - Gebruik een perfecte focus (of soortgelijke) systeem om te voorkomen dat focus drift tijdens opnames. Na het activeren van de perfecte focus systeem, met de opdracht verschuiving te concentreren op macrophage lamellipodial uitsteeksels direct boven het dekglaasje aan (zie hieronder nota) van de dia van het kanaal. Deze focus-niveau correspondeert met Z = 0 µm. verkrijgen Z-stacks van-1 µm in +16 µm 0.8 µm stappen, wat neerkomt op 22 Z-segmenten. Z-stacks, bijvoorbeeld bekomen worden met een snelheid van 1 stapel (voor elk kanaal) elke 15 s voor een totaal van 16 min.
Opmerking: Langere opname lijdt verlies van beeldkwaliteit, voornamelijk als gevolg van photobleaching. Z-stacks zijn verworven voor elk van de twee kanalen: macrofagen zijn beeld met behulp van een 488 nm laser (groene kanaal) en menselijke rode bloedcellen zijn beeld met behulp van een 561 nm laser (rode kanaal). Met behulp van deze aanpak, verschillende weergaven van de macrofagen inname van IgG-opsonized menselijke rode bloedcellen op verschillende tijdstippen kunnen worden verkregen (bijvoorbeeld, Zie Figuur 2).
Opmerking: De standaardinstellingen van het systeem (met 2 x 2 weggooien) zijn: groene kanaal (20,5% laser (50 mW; 488 nm) macht, 101 gevoeligheid (bereik 0 – 255) en 200 ms belichtingstijd); rode kanaal (10,5% laser (50 mW; 561 nm) macht, 101 gevoeligheid (bereik 0-255) en 98 ms belichtingstijd).
Opmerking: De onderkant van de dia van het kanaal is een polymeer met dezelfde dikte als een dekglaasje #1.5 glas aan en dezelfde optische eigenschappen van glas, maar met name het materiaal heeft het voordeel van gas permeabiliteit.
8. imaging de fagocytose van plasmamembraan gekleurd en menselijke rode bloedcellen aanvulling beklede
- Aanvulling-opsonize plasmamembraan gekleurd en IgG-opsonized rode bloed cellen op dezelfde manier aan de punten 5 en 6, behalve, in plaats van pipetting 4 µL van de schorsing van de 1:1 verdunde rode bloedcel in 2 mL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium, zoals beschreven in punt 3.3, Pipetteer 4 µL in 1 mL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium, en dienovereenkomstig label de buis 4:1, 000. De menselijke rode bloedcellen zijn dus 2 x meer geconcentreerd.
- Verder met de stappen in de secties 4 en 5, maar beginnen met de 4:1,000 in plaats van de voorraad 4:2,000 verdund van menselijke rode bloedcellen (4:1, 000 en 4:2,000 verwijzen naar de volgende verdunningen van de aanvankelijk 1:1 verdunde menselijke rode bloedcellen beschreven in secties 3.1 en 3.2).
- Offeren een C5 null muis (bijvoorbeeld B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) inademing (> 5% in lucht) Isofluraan gevolgd door onthoofding, en verzamelen van het bloed. Meestal druipen we ongeveer 0,8 mL bloed in een ronde bodem 14 mL plastic buis onmiddellijk na Isofluraan inhalatie en onthoofding.
- Na 1 uur wanneer het bloed is volledig gecoaguleerd, overdracht van de resterende vloeistof in een tube van 2,0 mL microcentrifuge en centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, zorgvuldig verzamelen de gelige serum. Meestal herstellen wij minstens 200 µL C5 null serum. Plaats de C5 null serum op ijs.
- Nadat 4 min incubatie van plasmamembraan menselijke rode bloedcellen met IgG bevlekt, voeg een ander 1 µL van anti-CD235a antistof (het geven van 2 x geconcentreerd), en vervolgens 50 µL van de celsuspensie nemen en meng het in een aparte 2,0 mL microcentrifuge buis met 50 µL C5 null serum. Blijven herhaaldelijk Meng (elk 1 min) door pipetteren op en neer, zoals in punt 6.2, voor een andere 4 min. Dus, na deze stap, de menselijke rode bloedcellen hebben zijn geïncubeerd met anti-CD235a antistof voor een totaal van 8 min.
Opmerking: De incubatietijd 4 min met C5 null serum is voldoende om te activeren van de klassieke complement cascade en opsonize de menselijke rode bloedcellen met C3b, die is cleaved met Factor ik naar iC3b.
9. bevestiging van IgG - en C3b-opsonization van menselijke rode bloedcellen
-
Opsonization van menselijke rode bloedcellen met muis anti-CD235a IgG (IgG2b; zie punt 6.1) antilichaam bevestigen door het broeden van de cellen met de geit anti-muis (secundaire) IgG antilichamen geconjugeerd met een groen of rood fluorescerende fluorophore.
- Voeg 1 µL muis anti-CD235a IgG antilichamen en 1 µL fluorescently geëtiketteerde anti-muis secundair antilichaam tot 400 µL opschorting van menselijke rode bloedcellen, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten. Vervolgens wassen twee keer (zoals in secties 5.2 – 5.5).
- Resuspendeer de pellet cel met 400 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium en Pipetteer 100 µL van de schorsing in een kanaal (Zie Figuur 1 c) schuif voor beeldvorming van de confocal fluorescentie.
Opmerking: De cellen zal klomp (agglutineert) na wassen en resuspensie, maar wassen is nodig om de achtergrond fluorescentie als gevolg van niet-afhankelijke secundair antilichaam.
-
Bevestigen van de opsonization van menselijke rode bloedcellen, vooraf aangeduid met muis IgG en geïncubeerd met C5 null muis serum, met C3b/iC3b gemaakt met, bijvoorbeeld, rat anti-muis C3b/iC3b/C3c antilichaam en een secundair antilichaam, bijvoorbeeld geit anti-rat IgG antilichamen zijn geconjugeerd om een groen fluorescerend fluorophore.
- Herhaal de stappen in sectie 8 met behulp van onbevlekt menselijke rode bloedcellen.
- Voeg 0,25 µL fluorescently label anti-muis C3b/iC3b/C3c antilichaam aan de 100 µL mengsel (50 µL IgG-geëtiketteerden menselijke rode bloedcellen + 50 µL C5 null muis serum) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten.
- Twee keer wassen, resuspendeer de pellet in 100 µL bewerkt RPMI 1640 (Hepes) medium en Pipetteer de schorsing in een kanaal (zie figuur 1 c) schuif voor beeldvorming van de confocal fluorescentie.
Representative Results
Een schema van de dia van het kanaal gebruikt voor de beeldvorming van fagocytose door time-lapse spinnen confocale microscopie is afgebeeld in Figuur 1. Menselijke rode bloedcellen (hRBCs) worden gekleurd met de rode fluorescerende plasmamembraan markering CellMask Orange, overwegende dat de geïsoleerde muis resident peritoneale macrofagen (Ms) worden aangeduid met groene fluorescerende Alexa Fluor 488-geconjugeerde anti-F4/80 antilichaam ( Figuur 2), die dient als een specifieke marker van muis macrofagen en tevens als een plasmamembraan label. Menselijke rode bloedcellen kan worden opsonized met muis IgG (mIgG), of een muis IgM (mIgM), door het broeden van de cellen met IgG (of IgM) anti-CD235a antistof (CD235a, ook bekend als glycophorin A, is een eiwit dat specifiek op menselijke rode bloedcellen uitgedrukt). Time-lapse 3D beeldvorming van groen fluorescent macrofagen gepresenteerd met rode fluorescerende menselijke rode bloedcellen kunt visualisatie van één deeltje fagocytische gebeurtenissen (Figuur 2). Nauwkeurige observatie van één fagocytische gebeurtenissen kunt details van het deeltje afvangen en inname te worden afgebakend. Bijvoorbeeld, kan het vastleggen van een mIgG-opsonized menselijke rode bloedcellen door een macrofaag-filopodium, een dunne, vinger-achtige projectie, worden waargenomen (figuur 3A; Zie ook Horsthemke et al. 15). bovendien het knijpen van een menselijke rode bloedcellen tijdens fagocytische cup vorming kan worden waargenomen (figuur 3A). Leiden tot de klassieke complement cascade, die in de vorming van een hemolytische membraan aanval complex culmineert bij invoering van verse muis serum, mIgG-opsonized, of mIgM-opsonized, menselijke rode bloedcellen. De kinetiek van aanvulling-bemiddelde Hemolyse kan worden gemeten door cellen dual-gekleurd met CellMask Orange en calceïne imaging. Groen fluorescent cytosolische calceïne is het snel vrijgelaten uit cellen tijdens hemolyse (figuur 3B).
Figuur 1: behandeling van fibronectine beklede kanaal dia. (A) A kanaal dia bestaat uit twee reservoirs die met elkaar verbonden door een kanaal met de afmetingen 50 x 5 mm 0.4 mm. kanaal glijbanen zijn in eerste instantie vooraf ingevuld door 1-2 mL medium op een van de twee stuwmeren toe te passen en de dia te kantelen. (B) Caps kunnen worden geplaatst op de stuwmeren vóór incubatie. De doppen kunnen gemakshalve worden gebruikt om de pomp uit ongewenste luchtbellen vóór het zaaien van het kanaal met cellen. (C) The air bubble-free 100 µL kanaal kan worden ingevuld door direct pipetteren medium in de mond van een kanaal. Deze stap wordt gebruikt, bijvoorbeeld om zaad macrofagen in een dia of toe te voegen gfluorophore (groen fluorescent)-geconjugeerd antilichaam van de anti-F4/80, dat als een membraan-label, evenals een muis macrofaag marker fungeert. (D) na pipetteren deeltjes zoals opsonized menselijke rode bloedcellen, een kanaal bezaaid met fluorescently gekleurd macrofagen, de dia kan worden geplaatst in het werkgebied van een omgekeerde Microscoop en time-lapse draaiende schijf confocale microscopie kan worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose. (A) schematisch diagram toont de opsonization van plasmamembraan gekleurd (rode TL) menselijke rode bloedcellen (hRBCs) met antilichaam van muis (m) anti-CD235a immunoglobulin G (mIgG), en de presentatie van gelabelde hRBCs voor muis macrofagen (Ms), Label (groene TL) met groene fluorescerende fluorophore-geconjugeerde anti-F4/80 antilichaam. (B) Time-lapse beelden (XZ meningen), verkregen door het draaien van de schijf confocale microscopie, tonen fagocytische cup vorming en inname van mIgG-opsonized hRBCs. Schaal bar = 10 µm. (C) 3D-reconstructies tonen macrofagen inname van mIgG-opsonized hRBCs. Overeenkomstige XZ weergaven (voor 3 van de timepoints) staan in B. Grid spaties vertegenwoordigen 5.07 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: inname van een deeltje door een filopodium. Time-lapse beelden, verkregen door het draaien van de schijf confocale microscopie, tonen een muis macrofaag vastleggen van een muis immunoglobulin G (mIgG)-opsonized menselijke rode bloedcellen (hRBC) via een filopodium (pijlen in het bovenste deelvenster), een vinger-achtige projectie. Merk op dat de rode bloedcellen haar crenations vroeg tijdens fagocytische cup vorming verliest. Bovendien verschijnt de fagocytische cup te knijpen de omhuld rode bloedcellen (aangegeven door de pijlen in het onderste deelvenster). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De overgrote meerderheid van fagocytose tests, met name eindpunt en high-throughput assays, bieden geen visualisatie van hoe deeltjes zijn eigenlijk gevangen, gehuld en ingeslikt. Baanbrekende studies door Munthe-Kaas et al. 10 en Kaplan2 in de jaren 1970 stelde dat opvallend verschillende cytoskeletal reorganisaties bij de fagocytose van IgG-opsonized versus aanvulling-opsonized deeltjes (schapen rode bloedcellen betrokken waren). Hier beschrijven we fagocytose testen met behulp van de draaiende schijf confocale microscopie, waarmee de hoge resolutie, real-time beeldvorming van interne fagocytische gebeurtenissen. Onze fagocytensysteem model is het de resident peritoneale macrophage van muis, die kunnen worden geïsoleerd met minimaal hanteren, en we gebruiken vers geïsoleerde menselijke rode bloedcellen als deeltjes. De fagocytose testen kunnen echter worden toegepast op andere fagocyten, zoals muis beenmerg-afgeleide macrofagen of neutrofielen, muis macrofaag cellijnen, menselijke monocyt-afgeleide macrofagen, perifere bloed neutrofiele granulocyten. In het geval van menselijke fagocyten of muis neutrofielen zou alternatief fluorescently label antilichamen nodig, zoals fluorescently geëtiketteerde anti-CD14 antilichamen (menselijke monocyten/macrofagen)16 of anti-Gr-1 Ly - 6 G antilichamen (muis neutrofielen).
Unopsonized menselijke rode bloedcellen, zoals traditioneel gebruikte schapen rode bloedcellen, zijn inert, ook in de zin dat deze cellen niet (of althans, zeer zelden) door muis peritoneale macrofagen ingenomen zijn. Hierdoor, in tegenstelling tot polystyreen kralen, lage achtergrond activiteit. Menselijke rode bloedcellen kan gemakkelijk worden opsonized met immunoglobulinen met muis IgG of IgM monoklonale antilichamen tegen CD235a (glycophorin A), een specifieke marker van menselijke erytrocyten (rode bloedcellen) en erythroid precursoren17, 18. in parallelle testen, fluorescently geëtiketteerde anti-muis IgG of IgM secundaire antilichamen kunnen worden toegepast om te bevestigen van opsonization. De IgG en IgM antilichamen klassen zijn hemagglutinins, stoffen (antistoffen) die ervoor zorgen dat de rode bloedcellen te agglutineert. Voorkom agglutinatie, we met tussenpozen Meng de celsuspensie tijdens de incubatieperiode 8 min met anti-CD235a antistof, en dan we de gemengde schorsing rechtstreeks toevoegen aan een macrofaag-bevattende kanaal dia (fibronectine beklede dia zonder een wassen stap) . Wassen stappen betrekken sedimentatie van rode bloedcellen door middel van centrifugeren, die sterk agglutinatie-eenheden bevordert. Voordat opsonizing menselijke rode bloedcellen, bestempelen we het plasmamembraan met een lipofiele oranje/rood fluorescerende sonde. Deze sonde is helder fluorescerende aan het begin van time-lapse opnamen, maar het signaal geleidelijk verdwijnt, waarschijnlijk grotendeels te wijten aan photobleaching19. Daarnaast, kunnen macrofagen en de fibronectine coating van de dia worden zwak oranje/rood fluorescerende tijdens opnames. Dit probleem is waarschijnlijk te wijten aan onvoldoende wassen van menselijke rode bloedcellen na labeling. In plaats van met behulp van een lipofiele fluorescerende plasmamembraan markering, kan menselijke rode bloedcellen worden aangeduid met een pH-gevoelige rhodamine derivaat met behulp van de amine reactieve succinimidyl ester15,20. Dit heeft het voordeel van het toestaan van visualisatie van phagosome rijping aangezien fluorescentie intensiteit toeneemt met afnemende pH15,20, maar deze aanpak heeft als nadeel dat reactief ester preparaten momenteel zijn duur en unstable na reconstitutie in waterig medium.
Menselijke rode bloedcellen igG-opsonized worden ingenomen via FcγRs, die kan worden bevestigd met behulp van peritoneale macrofagen geïsoleerd van NOTAM21 of Fcer1g- / - muizen (Fcer1g knock-out). NOTAM macrofagen binden menselijke rode bloedcellen IgG-opsonized, maar geen ITAM (immunoreceptor tyrosine gebaseerde activering motief) - bemiddelde signalering vereist voor het opwekken van fagocytose, overwegende dat Fcer1g knock-out macrofagen doen niet express oppervlakte FcγRs. IgG - of menselijke rode bloedcellen IgM-opsonized kan bovendien worden opsonized met C3b (die is gekloofd te iC3b) door de cellen met vers geïsoleerde serum van een aanvulling C5 null muis aan het broeden (wild-type serum veroorzaakt hemolyse). De opsonins IgG en IgM activeren de klassieke complement cascade, die tot de vorming van de poriën (membraan aanval complexen) en lysis van de cel leidt. In muizen aanvulling C5 ontbreekt, de complement cascade overgaat tot aanvulling van C3 splijten, maar C5 convertase mist het substraat moet de terminal pathway katalyseren. We ontwikkelden de eenvoudige tests om te meten de kinetiek van de complement cascade. Kortom, kunnen menselijke rode bloedcellen samen met een label met een rood fluorescerende, plasmamembraan marker en de groen fluorescente, cytosolische fluorophore. Bij de vorming van de complexe membraan-aanval, gevormd door aanvulling componenten C5-C9, de cytosolische fluorophore is snel (in seconden) van het cytosol verloren. Visualisatie van de einde-effector (cytolysis) functie van de complement cascade aangegeven dat de incubatietijd 4 min voor C3b/iC3b opsonization van menselijke rode bloedcellen volstaat. In parallel tests, kan C3b/iC3b coating van menselijke rode bloedcellen worden gemakkelijk beoordeeld na het toepassen van een mengeling van anti-muis C3b en fluorescently voorzien secundaire antilichamen. In dit geval, is een wassen stap vereist voor het verwijderen van niet-afhankelijke fluorescerende antilichamen. Hoewel de wassen stap cel sedimentaion door middel van centrifugeren, die agglutinatie impliceert bevordert, kan de succesvolle opsonization gemakkelijk worden beoordeeld door confocale microscopie. Aanvulling receptor-gemedieerde fagocytose beeld kan worden door beide toepassen IgG- / iC3b-opsonized rode bloed cellen NOTAM of Fcer1g- / - macrofagen of doordat IgM- / iC3b-opsonized rode bloed cellen wild-type macrofagen. Bloedcellen IgM-opsonized worden niet herkend door de ITAM-bevattende FcγRs (FcγRI, FcγRIII en FcγRIV) vereist voor de fagocytose van IgG-opsonized deeltjes22.
Naar image fagocytische kunnen gebeurtenissen, het plasma-membraan van macrofagen gelabeld zijn met groene fluorescerende fluorophore geconjugeerd anti-F4/80 antilichaam, die ook als een specifieke marker van muis macrofagen fungeert. Menselijke rode bloedcellen kunnen worden gerenderd rood fluorescerende door incubatie met een oranje/rood fluorescerende plasmamembraan marker, zoals hierboven besproken. Deze markering lipofiele plasmamembraan vermijdt mogelijke storende effecten van antilichaam gebaseerde etiketten. Rood fluorescerend menselijke rode bloedcellen, met of zonder opsonization, kan direct worden pipetted in het kanaal van de 100 µL van de dia van een kanaal en 3D time-lapse beeld via een 60 X / 1,49 olie onderdompeling (of soortgelijke) objectief uitgevoerd met behulp van de 488 nm en 561 nm laserlijnen , respectievelijk van een draaiende schijf confocal (of soortgelijke) Microscoop. Het is verleidelijk om het systeem voor hoge resolutie beeldvorming, maar de overname van herhaalde Z-stacks meer dan 16 min te optimaliseren of zo kan leiden tot aanzienlijke photobleaching en fototoxiciteit. We kozen te gebruiken van 2 x 2 weggooien om te bevorderen van goede signal-to-noise ratio's en kortingen in excitatie-intensiteit en/of blootstelling tijden, maar ten koste van de optische resolutie. Bovendien, verklein fototoxiciteit en voegen we een straatveger van reactieve zuurstof soorten aan het medium. In toekomstige studies, kunnen de tests worden gewijzigd naar image de fagocytose van apoptotic menselijke rode bloedcellen. Toepassing van een Ca2 + ionophore, zoals A23187, kan worden gebruikt voor het opwekken van fosfatidylserine externalization23, een "eat me" signaal en kenmerk van vroege apoptosis24,25.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de subsidies HA 3271/4-1 en HA 3271/4-2 van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), en de subsidie FF-2016-05 van UITM 1003 (Cluster van Excellence 1003), cellen in beweging (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
