Summary
Her beskriver vi metoder ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi billede enkelt fagocyterende arrangementer af mus bosiddende peritoneal makrofager. Protokollerne kan udvides til at omfatte andre fagocyterende celler.
Abstract
Fagocytose spiller en nøglerolle i vært forsvar, samt væv udvikling og vedligeholdelse, og indebærer hurtige, receptor-medieret rearrangementer af actin cytoskelettet til fange, indhylle og opsluge store partikler. Selv om fagocyterende receptorer, downstream signaling veje og effektorer, såsom Rho GTPases, er blevet identificeret, den dynamiske cytoskeletal remodellering af specifikke receptor-medieret fagocyterende begivenheder er uklare. Fire årtier siden, to forskellige mekanismer af fagocytose, eksemplificeret ved Fcγ receptor (FcγR)- og supplere receptor (CR) - medieret fagocytose, blev identificeret ved hjælp af scanning Elektron Mikroskopi. Binding af immunoglobulin G (IgG)-opsonized partikler til FcγRs udløser fremspring i tynd membran extensions, som først danner en såkaldt fagocyterende cup omkring partiklen før det bliver helt lukket og trukket ind i cellen. Derimod synes supplerer opsonized partikler at synke ned i den phagocyt efter bindende at supplere receptorer. Disse to tilstande af fagocytose, fagocyterende cup dannelse og synker i, er blevet veletableret i litteraturen. Imidlertid har forskellene mellem de to tilstande udviskes af rapporter at supplere receptor-medieret fagocytose kan fremkalde forskellige membran fremspring. Med tilgængeligheden af høj opløsning imaging teknikker, fagocytose assays er påkrævet at tillade real-time 3D (tre-dimensionelle) visualisering af hvordan specifikke fagocyterende receptorer mægle optagelsen af enkelte partikler. Mere anvendt almindeligt tilgange til studiet af fagocytose, som end-point assays, glip af muligheden for at forstå hvad der sker på grænsefladen af partikler og fagocytter. Her beskriver vi fagocyterende assays, bruge time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi, der giver mulighed for 3D imaging af enkelt fagocyterende begivenheder. Derudover beskriver vi assays utvetydigt billede Fcγ receptor - eller supplere receptor-medieret fagocytose.
Introduction
Tyve år før Metchnikoff's observation af fagocyterende udkom celler i søstjerner larver, i 1882, og efterfølgende udvikling af sin teori om fagocytose1, beskrevet Ernest Haeckel, i 1862, engulfment af uopløselige farvestof partikler af blod celler af Thetis fimbris (Tethys fimbria), en art af aggressiv havet skovsnegl (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Han beskrevet udtrykkeligt membran fremspring omsluttende partikler, som efterfølgende blev taget i cytoplasmaet og akkumuleret omkring cellekernen. Mere end 100 år senere, foreslog en banebrydende undersøgelse af Kaplan, at der var mindst to morfologisk forskellige mekanismer af fagocytose2. Kaplan viste ved scanning elektronmikroskopi at peritoneal musen makrofager indtages en IgG-opsonized får røde blodlegemer ved hjælp af tynd membran extensions, som nåede op og tæt indhyllet partiklen, i første omgang gav anledning til en kop-lignende struktur. Fagocyterende cup dannelse kræves actin polymerisering, da det blev ophævet af celle-gennemtrængelige svampe toksin cytochalasin B, kendt for at blokere actin dynamics3. Derimod syntes får røde blodlegemer opsonized med supplement at synke direkte i makrofag uden generations membranen udvidelser, selvom i nogle billeder, membran flæser kan ses i den umiddelbare nærheden af de synkende partikler. I modsætning til fagocyterende cup dannelse var supplere receptor-medieret synker insenstive til cytochalasin B behandling2. I eksperimenter beskrevet af Kaplan, supplement hjælp blev udført ved at inkubere immunoglobulin M (IgM) mærket får røde blodlegemer med serum fra supplement C5-mangelfuld mus, der omgår hæmolyse af supplement C5-afhængige terminal supplere komplekse.
De to tilstande af fagocytose, fagocyterende cup dannelse og synker i, identificeret ved Kaplan er blevet etableret udtalelse i felt4,5,6,7,8,9 . Men ultra-høj opløsning billeder brugt i den oprindelige undersøgelse af Kaplan2, samt en lignende undersøgelse af Munthe-Kaas et al. 10, kun give snapshots af fagocyterende begivenheder. I en nylig gennemgang, Rougerie et al. 11 understregede at morfologiske forskelle mellem FcγR - og CR-medieret fagocytose forblive at være afklaret, og derudover membran flæser er blevet observeret under supplere receptor-medieret partikel optagelse2. Live-celle billeddannelse af enkelt fagocyterende arrangementer der strækker sig fra partikel capture til internalisering, kombineret med genetisk modificerede musemodeller, kunne i høj grad forbedre vores forståelse af hvordan fagocytter fange og indtage partikler. En metode kunne være at bruge hurtigt atomic force mikroskopi (AFM) som giver ultra-høj opløsning (10-20 nm) topografiske billeddannelse af levende celler. For nylig er blevet udviklet en hurtig AFM system12 , som er egnet til billedbehandling celle overflader hurtigt med lav støj. Denne teknik har fordelen, at høj opløsning, topografiske og mekaniske parametre af levende celler kan måles med korte intervaller (sekunder), i modsætning til scanning elektronmikroskopi, hvilket nødvendiggør fiksering og kritiske punkt tørring af celler. En anden fremgangsmåde er time-lapse 3D Konfokal mikroskopi, som er alment tilgængelige, selvom fototoksicitet og blegning er begrænsende faktorer under optagelser. Denne tilgang er meget alsidigt og giver optisk skæring med stor rumlig opløsning og giver mulighed for ekstraordinære fleksibilitet i mærkning med en svimlende udvalg af fluorescerende sonder, herunder genetisk kodet fluorescerende proteiner. Her beskriver vi fagocytose assays bruge time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi, der giver mulighed for høj spatiotemporelle opløsning af bestemt receptor-medieret fagocyterende begivenheder.
Protocol
Protokollerne følge retningslinjerne i vores lokale menneskelige videnskabsetisk Komité, samt retningslinjerne for pasning af dyr.
1. isolering af hjemmehørende mus Peritoneal makrofager
- Ofre mus (3-4 måneders alderen (begge køn); f.eks. C57BL/6 stamme) ved hjælp af en overdosis af de flygtige bedøvelsesmiddel isofluran (> 5% i luft) eller CO2-13, efterfulgt af cervikal dislokation. Induktion af anæstesi kan vurderes let, ved tab af oprettende refleks14samt tab af pote tilbagetrækning refleks.
- Efter rengøring maven af mus med 80% ethanol i vand, gør en midterlinjen hud indsnit og afsløre de underliggende bugvæggen.
- Placer en 24-G plast kateter ind i peritonium og lavage hulrum med 2 x 4,5 mL iskold Hank salt bufferopløsning (HBSS), uden Ca2 + og Mg2 +via et 5 mL plastik sprøjte. Mens indsprøjtning, forlader omkring 0,5 mL resterende HBSS (5-4,5 mL (injiceres) = 0,5 mL) i sprøjten i tilfælde væv er suget ind i spidsen af kateteret og har brug at blive udvist. Overføre indsugning suspension i en 14 mL polypropylen runde-nederste rør og centrifugeres ved 300 x g i 6,5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Spidsen af plast kateteret er stump, som sammenlignet med en nål, minimerer skaden til abdominal indholdet. Typisk følgende blid abdominal massage, 8 mL peritoneal cellesuspension kan hentes fra bughulen. - Supernatanten og resuspend peritoneal cellerne i 1 mL bikarbonat-fri RPMI 1640 medium indeholdende 20 mM Hepes, 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum og antibiotika såsom penicillin (100 enheder/mL) og streptomycin (100 µg/mL), udarbejdet af fortynding 100 x penicillin/streptomycin 1: 100. Dette giver typisk en koncentration på ca 6 x 106 celler/mL.
Bemærk: Omkring 30% af isolerede peritoneal celler er makrofager, hvorimod de andre (mindre) celler er lymfocytter, overvejende B-celler.
2. såning af Peritoneal celler i kanal dias
-
Efter pipettering cellesuspension op og ned for at reducere sammenklumpning, afpipetteres 100 µL suspension i forudfyldte kanalen (volumen, 100 µL) af et dias, fibronektin-belagt kanal (en 100 µL kanal har dimensioner (længde x bredde x højde): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Prefill kammeret ved at tilføje 1 mL serum-suppleret RPMI 1640 (Hepes) medium til en af de to reservoirer for kanal dias, vippe diaset og derefter sugning medium fra downstream reservoiret (figur 1).
- Fjerne uønskede luftbobler, eller lange strimler af luft, i kanalen ved at tilføje 1-2 mL medium til en af de to reservoirer, stramt anvender et reservoir cap og derefter udpumpning luft gennem rytmiske tommelfinger pres på fælles landbrugspolitik og, om nødvendigt vippe diaset. Efter udvisning luft, tilt dias med den reducerede reservoir (og som indeholder medium) nedadgående før du fjerner fælles landbrugspolitik for at undgå luft bliver suget ind i kanalen.
- Prefill kammeret ved at tilføje 1 mL serum-suppleret RPMI 1640 (Hepes) medium til en af de to reservoirer for kanal dias, vippe diaset og derefter sugning medium fra downstream reservoiret (figur 1).
- Inkuber kanal dias, seedet med celler, i et fugtigt kammer i 2 timer ved 37 ° C i mangel af CO2 (CO2 kræves ikke siden HCO3-/CO2 buffersystem er erstattet af Hepes). Kanal dias kan bekvemt placeret på et rack, der holder otte dias. Typisk er 6-8 dias tilberedt af en mus, selv om op til 10 eller mere er muligt.
-
Fjerne rack og udveksle RPMI 1640 (Hepes) medium i hvert lysbillede i RPMI 1640 medium indeholdende bikarbonat, suppleret med 10% føtal bovint serum som penicillin/streptomycin.
- Tilt dias og Opsug medium først fra den nederste reservoir og derefter fra det øverste vandreservoir. Dernæst tilsættes 1 mL af det nye medie til en af reservoirerne, tilt dias og aspirat medium fra downstream reservoiret, efter det er strømmet gennem kanalen.
- Efter denne vask (medium exchange) trin, fylde kanal dias ved at tilføje 1 mL medium til en af reservoirer.
Bemærk: Vaske trin ved hjælp af kanal dias er meget enkel og effektiv løsning exchange og fjerne ikke-tilhænger celler. Bemærk at RPMI 1640 (bikarbonat) medium er normalt præ rugede med 5% CO2 natten til sikre termisk og pH balance.
- Inkuber celler natten over ved 37 ° C i en fugtig kuvøse med 5% CO2. Udføre eksperimenter på den følgende dag.
3. isolering af menneskets røde blodlegemer
- På dag 2 (anden dag af eksperimenter; efter natten inkubation af de isolerede peritoneal makrofager), indsamle 1-2 mL perifert veneblod fra raske donorer, ind i et heparinized rør. Der overføres 1 mL til en rund bund 2,0 mL (polypropylen) microcentrifuge tube, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 18 ° C (empirisk indstilling), og Fjern supernatanten (plasma og buffy coat).
- Forsigtigt Aspirér 100 µL af de aflejret røde blodlegemer og bland dette bind 1:1 med modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium (beskrevet nedenfor) i en rund bund 2,0 mL microcentrifuge tube. Label røret "1:1".
Bemærk: RPMI 1640 (Hepes) medium anvendes på dag 2 (for assays) efter isolere celler indeholder, ud over 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum, penicillin (100 enheder/mL), streptomycin (100 µg/mL) og 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glycine (for at mindske fototoksicitet). Dette medie er benævnt "modificerede" RPMI 1640 (Hepes) medium. - Med pipette overfoeres 4 µL af 1:1 fortyndede røde blod cellesuspension til 2 mL modificeret RPMI 1640 (Hepes) medium, pre pipetted ind i en 2,0 mL microcentrifuge rør (Gentag dette trin, dvs forberede 2 rør). Label hver tube "4: 2000". Placer "1:1" og "4: 2000" rør på is.
4. mærkning af makrofag Plasma membran
- Fjern seedede kanal dias fra CO2 inkubator og udveksle RPMI 1640 (bikarbonat) medium i hvert dias for modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium. Placer cellerne i et fugtigt kammer ved 37 ° C i mangel af CO2.
Bemærk: Efter natten inkubation og vask, de fleste af lymfocytter er fjernet fra kanalen. Fleste af de resterende vedhængende celler er makrofager, der kan identificeres morfologisk eller ved immunfluorescens farvning ved hjælp af anti-F4/80 antistof. Omkring er 95% af musen bosiddende peritoneal makrofager F4/80 positiv. - Fortyndes fluorescently grønne mærket anti-mus F4/80 antistof (opbevares ved 4 ° C) 1:40 i modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium. Tage et dias og vippe det pipetteres (dråbevis) 100 µL antistof blandingen i åbningen af 100 µL kanal af diaset (Se figur 1). Aspirat medium, der flyder i downstream reservoiret. Inkuber celler i 20 min. ved 37 ° C (fugtig miljø, uden CO2). Under inkubationstiden, mærke de menneskelige røde blodlegemer (Se afsnit 5).
Bemærk: Som omtalt ovenfor, CO2 kræves ikke siden HCO3-/CO2 buffersystem er erstattet af Hepes. - Efter 20 min Inkubationstiden (hvor menneskets røde blodlegemer er plettet og opsonized), vask diasset ved tilsætning af 1 mL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium til en af reservoirerne og sugning medium, efter det er strømmet gennem kanalen, lettes ved vippe diaset. Tilføj 1 mL medium for kortvarig oplagring eller videre til et eksperiment (dvs., når der afpipetteres i partikler (opsonized røde blodlegemer) og imaging fagocytose af time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi).
5. mærkning plasmamembran i humane røde blodlegemer
- Begynd mærkning af menneskets røde blodlegemer umiddelbart efter inkubation et dias af makrofager med grønne fluorescently mærket anti-F4/80 antistof (efter afsnit 4.2). Efter blide blanding, tage 400 µL fra en af de "4: 2000" rør (Se afsnit 3.3) og undvære det ind i en (rund bund) 2,0 mL microcentrifuge rør. Give tid til suspension til varme til omkring 37 ° C (Se afsnit nedenfor). Tilføje 0,4 µL orange/rødt fluorescerende plasmamembran pletten (delprøver opbevares ved-20 ° C), blandes og inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
Bemærk: En opvarmet aluminium blok, placeret inde i laminar flow hætten, er nyttig for at minimere varmetab samtidig med at forberede dias. Rør kan placeres i bore brønde af varme blok og en separat eller integreret, opvarmet aluminiumsplade kan tjene som en arbejdsplads. - Efter inkubationstid 5 min forberede den første vask skridt ved at tilføje 1600 µL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium (for at fylde 2,0 mL microcentrifuge tube).
- Der centrifugeres rør ved 300 x g i 5 minutter ved 18 ° C (empirisk indstilling). En kompakt røde pellet skal være synlig på væggen (dvs. off center) i bunden af røret. Rotere røret, så at pellet opad, og fjern forsigtigt alle supernatant successivt (i to etaper), som ved hjælp af en 1-1,5 mL pipette tip.
- Efter sugning supernatanten, tilføje 2.000 µL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium, blanding (for at resuspend celler), og Gentag ovenstående centrifugering og supernatanten aspiration trin.
- Resuspenderes (af plasma membran plettet og 2 x vasket røde blodlegemer) med 400 µL af modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium. Label tube PMS (forkortelse for plasma membran plet).
Bemærk: Alternativt succinimidyl ester af en pH-følsom rodamin derivat, der bliver mere stærkt fluorescerende på sure pH-værdi, kan bruges til at mærke menneskelig røde blodlegemer. I dette tilfælde fungerer fluorescens-intensiteten desuden som en foranstaltning af phagosome modning efter partikler har været internaliseret.
6. opsonization (mærkning) af menneskets røde blodlegemer med musen Immunoglobulin G (IgG)
- Tilføj 1 µL mus (IgG2b) monoklonale (klon HIR2)-anti-humant CD235a (1 mg/mL) antistof (opbevares ved-20 ° C) til røret mærket PMS (Se afsnit 5.2-5.5), der indeholder plasma membran farves menneskets røde blodlegemer suspenderet i 400 µL medium. CD235a (også kendt som glycophorin A) er en erythroid slægt-specifikke membran sialoglycoprotein.
-
Der inkuberes ved 37 ° C i 8 min. Bemærk at hjælp af menneskets røde blodlegemer med IgG forårsager agglutination (celle sammenklumpning). Selv om agglutination kan fungere som en visuel indikator for hjælp, er det uønskede for billeddannelse af enkelt fagocyterende effekter. At omgå agglutination, gentagne gange Bland cellesuspension (hver 1 min) bruger, for eksempel, en variabel 20 – 200 µL volumen pipette indstillet til 200 µL.
- I slutningen af inkubationstiden 8 min, hvis ønsket, vask makrofag dias, inkuberes med grøn fluorescently mærket anti-F4/80 antistof, med 1 mL modificeret RPMI 1640 (Hepes) medium. Sikre at begge reservoirer for kanal dias er fri for medium efter vask trin.
7. imaging fagocytose af Plasma membran farves og IgG-belagt menneskets røde blodlegemer
- Efter 8 min inkubation med anti-CD235a antistof (afsnit 6.2), afpipetteres 100 µL suspension plasma membran-farvede og IgG-opsonized menneskelige rød blod celler til et dias, der indeholder makrofager mærket med grøn fluorescerende anti-F4-kanal / 80 antistof (trin 4). Rødt fluorescerende, IgG-opsonized menneskets røde blodlegemer er således tilføjes grøn fluorescerende fagocytter (makrofager).
- Så snart menneskelige rød blod celler er blevet tilføjet, montere kanal dias på en roterende disk Konfokal mikroskop (med fase inkubator sat til 37 ° C) til billedbehandling, for eksempel via en 60 X / 1,49 oliebestan mål linse. Starte imaging hurtigst muligt da partikler begynde at bosætte sig i 1 min.
Bemærk: Brug af fluorescerende perler med en diameter på 100 nm, vi målte, ved analyse af punkt spredes funktioner, XY resolutioner af x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm laser) og x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm laser). Men for at reducere photobleaching og fototoksicitet under time-lapse 3D imaging af levende celler, vi på kompromis rumlige opløsning ved hjælp af 2 x 2 binning. Binning øger følsomheden (forbedrer signal-støj-forhold) og den tilladte billedhastighed, men på bekostning af rumlige opløsning. - Bruge en perfekt fokus (eller lignende) system til at forhindre fokus drift under optagelser. Efter aktivering perfekt fokus system, skal du bruge kontrolelementet offset at fokusere på makrofag lamellipodial fremspring umiddelbart over coverslip (se note nedenfor) af diasset kanal. Dette fokus niveau svarer til Z = 0 µm. Hent Z-stakke fra-1 µm til + 16 µm på 0,8 µm-trin, som beløber sig til 22 Z-skiver. Z-stakke kan, for eksempel, fås med en hastighed på 1 stack (for hver kanal) hver 15 s for i alt 16 min.
Bemærk: Længere optagelse perioder lider tab af billedkvalitet, hovedsagelig på grund af photobleaching. Z-stakke er erhvervet for hver af de to kanaler: makrofager er afbildet ved hjælp af en 488 nm laser (grøn kanal) og menneskelige rød blod celler er afbildet ved hjælp af en 561 nm laser (røde kanal). Brug denne fremgangsmåde, forskellige visninger af makrofager indtagelse IgG-opsonized menneskelige rød blod celler på forskellige timepoints kan opnås (for eksempel, se figur 2).
Bemærk: Typisk indstillingerne for systemet (med 2 x 2 binning),: grøn kanal (20,5% laser (50 mW, 488 nm) magt, 101 følsomhed (range, 0 – 255) og 200 ms eksponeringstid); røde kanal (10,5% laser (50 mW; 561 nm) magt, 101 følsomhed (range, 0-255) og 98 ms eksponeringstid).
Bemærk: I bunden af diasset kanal er en polymer med samme tykkelse som en #1.5 glas coverslip og de samme optiske egenskaber af glas, men navnlig materialet har fordelen ved gas permeabilitet.
8. imaging fagocytose af Plasma membran farves og supplement-belagt menneskets røde blodlegemer
- Supplement-opsonize plasmamembran farves og IgG-opsonized rød blod celler på samme måde til afsnit 5 og 6, undtagen, i stedet for pipettering 4 µL af 1:1 fortyndede røde blodlegemer suspension til 2 mL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium, som beskrevet i afsnit 3.3, der afpipetteres 4 µL i 1 mL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium, og tilsvarende etiket tube 4:1, 000. Således, de menneskelige rød blod celler er 2 x mere koncentreret.
- Fortsæt med trin i afsnit 4 og 5, men starter ud med 4:1,000 snarere end 4:2,000 fortyndes bestanden af menneskets røde blodlegemer (4:1, 000 og 4:2,000 henviser til de efterfølgende fortyndinger af de oprindeligt 1:1 fortyndede menneskets røde blodlegemer beskrevet i afsnit 3.1 og 3.2).
- Ofre en C5 null mus (fx B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson laboratorium) ved (> 5% i luften) isofluran inhalation efterfulgt af halshugning og indsamle blod. Vi dryppe normalt ca. 0,8 mL blod ind i en rund bund 14 mL plastik rør umiddelbart efter isofluran indånding og halshugning.
- Efter 1 time, når blodet er fuldt koagulerede, overføres den resterende væske til en 2,0 mL microcentrifuge rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur. Efterfølgende, omhyggeligt indsamle den gullige serum. Typisk, vi genvinde mindst 200 µL C5 null serum. Sted C5 null serum på is.
- Efter 4 min inkubation af plasma membran farves menneskets røde blodlegemer med IgG, tilføje en anden 1 µL af anti-CD235a antistof (at give 2 x koncentreret), og derefter tage 50 µL af cellesuspension og bland det i en separat 2,0 mL microcentrifuge rør indeholdende 50 µL C5 null serum. Fortsæt med at blande flere gange (hver 1 min) af pipettering op og ned, som i punkt 6.2, til en anden 4 min. Således, efter dette trin, de menneskelige røde blodlegemer har været inkuberet med anti-CD235a antistof til et samlet beløb på 8 min.
Bemærk: 4 min inkubationstiden med C5 null serum er tilstrækkelig til at aktivere den klassiske supplement kaskade og opsonize i humane røde blodlegemer med C3b, som er kløvet af faktor jeg til iC3b.
9. bekræftelse af IgG - og C3b-hjælp af menneskets røde blodlegemer
-
Bekræft hjælp af menneskets røde blodlegemer med muse-antistof, IgG (IgG2b; Se afsnit 6.1) anti-CD235a ved inkubering af celler med ged anti-mus (sekundære) IgG antistof konjugeret med et grønt eller rødt fluorescerende fluorophore.
- Tilføje 1 µL musen anti-CD235a IgG antistof og 1 µL fluorescently mærket anti-mus sekundær antistof til et 400 µL suspension af menneskets røde blodlegemer, og der inkuberes ved 37 ° C i 8 min. Efterfølgende vaskes to gange (som i afsnit 5.2-5.5).
- Resuspend celle pellet med 400 µL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium og afpipetteres 100 µL af suspension i en kanal slide (Se figur 1 c) for Konfokal fluorescens billeddannelse.
Bemærk: Cellerne vil klump (agglutinere) efter vask og resuspension, men vask er nødvendigt at reducere baggrund fluorescens på grund af ubundne sekundær antistof.
-
Bekræfte hjælp af menneskets røde blodlegemer, forud mærket med musen IgG og inkuberes med C5 null mus serum, med C3b/iC3b bruger, for eksempel, rotte anti-mus C3b/iC3b/C3c antistof og en sekundær antistof, for eksempel ged anti-rotte IgG-antistof konjugeret til en grøn fluorescerende fluorophore.
- Gentag trinnene i afsnit 8 med unstained menneskelige røde blodlegemer.
- Tilføje 0,25 µL fluorescently mærket anti-mus C3b/iC3b/C3c antistof til 100 µL blandingen (50 µL IgG-mærket menneskets røde blodlegemer + 50 µL C5 null mus serum) og inkuberes ved 37 ° C i 8 min.
- Vaskes to gange, resuspenderes i 100 µL modificerede RPMI 1640 (Hepes) medium og pipette suspension i en kanal slide (se figur 1 c) for Konfokal fluorescens billeddannelse.
Representative Results
Et skematisk diagram over kanal diaset bruges til billeddannelse af fagocytose af time-lapse spinning Konfokal mikroskopi er vist i figur 1. Menneskets røde blodlegemer (hRBCs) farves med rødt fluorescerende plasmamembran markør CellMask Orange, hvorimod isolerede mus bosiddende peritoneal makrofager (Ms) er mærket med grønne fluorescerende Alexa Fluor 488-konjugerede anti-F4/80 antistof ( Figur 2), som fungerer både som en specifik markør for musen makrofager og som plasma membran etiket. Menneskets røde blodlegemer kan være opsonized med musen IgG (mIgG), eller mus IgM (mIgM), ved at inkubere celler med IgG (eller IgM) anti-CD235a antistof (CD235a, også kendt som glycophorin A, er et protein, specielt udtrykt på menneskets røde blodlegemer). Time-lapse 3D imaging af grøn fluorescerende makrofager præsenteret med rødt fluorescerende menneskelige rød blod celler giver mulighed for visualisering af enkelt partikel fagocyterende begivenheder (figur 2). Tæt observation af enkelt fagocyterende begivenheder giver oplysninger om partikel opsamling og indtagelse at være afgrænset. For eksempel, kan fange af en mIgG-opsonized menneskets røde blodlegemer af en makrofag filopodium, en tynd, finger-lignende projektion, observeres (figur 3A; Se også Horsthemke et al. 15). Derudover klemme et menneskets røde blodlegemer under fagocyterende cup dannelse kan observeres (figur 3A). Efter indførelsen af friske mus serum, mIgG-opsonized, eller mIgM-opsonized, menneskets røde blodlegemer udløse den klassiske supplement kaskade, der kulminerer i dannelsen af en hæmolytisk membran angreb kompleks. Kinetik af komplement-medieret hæmolyse kan måles ved imaging celler dual-farves med CellMask Orange og Calcein. Grøn fluorescerende cytosole Calcein frigives hurtigt fra celler under hæmolyse (figur 3B).
Figur 1: håndtering af fibronektin-belagt kanal dias. (A) A kanal dias består af to bassiner forbundet med en kanal med dimensioner 50 mm x 5 mm 0,4 mm. kanal dias er i første omgang udfyldes på forhånd ved at anvende 1-2 mL medium til en af de to reservoirer og vippe diaset. (B) Caps kan placeres på reservoirer før inkubation. Lågene kan anvendes praktisk til at pumpe ud uønskede luftbobler før såning kanal med celler. (C) luft boble-fri 100 µL kanal kan udfyldes direkte når der afpipetteres medium i mundingen af en kanal. Dette trin bruges f.eks til frø makrofager i et dias eller til at tilføje gfluorophore (grøn fluorescerende)-konjugerede anti-F4/80 antistof, der tjener som en membran etiket, samt en mus makrofag markør. (D) efter pipettering partikler, såsom opsonized menneskets røde blodlegemer, i en kanal seedede med fluorescently farves makrofager, diaset kan placeres på scenen i en inverteret mikroskop og time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi kan være udført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Time-lapse 3D imaging af fagocytose. (A) skematisk diagram viser hjælp af plasma membran farvede (røde fluorescerende) menneskets røde blodlegemer (hRBCs) med musen (m) anti-CD235a immunoglobulin G (mIgG) antistof og præsentation af mærket hRBCs til musen makrofager (Ms), mærket (grøn fluorescerende) med grøn fluorescerende fluorophore-konjugerede anti-F4/80 antistof. (B) Time-lapse billeder (XZ visninger), fås ved at dreje disken Konfokal mikroskopi, viser fagocyterende cup dannelse og indtagelse af mIgG-opsonized hRBCs. Skalalinjen = 10 µm. (C) 3D rekonstruktioner viser makrofager indtagelse mIgG-opsonized hRBCs. Tilsvarende XZ visninger (for 3 af timepoints) er vist i B. gitter afstande repræsenterer 5.07 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fange af en partikel af en filopodium. Time-lapse billeder, opnået ved at dreje disken Konfokal mikroskopi, viser en mus makrofag fanger en mus immunoglobulin G (mIgG)-opsonized menneskets røde blodlegemer (hRBC) via en filopodium (pile i øverste panel), en finger-lignende projektion. Bemærk at rød blod cellen mister sin crenations tidligt under fagocyterende cup dannelse. Desuden, den fagocyterende cup synes at klemme den indhyllede røde blodlegemer (angivet med pile i nederste panel). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Langt størstedelen af fagocytose assays, især end-point og høj overførselshastighed assays, giver ikke visualisering af hvordan partikler faktisk fanget, indhyllede og indtages. Banebrydende undersøgelser af Munthe-Kaas et al. 10 og Kaplan2 i 1970 ' erne foreslog at påfaldende forskellige cytoskeletal reorganisering blev involveret i fagocytose af IgG-opsonized kontra komplement-opsonized partikler (får røde blodlegemer). Her beskriver vi fagocytose assays ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi, som giver mulighed for høj opløsning, real-time imaging af enkelt fagocyterende begivenheder. Vores model phagocyt er den mus bosiddende peritoneal makrofager, der kan isoleres med minimal håndtering, og vi bruger frisk isolerede humane røde blodlegemer som partikler. Dog kunne fagocytose assays anvendes på andre fagocytter, såsom mus knoglemarv-afledte makrofager eller neutrofiler, musen makrofager cellelinjer, humane monocyt-afledte makrofager eller humant perifert blod neutrofiler. Menneskelige fagocytter eller mus neutrofiler, ville alternativ fluorescently mærket antistoffer være påkrævet, såsom fluorescently mærket anti-CD14 antistoffer (humane monocytter/makrofager)16 eller anti-Gr-1 (Ly - 6 G) antistoffer (mus neutrofiler).
Unopsonized menneskelige rød blod celler, som traditionelt anvendes får røde blodlegemer, er inaktiv i den forstand, at disse celler er ikke (eller, i det mindste, meget sjældent) indtages af musen peritoneal makrofager. Dette sikrer i modsætning til polystyren perler, lav baggrund aktivitet. Menneskets røde blodlegemer kan være bekvemt opsonized med immunoglobuliner ved hjælp af musen IgG eller IgM monoklonalt antistof mod CD235a (glycophorin A), en specifik markør for menneskelige erytrocytter (røde blodlegemer) og erythroid prækursorer17, 18. i parallelle assays, fluorescently mærket anti-mus IgG eller IgM sekundære antistoffer kan anvendes til at bekræfte opsonization. IgG og IgM-antistof klasser er hemagglutinins, stoffer (antistoffer), der forårsager røde blodlegemer til at agglutinere. For at undgå agglutination, vi Bland periodisk cellesuspension inkubation i perioden 8 min med anti-CD235a antistof, og så tilføjer vi blandet suspension direkte til en makrofag-holdige kanal dias (fibronektin-belagt slide) uden en vask trin . Vask skridt involverer sedimentation af røde blodlegemer ved centrifugering, som kraftigt fremmer agglutination. Før opsonizing menneskets røde blodlegemer, mærker vi plasma membran med en lipofile orange/rødt fluorescerende sonde. Denne sonde er smukt fluorescerende i begyndelsen af time-lapse optagelser, men signalet forsvinder gradvist, sandsynligvis i vid udstrækning photobleaching19. Derudover kan makrofager og fibronektin belægning af diaset blive svagt orange/rødt fluorescerende under optagelser. Dette problem er formentlig på grund af utilstrækkelig vask af menneskets røde blodlegemer efter mærkning. Istedet for benytter en lipofile fluorescerende plasmamembran markør, kan menneskets røde blodlegemer mærkes med et pH-følsom rodamin derivat ved hjælp af dens Amin reaktive succinimidyl ester15,20. Dette har fordelen, at visualisering af phagosome modning, da fluorescens intensiteten stiger med faldende pH15,20, men denne fremgangsmåde har den ulempe, at reaktive ester præparater er i øjeblikket dyrt og ustabile efter rekonstituering i vandigt medium.
IgG-opsonized menneskets røde blodlegemer indtages via FcγRs, som kan bekræftes ved hjælp af peritoneal makrofager isoleret fra NOTAM21 eller Fcer1g- / - (Fcer1g knockout) mus. NOTAM makrofager binde IgG-opsonized menneskets røde blodlegemer, men mangler ITAM (immunoreceptor tyrosin-baseret aktivering motiv) - medieret signalering kræves for at fremkalde fagocytose, hvorimod Fcer1g knockout makrofager ikke udtryk overflade FcγRs. IgG - eller IgM-opsonized menneskets røde blodlegemer kan desuden opsonized med C3b (som er kløvet til iC3b) ved at inkubere celler med frisk isolerede serum fra et supplement C5 null mus (vildtype serum forårsager hæmolyse). Opsonins IgG og IgM aktivere den klassiske supplement kaskade, der fører til dannelsen af porer (membran angreb komplekser) og celle lysering. I mus mangler supplement C5, supplement cascade provenuet til at supplere C3 kavalergang, men C5 convertase mangler substratet skal katalysere den terminal pathway. Vi udviklet enkle assays for at måle kinetik af supplement kaskade. Kort sagt, kan menneskets røde blodlegemer være co mærket med en fluorescerende rød, plasma membran markør og den grønne fluorescerende, cytosole fluorophore. Ved stiftelse af membran angreb komplekse, dannet af supplement komponenter C5-C9, det cytosole fluorophore er hurtigt (i sekunder) tabt fra cytosol. Visualisering af ende-effektor (cytolysis) funktion af supplement kaskade angivet, 4 min Inkubationstiden er tilstrækkelig for C3b/iC3b hjælp af menneskets røde blodlegemer. I parallel assays, kan C3b/iC3b belægning af menneskets røde blodlegemer nemt vurderes efter anvender en blanding af anti-mus C3b og fluorescently mærket sekundære antistoffer. I dette tilfælde er en vask skridt forpligtet til at fjerne ubundne fluorescerende antistoffer. Selv om wash skridt indebærer celle sedimentaion ved centrifugering, som fremmer agglutination, kan vellykket hjælp vurderes let ved Konfokal mikroskopi. Supplere receptor-medieret fagocytose kan være afbildet af enten anvende IgG- / iC3b-opsonized rød blod celler til NOTAM eller Fcer1g- / - makrofager eller ved at indføre IgM- / iC3b-opsonized rød blod celler til vildtype makrofager. IgM-opsonized blod celler genkendes ikke af den ITAM-holdige FcγRs (FcγRI, FcγRIII og FcγRIV) kræves til fagocytose af IgG-opsonized partikler22.
For at billede fagocyterende kan begivenheder, plasma membran af makrofager være mærket med grøn fluorescerende fluorophore konjugerede anti-F4/80 antistof, der også fungerer som en specifik markør for musen makrofager. Menneskets røde blodlegemer kan gengives rødt fluorescerende ved inkubering med en orange/rød fluorescerende plasmamembran markør, som beskrevet ovenfor. Denne lipofile plasmamembran markør undgår potentielle forstyrrende virkninger af antistof-baserede etiketter. Rødt fluorescerende menneskets røde blodlegemer, med eller uden hjælp, kan være direkte pipetted i 100 µL kanal af en kanal dias og 3D time-lapse afbildet via en 60 X / 1,49 olie nedsænkning (eller lignende) mål linse udføres ved hjælp af 488 nm og 561 nm laser linjer , henholdsvis, af en roterende disk Konfokal (eller lignende) mikroskop. Det er fristende at optimere systemet for høj opløsning imaging, men erhvervelse af gentagne Z-stakke over 16 min eller så kan forårsage betydelige photobleaching og fototoksicitet. Vi valgte at bruge 2 x 2 binning for at fremme god signal-støj-forhold og give reduktioner i excitation intensitet og/eller eksponering gange, men på bekostning af optisk opløsning. Derudover for at reducere fototoksicitet, tilføje vi en ådselsæder af reaktive ilt arter til medium. I fremtidige undersøgelser, kunne assays ændres for at billede fagocytose af apoptotiske menneskets røde blodlegemer. Anvendelse af en Ca2 + ionophor, såsom A23187, kan bruges til at fremkalde phosphatidylserin udlægning23, en "Spis mig" signal og kendetegnende for tidlige apoptose24,25.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud HA 3271/4-1 og HA 3271/4-2 fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), og grant FF-2016-05 fra EXC 1003 (klynge Excellence 1003), celler i bevægelse (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
