Summary
Här beskriver vi metoder med snurrande bricka konfokalmikroskopi bild enda fagocytos händelser av mus bosatt peritoneal makrofager. Protokoll som kan utökas till andra Fagocytos celler.
Abstract
Fagocytos spelar en nyckelroll i värd försvar samt i vävnad utveckling och underhåll, och innebär snabb, receptormedierad rearrangements av aktin cytoskelettet att fånga, omsluta och uppsluka stora partiklar. Även om fagocytos receptorer, nedströms signalvägar och effektorer, såsom Rho GTPases, har identifierats, dynamisk cytoskeletal ombyggnaden av specifika receptormedierad fagocytos händelser förblir oklart. Fyra decennier sedan, två distinkta verkningsmekanismer fagocytos, exemplifierat av Fcγ-receptorn (FcγR)- och komplettera receptor (CR) - medierad fagocytos, identifierades med hjälp av scanning electron microscopy. Bindningen av immunglobulin G (IgG)-opsonized partiklar till FcγRs utlöser den utskjutande delen av tunt membran förlängningar, som initialt bildar en så kallad fagocytos kopp runt partikeln innan det blir helt sluten och tillbakadragen i cellen. Däremot verkar komplement opsonized partiklar sjunka ner i den fagocytsystemet efter bindande att komplettera receptorer. Dessa två lägen av fagocytos, fagocytos cup bildandet och sjunker i, har blivit väl etablerade i litteraturen. Skillnaderna mellan de två lägena har dock bli suddig av rapporter som komplement-medierad fagocytos kan framkalla olika membran utskjutande delar. Med tillgängligheten av hög upplösning imaging tekniker, fagocytos analyser krävs att tillåta realtid 3D (tredimensionell) visualisering av hur specifika fagocytos receptorer medla upptaget av enskilda partiklar. Mer vanliga metoder för studier av fagocytos, såsom slutpunkt analyser, saknar möjlighet att förstå vad som händer på gränssnittet för partiklar och fagocyter. Här beskriver vi fagocytos analyser, med time-lapse spinning disk-konfokalmikroskopi, som tillåter 3D imaging enda fagocytos händelser. Dessutom beskriver vi analyser för att entydigt bild Fcγ-receptorn - eller komplettera receptor-medierad fagocytos.
Introduction
Tjugo år innan Metchnikoff's observation av fagocytos mesenchyme celler i starfish larver, 1882, och efterföljande utvecklingen av sin teori om fagocytos1, beskrivs Ernest Haeckel, 1862, omvälvning av olösligt färgämne partiklar av blod cellerna i Thetis fimbris (Tethys fimbria), en art av underprissättning sea slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Han beskrev uttryckligen membran utskjutande kuvertering partiklarna, som senare togs i cytoplasman och samlats runt cellkärnan. Mer än 100 år senare, föreslog en banbrytande studie av Kaplan att det fanns minst två morfologiskt skilda mekanismer av fagocytos2. Kaplan visade med hjälp av svepelektronmikroskopi som musen peritoneal makrofager intas en IgG-opsonized får röda blodkroppar med hjälp av tunna membran förlängningar som nått upp och tätt insvept partikeln, initialt ger upphov till en cup-liknande struktur. Fagocytos cup bildandet krävs aktin polymerisation eftersom det upphävdes av den cell-permeable svamp toxin cytochalasin B, kända för att blockera aktin dynamics3. Däremot tycktes får röda blodkroppar opsonized med komplement sjunka direkt i makrofag utan generationen av membran förlängningar, även om i vissa bilder, membran volanger kan ses i omedelbara närheten av sjunkande partiklar. Till skillnad från bildandet av fagocytos cup var komplement-medierad sjunka insenstive till cytochalasin B behandling2. I de experiment som beskrivs av Kaplan, komplement opsonization utfördes av ruvning immunglobulin M (IgM) märkt får röda blodkroppar med serum från komplement C5-brist möss, som kringgår hemolys av terminalen komplement C5-beroende komplettera komplexa.
De två lägena av fagocytos, fagocytos cup bildandet och sjunker i, identifierade av Kaplan har blivit etablerade yttrande i fält4,5,6,7,8,9 . Men Ultrahög upplösning bilderna används i den ursprungliga studien av Kaplan2, samt en liknande studie av Munthe-Kaas o.a. 10, bara ger ögonblicksbilder av fagocytos händelser. I en senaste översyn, Rougerie et al. 11 betonade att morfologiska skillnader mellan FcγR - och CR-medierad fagocytos återstår klargöras, och dessutom membran volanger har observerats under komplement-medierad partikel upptag2. Live-cell avbildning av enstaka fagocytos händelser som spänner från partikel fånga till internalisering, kombinerat med genetiskt modifierade musmodeller, kraftigt skulle kunna förbättra vår förståelse av hur fagocyter fånga och äter partiklar. En strategi kan vara att använda snabbt atomic force microscopy (AFM) som tillåter Ultrahög upplösning (10 – 20 nm) topografisk avbildning av levande celler. En snabb AFM system12 har nyligen utvecklats, som är lämplig för avbildning cell ytor snabbt med låg ljudnivå. Denna teknik har fördelen att högupplösta, topografiska och mekaniska parametrar av levande celler kan mätas med korta mellanrum (sekunder), till skillnad från svepelektronmikroskopi, vilket nödvändiggör den fixering och kritisk punkt torkning av celler. En annan metod är time-lapse 3D konfokalmikroskopi, som är allmänt tillgänglig, även om fototoxicitet och blekning är begränsande faktorer under inspelningar. Detta tillvägagångssätt är mångsidig och tillåter optisk snittning med hög rumslig upplösning och ger extra flexibilitet i märkning med en häpnadsväckande rad fluorescerande sonder, inklusive genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Här beskriver vi fagocytos analyser med time-lapse spinning disk konfokalmikroskopi som tillåter hög spatiotemporal upplösning av specifika receptormedierad fagocytos händelser.
Protocol
Protokoll som följer riktlinjerna i vår lokala mänskliga forskningsetisk kommitté, samt djurvård riktlinjerna.
1. isolering av bosatta mus Peritoneal makrofager
- Offra musen (3 – 4 månaders ålder (oavsett kön); t.ex. C57BL/6 stam) med hjälp av en överdos av den flyktiga anestetika isofluran (> 5% i luft) eller koldioxid13, följt av cervikal dislokation. Induktion av anestesi kan bedömas lätt av förlust av rätande reflex14samt förlust av tass tillbakadragande reflexen.
- Efter rengöring magen på musen med 80% etanol i vatten, gör en mittlinjen huden snitt och exponera underliggande bukväggen.
- Placera en 24-G plast kateter i peritoniumen och lavage hålrummet med 2 x 4,5 mL iskallt Hanks buffrad saltlösning (HBSS), utan Ca2 + och Mg2 +via en 5 mL Plastspruta. Medan du injicerar, lämna ca 0,5 mL kvarstående HBSS (5 – 4,5 mL (injiceras) = 0,5 mL) i sprutan i fall vävnad sugs in spetsen av katetern och måste utvisas. Över aspirerade till en 14 mL polypropylen runda-botten rör och centrifugera vid 300 x g under 6,5 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Spetsen av plast katetern är rättframa, som, jämfört med en nål, minimerar skador på buken innehållet. Normalt följande milda buken massage, 8 mL peritoneal cellsuspension kan hämtas från bukhålan. - Avlägsna supernatanten och återsuspendera peritoneal cellerna i 1 mL bikarbonat-fri RPMI 1640 medium innehållande 20 mM Hepes, 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum och antibiotika, såsom penicillin (100 enheter/mL) och streptomycin (100 µg/mL), som utarbetats av späda 100 x penicillin/streptomycin 1: 100. Detta ger vanligtvis en koncentration av cirka 6 x 106 celler/mL.
Obs: Ca 30% av isolerade peritoneal celler är makrofager, medan andra (mindre) cellerna är lymfocyter, huvudsakligen B-celler.
2. sådd av Peritoneal celler i kanal glider
-
Efter pipettering cellsuspensionen upp och ner för att minska klumpar, Pipettera 100 µL suspension i förfyllda kanalen (volym, 100 µL) av en Fibronektin-belagd kanal bild (en 100 µL kanal har mått (längd x bredd x höjd): 50 x 5 mm 0,4 mm).
- Prefill kammaren genom att lägga till 1 mL serum-kompletteras RPMI 1640 (Hepes) medium till en av de två reservoarerna av kanal bilden, luta bilden, och sedan aspirera på medellång från reservoaren nedströms (figur 1).
- Ta bort oönskade luftbubblor eller långa remsor av luft, i engelska kanalen genom att lägga till 1 – 2 mL medium till en av de två reservoarerna, tätt tillämpa en reservoar mössa och sedan pumpa ut luften genom rytmiska tumtryck på cap och, vid behov, luta bilden. Efter utvisa luften, luta bilden med icke-utjämnade reservoaren (och som innehåller medium) nedåt innan du tar bort kapsylen för att undvika luft sugs tillbaka in i kanal.
- Prefill kammaren genom att lägga till 1 mL serum-kompletteras RPMI 1640 (Hepes) medium till en av de två reservoarerna av kanal bilden, luta bilden, och sedan aspirera på medellång från reservoaren nedströms (figur 1).
- Inkubera i kanal bilden seedade med celler, i en fuktig kammare för 2 h vid 37 ° C i avsaknad av CO2 (CO2 krävs inte eftersom HCO3-tillpass2 buffertsystem ersättas med Hepes). Kanal bilderna kan placeras praktiskt på ett galler, som rymmer åtta bilder. Vanligtvis tillagas 6 – 8 bilder från en mus, även om upp till 10 eller mer är möjligt.
-
Ta bort racket och utbyta RPMI 1640 (Hepes) medium i varje bild för RPMI 1640 medium som innehåller bikarbonat, kompletterad med 10% fetalt bovint serum samt penicillin/streptomycin.
- Tilt i bilden och aspirera medium först från nedre behållaren och sedan från övre behållaren. Nästa, tillsätt 1 mL av det nya mediet till en av behållarna, luta bilden och aspirera mediet från nedströms reservoaren, efter det har strömmat genom kanalen.
- Efter detta TVÄTTNINGSSTEGET (medium utbyte), Fyll i kanal bilden genom att lägga till 1 mL medium en av behållarna.
Obs: Tvätta stegen med kanal diabilder är mycket enkel och effektiv när det gäller lösning utbyte och att ta bort icke-anhängare celler. Observera att RPMI 1640 (bikarbonat) mediet är normalt före ruvade med 5% CO2 över natten för att säkerställa termisk och pH balans.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2. Utföra experiment på följande dag.
3. isolering av humana röda blodkroppar
- Dag 2 (andra dagen av experiment; efter natten inkubation av isolerade peritoneal makrofager), samla in 1 – 2 mL perifer venös blod från friska donatorer, i en hepariniserad tube. Överför 1 mL till en rund botten 2,0 mL (polypropen) mikrocentrifug rör, Centrifugera vid 300 x g under 5 minuter vid 18 ° C (empirisk inställning), och ta bort supernatanten (plasma och buffy coat).
- Försiktigt aspirera 100 µL av de sedimenterade erytrocyterna och blanda denna volym 1:1 med modifierade RPMI 1640 (Hepes) medium (beskrivs nedan) i en rund botten 2,0 mL mikrocentrifug rör. Märk röret ”1:1”.
Obs: Det RPMI 1640 (Hepes) medium som används på dag 2 (för analyser) efter isolera cellerna innehåller, förutom 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, penicillin (100 enheter/mL), streptomycin (100 µg/mL) och 1 mM N-(2-merkaptopropionyl) glycin (för att minska fototoxicitet). Detta medium är hädanefter ”modifierad” RPMI 1640 (Hepes) medium. - Pipettera 4 µL av 1:1 utspädda röda blodkroppar suspensionen i 2 mL modifierade RPMI 1640 (Hepes) medium, pre pipetteras i ett 2,0 mL mikrocentrifug rör (Upprepa detta steg, dvs förbereda 2 tuber). Märk varje tub ”4: 2000”. Placera ”1:1” och ”4: 2000” rören på is.
4. märkning av makrofag plasmamembranet
- Ta bort de seedade kanal bilderna från CO2 inkubatorn och utbyta RPMI 1640 (bikarbonat) medium i varje bild för modifierade RPMI 1640 (Hepes) medium. Placera cellerna i en fuktig kammare vid 37 ° C i avsaknad av CO2.
Obs: Efter natten inkubation och tvätt, de flesta av lymfocyter tas bort från kanalen. Majoriteten av de resterande vidhäftande cellerna är makrofager, som kan identifieras antingen morfologiskt eller genom immunofluorescens färgning med anti-F4/80 antikroppen. Omkring är 95% av mus bosatt peritoneal makrofager F4/80 positiva. - Späd fluorescently gröna märkta antimus F4/80 antikropp (lagrad vid 4 ° C) 1:40 i modifierad RPMI 1640 (Hepes) medium. Ta en bild, luta den och överför med pipett (droppe för droppe) 100 µL av antikropp blandningen till öppnandet av kanalen 100 µL av bilden (se figur 1). Aspirera medium som flödar in i reservoaren nedströms. Inkubera cellerna under 20 minuter vid 37 ° C (fuktad miljö, utan CO2). Under inkubationstiden, märk de mänskliga röda blodkroppar (se avsnitt 5).
Obs: Som antytts ovan, CO2 krävs inte eftersom HCO3-tillpass2 buffertsystem ersättas med Hepes. - Efter 20 min inkubering tid (under vilken mänskliga röda blodkroppar är målat och opsonized), tvätta i bilden genom att tillsätta 1 mL ändrades RPMI 1640 (Hepes) medium en av behållarna och aspirera mediet efter att det har strömmat genom kanalen underlättas av vrida bilden. Lägg till 1 mL medium för kortsiktig lagring eller gå vidare till ett experiment (dvs pipettering i partiklar (opsonized röda blodkroppar) och imaging fagocytos av time-lapse spinning disk konfokalmikroskopi).
5. märkning plasmamembranet av humana röda blodkroppar
- Börja märkning av mänskliga röda blodkroppar omedelbart efter inkubation en bild av makrofager med gröna fluorescently märkt anti-F4/80 antikropp (efter avsnitt 4.2). Efter varsam blandning, ta 400 µL från en av de ”4: 2000” rör (se avsnitt 3.3) och fördela det i ett (rund botten) 2,0 mL mikrocentrifug rör. Ge tid för suspensionen att värma till ca 37 ° C (se punkt nedan). Lägga till 0.4 µL orange/röd fluorescerande plasmamembranet fläcken (alikvoter lagras vid-20 ° C), blanda och inkubera vid 37 ° C i 5 min.
Obs: Ett uppvärmt aluminium block, placeras inuti LAF, är användbar för att minimera värmeförluster samtidigt förbereda bilder. Rören kan placeras i bore brunnar i värmeblocket och en separat eller integrerad, uppvärmd aluminiumplatta kan fungera som en arbetsrymd. - Efter 5 min inkubationstiden, förbereda första tvättningen genom att lägga till 1600 µL modified RPMI 1640 (Hepes) medium (för att fylla 2,0 mL mikrocentrifug röret).
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min vid 18 ° C (empirisk inställning). En kompakt röd pellet ska vara synliga på väggen (dvs, off-center) på botten av röret. Vrid röret så att pelleten är vänt uppåt och ta försiktigt bort alla av supernatanten successivt (i två steg) med ett 1-1,5 mL pipettspetsen.
- Efter Aspirera supernatanten, Lägg 2 000 µL modified RPMI 1640 (Hepes) medium, mix (för att resuspendera cellerna) och upprepa ovanstående steg för centrifugering och supernatanten aspiration.
- Återsuspendera pelleten (av plasmamembranet färgas och 2 x tvättade röda blodkroppar) med 400 µL av modifierade RPMI 1640 (Hepes) medium. Märk röret PMS (förkortning för plasmamembranet fläcken).
Obs: Alternativt, succinimidyl ester av en pH-känsliga rodamin derivat, som blir mer starkt fluorescerande vid surt pH, kunde användas för att märka mänskliga röda blodkroppar. I det här fallet fungerar fluorescensintensiteten dessutom som ett mått på phagosome mognad, efter partiklar har varit internaliserat.
6. opsonization (märkning) av mänskliga röda blodkroppar med musen immunglobulin G (IgG)
- Lägg till 1 µL mus (IgG2b) monoklonal (klon HIR2) anti-humant CD235a (1 mg/mL) antikropp (lagras vid-20 ° C) till röret PMS (se avsnitt 5.2 – 5.5), som innehåller plasmamembranet färgas mänskliga röda blodkroppar upphängd i 400 µL medium. CD235a (även känd som glycophorin A) är en erytroid härstamning-specifika membran sialoglycoprotein.
-
Inkubera vid 37 ° C i 8 min. Obs att opsonization av mänskliga röda blodkroppar med IgG orsaker agglutination (cell klumpar). Även om agglutination kan fungera som en visuell indikator av opsonization, är det önskvärt för bildtagning av enda fagocytos effekter. Att kringgå agglutination, upprepade gånger blanda cellsuspensionen (varje 1 min) använder, till exempel en variabel 20 – 200 µL volym pipetten anger till 200 µL.
- Mot slutet av perioden 8 minuters inkubation, om önskat, tvätta makrofag bilden, inkuberas med grön fluorescently märkt anti-F4/80 antikropp, med 1 mL modifierat RPMI 1640 (Hepes) medium. Se till att båda reservoarer av kanal bilden är medium efter tvätt steg.
7. imaging fagocytos av plasmamembranet färgas och IgG-belagda humana röda blodkroppar
- Efter 8 minuters inkubering med anti-CD235a antikropp (avsnitt 6.2), Pipettera 100 µL suspension innehållande plasmamembran-färgade och IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar i kanalen av en bild som innehåller makrofager märkt med grön fluorescerande anti-F4 / 80 antikropp (Steg4). Röd fluorescerande, IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar tillsätts således grön fluorescerande fagocyter (makrofager).
- Så snart mänskliga röda blodkroppar har lagts, montera kanal bilden på en snurrande bricka confocal Mikroskop (med den scenen inkubator inställd på 37 ° C) för avbildning, till exempel via en 60 X / 1,49 Oljeimmer objektiv. Starta imaging så snart som möjligt, eftersom partiklar börjar lösa inom 1 min.
Obs: Med hjälp av fluorescerande pärlor med en diameter på 100 nm, Vi mätte, genom analys av punkt sprida funktioner, XY resolutioner av x = 0,22 µm, y = 0.23 µm (488 nm laser) och x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm laser). Men för att minska fotoblekning och fototoxicitet under time-lapse 3D imaging av levande celler, kompromissar vi rumslig upplösning med 2 x 2 binning. Binning ökar känslighet (förbättrar signal-brus-förhållandet) och den tillåtna hastigheten, men på bekostnad av rumslig upplösning. - Använda en perfekt fokus (eller liknande) för att förhindra fokus drift under inspelningar. Efter aktivering perfekt fokus systemet, använda offset kontrollen att fokusera på makrofag lamellipodial utskjutande omedelbart ovanför täckglaset (se not nedan) av kanal bilden. Denna fokus nivå motsvarar Z = 0 µm. Erhåll Z-stackar från-1 µm + 16 µm på 0,8 µm-steg, som uppgår till 22 Z-skivor. Z-stackar, exempelvis erhållas med en hastighet av 1 bunt (för varje kanal) var 15 s för totalt 16 min.
Obs: Längre inspelning perioder lider förlust av bildkvalitet, främst på grund av fotoblekning. Z-stackar förvärvas för var och en av de två kanalerna: makrofager är avbildas med hjälp av en 488 nm laser (grön kanal) och mänskliga röda blodkroppar är avbildas med hjälp av en 561 nm laser (röd kanal). Med detta synsätt, olika vyer av makrofager som intag av IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar vid olika tidpunkter kan erhållas (till exempel, se figur 2).
Obs: Vanliga inställningar av systemet (med 2 x 2 binning) är: gröna kanalen (20,5% laser (50 mW; 488 nm) makt, 101 känslighet (intervall 0 – 255) och 200 ms exponeringstid); röda kanalen (10,5% laser (50 mW; 561 nm) makt, 101 känslighet (intervall 0-255) och 98 ms exponeringstid).
Obs: Botten av kanalen bilden är en polymer med samma tjocklek som en #1.5 täckglas och samma optiska egenskaper av glas, men framför allt, materialet har fördelen av gas permeabilitet.
8. imaging fagocytos av plasmamembranet som färgas och komplement-belagda humana röda blodkroppar
- Komplement-opsonize plasmamembran färgas och IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar på samma sätt till avsnitt 5 och 6, utom, i stället för pipettering 4 µL av 1:1 utspädda röda blodkroppar suspensionen i 2 mL modified RPMI 1640 (Hepes) medium, som beskrivs i avsnitt 3.3, Pipettera 4 µL till 1 mL modified RPMI 1640 (Hepes) medium, och följaktligen etiketten röret 4:1, 000. Således är de mänskliga röda blodkropparna 2 x mer koncentrerad.
- Fortsätt med stegen i avsnitten 4 och 5, men börjar med 4:1,000 snarare än 4:2,000 utspädd beståndet av mänskliga röda blodkroppar (4:1, 000 och 4:2,000 avser de efterföljande spädningarna av initialt 1:1 utspädda mänskliga röda blodkroppar beskrivs i avsnitt 3.1 och 3.2).
- Offra en C5 null mus (t.ex. B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) (> 5% i luft) isofluran inhalation följt av halshuggning och samla in blod. Vi droppa brukar ca 0,8 mL blod i en rund botten 14 mL plaströr omedelbart efter isofluran inandning och halshuggning.
- Efter 1 h, när blodet är fullt koagulerat, över den kvarvarande vätskan till en 2.0 mL mikrocentrifug rör och centrifugera vid 300 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Därefter, noggrant samla gulaktig serum. Vanligtvis återvinna vi minst 200 µL C5 null serum. Placera C5 null serumet på is.
- Efter 4 minuters inkubering av plasmamembranet färgas mänskliga röda blodkroppar med IgG, lägga till en annan 1 µL anti-CD235a antikropp (ger 2 x koncentrerad), och sedan ta 50 µL cellsuspension och blanda det i ett separat 2,0 mL mikrocentrifug rör innehållande 50 µL C5 null serum. Fortsätt att blanda flera gånger (varje 1 min) av pipettering upp och ner, som i avsnitt 6.2, för en annan 4 min. Efter detta steg, har således de mänskliga röda blodkropparna inkuberats med anti-CD235a antikropp för totalt 8 min.
Obs: 4 min inkubationstiden med C5 null serum är tillräcklig för att aktivera den klassiska komplement kaskaden och opsonize mänskliga röda blodkroppar med C3b, som är tätt med faktor jag till iC3b.
9. bekräftelse av IgG - och C3b-opsonization av humana röda blodkroppar
-
Bekräfta opsonization av mänskliga röda blodkroppar med musen anti-CD235a IgG (IgG2b; se avsnitt 6.1) antikropp genom ruvning cellerna med Get antimus (sekundär) IgG-antikropp konjugerat till en grön eller röd fluorescerande fluorophore.
- Lägg till 1 µL mus-anti-CD235a IgG-antikropp och 1 µL fluorescently märkt antimus sekundär antikropp i en 400 µL suspension av mänskliga röda blodkroppar och inkubera vid 37 ° C i 8 min. Därefter tvätta två gånger (som i avsnitt 5.2 – 5.5).
- Återsuspendera cellpelleten med 400 µL modified RPMI 1640 (Hepes) medium och Pipettera 100 µL av upphängningen in i en kanal slide (se figur 1 c) för confocal fluorescens imaging.
Obs: Cellerna kommer klump (agglutinerar) efter tvätt och resuspension, men tvätta är nödvändigt att minska bakgrunden fluorescens på grund av obunden sekundär antikropp.
-
Bekräfta opsonization av mänskliga röda blodkroppar, pre märkt med mus-IgG och inkuberas med C5 null mus serum, med C3b/iC3b med till exempel, råtta antimus C3b/iC3b/C3c antikropp och en sekundär antikropp, till exempel get anti råtta IgG-antikropp konjugerat till en grön fluorescerande fluorophore.
- Upprepa stegen i avsnittet 8 med ofärgade mänskliga röda blodkroppar.
- Tillsätt 0,25 µL fluorescently märkt C3b/iC3b/C3c antimus-antikropp till 100 µL blandningen (50 µL IgG-märkt mänskliga röda blodkroppar + 50 µL C5 null mus serum) och inkubera vid 37 ° C i 8 min.
- Tvätta två gånger, återsuspendera pelleten i 100 µL modified RPMI 1640 (Hepes) medium och pipett suspensionen i en kanal slide (se figur 1 c) för confocal fluorescens imaging.
Representative Results
En schematisk bild av kanal bilden används för bildtagning av fagocytos av time-lapse spinning konfokalmikroskopi visas i figur 1. Människans röda blodkroppar (hRBCs) färgas med röd fluorescerande plasmamembranet markören CellMask Orange, medan isolerade mus bosatt peritoneal makrofager (Ms) är märkta med grön fluorescerande Alexa Fluor 488-konjugerad anti-F4/80 antikropp ( Figur 2), som serverar både som en specifik markör för mus makrofager och en plasmamembranet etikett. Människans röda blodkroppar kan vara opsonized med mus-IgG (mIgG) eller musen IgM (mIgM), genom ruvning cellerna med IgG (eller IgM) anti-CD235a antikroppar (CD235a, även känd som glycophorin A, är ett protein som specifikt uttrycks på humana röda blodkroppar). Time-lapse 3D imaging av grön fluorescerande makrofager presenteras med röd fluorescerande mänskliga röda blodkroppar möjliggör visualisering av enskild partikel fagocytos händelser (figur 2). Noggrann observation av enstaka fagocytos händelser kan Detaljer för partikel avskiljning och förtäring till avgränsas. Till exempel kan tillfångatagandet av en mIgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar genom en makrofag filopodium, en tunn, finger-liknande projektion, observeras (figur 3A; Se även Horsthemke o.a. 15). Dessutom klämma i en mänsklig Röd blodkropp under fagocytos cup bildandet kan observeras (figur 3A). Utlösa den klassiska komplement kaskad, som kulminerar i bildandet av ett Hemolytiskt membran attack komplex vid införandet av färska musen serum, mIgG-opsonized, eller mIgM-opsonized, mänskliga röda blodkroppar. Kinetiken av komplement-medierad hemolys kan mätas genom imaging celler dual-fläckade CellMask Orange och Calcein. Grön fluorescerande cytosoliska Calcein frigörs snabbt från celler vid hemolys (figur 3B).
Figur 1: hantering av Fibronektin-belagd kanal diabilder. (A) A kanal bilden består av två reservoarer ansluten via en kanal med måtten 50 x 5 mm 0.4 mm. kanal diabilder är initialt förifyllda av 1-2 mL medium för en av de två reservoarerna och luta bilden. (B) Caps kan placeras på behållarna före inkubering. Locken kan användas bekvämt att pumpa ut oönskade luftbubblor före sådd kanalen med celler. (C) den luft bubbla-fria 100 µL kanal kan fyllas av direkt pipettering medium i munnen på en kanal. Det här steget används, till exempel till utsäde makrofager i en bild eller lägga till gfluorophore (grön fluorescerande)-konjugerad antikropp anti-F4/80, som fungerar som en membran-etikett, samt en mus makrofag markör. (D) efter pipett partiklar såsom opsonized mänskliga röda blodkroppar, till en kanal som ympats med fluorescently målat makrofager, bilden kan placeras på scenen av en inverterade mikroskopet och time-lapse spinning disk konfokalmikroskopi kan vara utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Time-lapse 3D imaging av fagocytos. (A) Schematisk bild visar opsonization av plasmamembranet som målat (röd fluorescerande) mänskliga röda blodkroppar (hRBCs) med musen (m) anti-CD235a immunglobulin G (mIgG) antikropp och presentation av märkta hRBCs till mus makrofager (Ms), märkt (grön fluorescerande) med grön fluorescerande fluorophore-konjugerad anti-F4/80 antikropp. (B) Time-lapse bilder (XZ visningar), erhålls genom att snurra skivan konfokalmikroskopi, visar fagocytos cup bildandet och intag av mIgG-opsonized hRBCs. Skalstapeln = 10 µm. (C) 3D rekonstruktioner visar makrofager intag av mIgG-opsonized hRBCs. Motsvarande XZ vyer (för 3 tidpunkter användes) visas i B. Grid mellan fästpunkterna representerar 5,07 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: fånga av en partikel av en filopodium. Time-lapse bilder erhålls genom att snurra skivan konfokalmikroskopi, visar en mus makrofag fånga en mus immunglobulin G (mIgG)-opsonized mänskliga röda blodkroppar (hRBC) via en filopodium (pilarna i övre panelen), en finger-liknande projektion. Observera att den röda blodkroppar förlorar dess crenations tidigt under fagocytos cup bildandet. Dessutom verkar den fagocytiska cup pressa den höljeförsedda röda blodkroppar (anges av pilarna i nedre panelen). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Den stora majoriteten av fagocytos analyser, särskilt slutpunkten och hög genomströmning analyser, ger inte visualisering av hur partiklar faktiskt fångas, höljeförsedda och förtäring. Banbrytande studier av Munthe-Kaas o.a. 10 och Kaplan2 på 1970-talet föreslog att påfallande olika cytoskeletal omorganiseringar var involverade i fagocytos av IgG-opsonized kontra komplement-opsonized partiklar (får röda blodkroppar). Här beskriver vi fagocytos analyser med hjälp av spinning disk konfokalmikroskopi som tillåter högupplösta, realtid avbildning av enstaka fagocytos händelser. Vår modell fagocytsystemet är den mus bosatt peritoneal makrofager, som kan isoleras med minimal hantering, och vi använder färska isolerade humana röda blodkroppar som partiklar. Fagocytos analyserna skulle dock kunna tillämpas på andra fagocyter, såsom mus benmärg-derived makrofager eller neutrofiler, mus makrofag cellinjer, mänskliga monocyt-derived makrofager eller perifert blod neutrofiler. När det gäller mänskliga fagocyter eller mus neutrofiler, skulle alternativ fluorescently märkt antikroppar krävas, såsom fluorescently märkt anti-CD14 antikroppar (humana monocyter/makrofager)16 eller anti-Gr-1 (Ly - 6 G) antikroppar (mus neutrofiler).
Unopsonized mänskliga röda blodkroppar, som traditionellt används får röda blodkroppar, är inert i den meningen att dessa celler inte (eller, åtminstone, mycket sällan) intas av mus peritoneal makrofager. Detta garanterar, i motsats till polystyren pärlor, låg bakgrund aktivitet. Människans röda blodkroppar kan vara bekvämt opsonized med immunglobuliner med mus IgG eller IgM monoklonala antikroppar mot CD235a (glycophorin A), en specifik markör på humana erytrocyter (röda blodkroppar) och erytroid prekursorer17, 18. i parallella analyser, fluorescently märkt antimus IgG eller IgM sekundära antikroppar kan användas för att bekräfta opsonization. IgG och IgM antikropp klasserna är hemagglutinins, ämnen (antikroppar) som orsakar röda blodkroppar agglutinerar. För att undvika agglutination, blandar vi periodvis cellsuspensionen under inkubationstiden 8 min med anti-CD235a antikropp och lägger vi blandade suspensionen direkt till en makrofag-innehållande kanal bild (Fibronektin-belagda bild) utan en TVÄTTNINGSSTEGET . Tvätta stegen innebär sedimentering av erytrocyter genom centrifugering, som starkt främjar agglutination. Innan opsonizing mänskliga röda blodkroppar, märka vi plasmamembranet med en lipofil orange/röd fluorescerande sond. Denna sond är ljust fluorescerande i början av time-lapse inspelningar, men signalen bleknar gradvis, förmodligen till stor del på grund av fotoblekning19. Dessutom, kan makrofager och Fibronektin beläggning av bilden bli svagt orange/röd fluorescerande under inspelningar. Detta problem är förmodligen på grund av otillräcklig tvättning av mänskliga röda blodkroppar efter märkning. Istället för att använda en lipofila fluorescerande plasmamembranet markör, kan mänskliga röda blodkroppar märkas med ett pH-känsliga rodamin derivat med dess amine reaktiva succinimidyl ester15,20. Detta har fördelen av att visualisering av phagosome mognad eftersom fluorescensintensiteten ökar med minskande pH15,20, men detta tillvägagångssätt har nackdelen som reaktiv ester preparat för närvarande dyra och instabil efter beredning i vattenhaltigt medium.
IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar intas via FcγRs, som kan bekräftas med peritoneal makrofager isolerade från NOTAM21 eller Fcer1g- / - (Fcer1g knockoutmöss). NOTAM makrofager binda IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar, men saknar ITAM (immunoreceptor tyrosin-baserad aktivering motiv) - medierad signalering krävs att inducera fagocytos, medan Fcer1g knockout makrofager inte uttrycker surface FcγRs. IgG - eller IgM-opsonized mänskliga röda blodkroppar kan vara dessutom opsonized med C3b (som är kluvna till iC3b) av ruvning cellerna med nymalen isolerade serum från en komplement C5 null mus (vildtyp serum orsakar hemolys). Opsonins IgG och IgM aktivera klassiskt komplement kaskad, vilket leder till bildandet av porer (membran attack komplex) och cellys. I möss som saknar komplement C5, komplement kaskad fortsätter att komplettera C3 klyvning, men C5 convertase saknar de substrat som krävs för att katalysera terminal vägen. Vi utvecklat enkla analyser för att mäta kineticsen av komplement kaskad. Kort sagt kan människans röda blodkroppar vara co märkta med ett rött fluorescerande, plasmamembranet markör och grön fluorescerande, cytosoliska fluorophore. Vid bildandet av membran attacken komplexa, bildas av kompletterande komponenter C5-C9, cytosoliska fluorophore är snabbt (i sekunder) förlorade från cytosolen. Visualisering av funktionen slutet-effektor (cytolys) i komplement kaskad anges att 4 min inkubationstiden är tillräcklig för C3b/iC3b opsonization av mänskliga röda blodkroppar. I parallella analyser, kan C3b/iC3b beläggning av mänskliga röda blodkroppar enkelt bedömas efter applicering en blandning av antimus C3b och fluorescently märkt sekundära antikroppar. I detta fall krävs en TVÄTTNINGSSTEGET ta bort obundna fluorescerande antikroppar. Även om tvättningen innebär cell sedimentaion genom centrifugering, som främjar agglutination, kan framgångsrika opsonization lätt bedömas konfokalmikroskopi. Komplement-medierad fagocytos kan avbildas av antingen tillämpa IgG- / iC3b-opsonized mänskliga röda blodkroppar NOTAM eller Fcer1g- / - makrofager eller genom att införa IgM- / iC3b-opsonized mänskliga röda blodkroppar till vildtyp makrofager. IgM-opsonized blodkroppar erkänns inte av den ITAM-innehållande FcγRs (FcγRI, FcγRIII och FcγRIV) krävs för fagocytos av IgG-opsonized partiklar22.
För att bilden fagocytos kan händelser, plasmamembranet av makrofager märkas med grön fluorescerande fluorophore konjugerad antikropp som anti-F4/80, som även fungerar som en specifik markör för mus makrofager. Människans röda blodkroppar kan renderas röd fluorescerande genom inkubation med en orange/röd fluorescerande plasmamembranet markör, som diskuterats ovan. Denna lipofila plasmamembranet markör undviker eventuella störande effekter av antikroppsbaserade etiketter. Röd fluorescerande mänskliga röda blodkroppar, med eller utan opsonization, kan vara direkt pipetteras i 100 µL kanalen på en kanal-bild och 3D time-lapse avbildas via en 60 X / 1,49 olja (eller liknande) objektiv som utförs med hjälp av 488 nm och 561 nm laserlinjer , respektive av en snurrande bricka confocal (eller liknande) Mikroskop. Det är frestande att optimera systemet för högupplösta imaging, men förvärvet av upprepade Z-stackar över 16 min eller så kan orsaka betydande fotoblekning och fototoxicitet. Vi valde att använda 2 x 2 binning för att främja bra signal-brus-förhållanden och möjliggöra minskningar i excitation intensitet och/eller exponeringstider, men på bekostnad av optisk upplösning. Dessutom, för att minska fototoxicitet, lägga vi en asätare av reaktiva syreradikaler till medium. I framtida studier, kunde analyserna ändras bilden fagocytos av apoptotiska mänskliga röda blodkroppar. Tillämpningen av en Ca2 + jonofor, såsom A23187, kan användas för att inducera fosfatidylserin externalisering23, en ”ät mig” signal och hallmark tidiga apoptos24,25.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidragen HA 3271/4-1 och HA 3271/4-2 från DFGEN (Deutsche Forschungsgemeinschafts), och att bevilja FF-2016-05 från EXC 1003 (kluster av Excellence 1003), celler i rörelse (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature reviews. Molecular cell biology. 4, 897-901 (2003).
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The journal of cell biology. 105, 1473-1478 (1987).
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual review of immunology. 17, 593-623 (1999).
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
