Summary
كثيرا ما تستخدم الجذر الظهرية ganglia (DRG) الثقافات الأولية لدراسة الوظائف الفسيولوجية أو الأحداث المتعلقة بعلم الأمراض في الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن شرح استخدام الثقافات DRG القطني للكشف عن الإفراج عن العصبية بعد مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي اكتب التحفيز 2 مع مؤثر انتقائية.
Abstract
العقد الجذرية الظهرية (DRG) تحتوي على جثث الخلية من الخلايا العصبية الحسية. هذا النوع من الخلايا العصبية شبه أحادي القطب، مع اثنين من محاور عصبية التي يعصب الأنسجة المحيطية، مثل الجلد، والعضلات وأجهزة الحشوي، فضلا عن القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري للجهاز العصبي المركزي. الخلايا العصبية الحسية يحيل الإحساس الجسدية، بما في ذلك اللمس، الألم، والأحاسيس الحرارية، والتحفيز. ولذلك، تستخدم على نطاق واسع الثقافات الرسم الأساسي لدراسة آليات nociception الخلوية، والوظائف الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية والعصبية التنمية. ويمكن تطبيق الخلايا العصبية مثقف في الدراسات التي تنطوي على الكهربية وتوصيل الإشارة والإفراج عن ناقل عصبي، أو تصوير الكالسيوم. مع الثقافات الرسم الأساسي، والعلماء قد الثقافة الخلايا العصبية DRG منفصلان لرصد التغيرات البيوكيميائية في واحد أو عدة خلايا، التغلب على العديد من أوجه القصور المرتبطة بالتجارب في فيفو . مقارنة تجارياً المتاحة خطوط خلايا هيبريدوما DRG أو مخلدة الرسم خطوط الخلايا العصبية وتكوين وخصائص الخلايا الأولية أكثر بكثير مماثلة للخلايا العصبية الحسية في الأنسجة. ومع ذلك، نظراً للعدد المحدود من الرسم مثقف الابتدائية الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن حيوان مفردة، من الصعب أداء شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. ويرد في المادة الحالية، إجراءات تحصيل الرسم والثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر معاملة مثقف DRG الخلايا مع مؤثر مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي نوع 2 (NPFFR2) للحث على الإفراج عن العصبية الببتيد (كالسيتونين المتصلة بالجينات الببتيد (كرجب) ومادة ف (س)).
Introduction
الهيئات الخلية من الخلايا العصبية الحسية الواردة ضمن الرسم. هذه الخلايا العصبية الزائفة أحادي القطب ويعصب الأنسجة المحيطية والجهاز العصبي المركزي. تم العثور على النهايات الطرفية العصبية من الخلايا العصبية الحسية في الجلد وأجهزة الحشوي، العضلات والعظام، وبين سائر الأنسجة. هي إرسال إشارات الإحساس الطرفية للعصب النهايات في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري والإشارات ثم تنتقل إلى الدماغ عبر مسارات مختلفة تصاعدي من الإحساس جسمية1،2. ويتيح الإحساس جسدية الجسم ليشعر (أي، تعمل باللمس والألم والأحاسيس الحرارية) وتصور الحركة والتوجه المكاني (التحفيز الأحاسيس)1،3. وهناك أربع فئات فرعية من محاور عصبية الزبائ الأولية، بما في ذلك المجموعة الأولى من الألياف (Aα) التي تستجيب لوضع الجسم عضلات الهيكل العظمى، والفريق الثاني (Aβ) الألياف التي تستجيب ميتشانوريسيبتورس الجلد، والمجموعة الثالثة (Aδ) ومجموعة ألياف الخامس (ج) الاستجابة للألم و درجة الحرارة. فقط الألياف ج أونميليناتيد، في حين بقية myelinated بدرجات مختلفة.
نوسيسيبتورس هي الخلايا العصبية الحسية الأولية، التي يتم تنشيطها بالمنبهات الضارة (تحفيز الميكانيكية والحرارية والكيميائية) التي تحمل إمكانات لتلف الأنسجة. وتتكون هذه الخلايا العصبية ميليناتيد Aδ الألياف والألياف ج أونميليناتيد1،4. ألياف Aδ التعبير عن مستقبلات عامل نمو العصب (ستموت، مستقبلات ترقا) وكجرب sp. وتصنف الألياف ج ألياف ج أما من بيبتيديرجيك وغير بيبتيديرجيك. من ناحية أخرى، أعرب الألياف ج غير بيبتيديرجيك المستقبلات لعامل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة (مستقبلات جدنف، والمقصود بالصندوق، و GFR)، إيسوليكتين IB4، وبوابات ATP أيون قناة النوع الفرعي (P2X3)5،،من67. يمكن أن تتميز بالتعبير عن قنوات أيون nociceptors وتفعيلها من خلال العوامل نيوروتروفيك، السيتوكينات، neuropeptides، ATP، أو المواد الكيميائية الأخرى مركبات8. يج وز على التحفيز، والعصبية، بما في ذلك كجرب و SP غلوتامات من المحطات العصبية الحسية في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري إرسال إشارات nociceptive2. الرسم ليست فقط تتكون من الخلايا العصبية، ولكن أيضا تحتوي على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. تحيط الخلايا العصبية الحسية الخلايا الأقمار الصناعية وتقديم الدعم الميكانيكية والايض9،10. من المثير للاهتمام، وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن الخلايا الدبقية الساتلية في الرسم قد يكون متورطا في تنظيم ألم الإحساس11.
الخلايا العصبية الحسية أفيد أن يكون الأكثر كثيرا ما تستخدم الخلايا العصبية الأولية12 وقد استخدمت لتوصيل الإشارة الكهربية والعصبي الإفراج عن الدراسات. أنها تستخدم عادة لاستكشاف الآليات الخلوية لتنمية الخلايا العصبية والألم التهابات والأم الأعصاب، والإحساس بالجلد (مثل حكة) واكسون ثمرة12،13،،من1415. يمكن مثقف الرسم الأساسي الثقافات كالخلايا العصبية معزولة تقييم التغيرات البيوكيميائية في واحدة أو في خلايا متعددة، السماح للعلماء إجراء الدراسات التي يتعذر إجراؤها في المواضيع التجريبية. في الآونة الأخيرة، تم بنجاح مثقف الرسم من الجهات المانحة الجهاز البشري الذي قد تستفيد كثيرا من البحوث متعدية16. من ناحية أخرى، يمكن أيضا استزراع الخلايا العصبية الحسية كما DRG explants. DRG explants الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية من الخلايا العصبية، بما في ذلك خلايا شوان والأقمار الصناعية الخلايا الدبقية، وهي مفيدة بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية وغير العصبية17. يمكن بسهولة إعداد الرسم الأساسي الثقافات داخل ح 2.5. تكوين الخلية وخصائص عاكسة لمصدر الرسم، وعلى هذا النحو، يمكن جمعها بالرسم المحددة (DRG القطني أو الصدري) وفقا لمطالب التجريبية. الثقافات من الأجنة وحديثي الولادة DRG الخلايا العصبية تتطلب ستموت البقاء على قيد الحياة، والحث على ثمرة محور عصبي، ولكن الثقافات من الخلايا العصبية الكبار لا تتطلب إضافة العوامل نيوروتروفيك لل12،وسائل الإعلام17. وهناك أيضا خطوط خلايا هيبريدوما DRG المتاحة تجارياً مثل ND7/23 و F11، التي لا تتطلب استخدام الحيوانات التجريبية. ومع ذلك، عدم الموجبة المحتملة مستقبلات عابرة قناة الأعضاء الفصيلية V 1 (TRPV1) التعبير (علامة هامة للخلايا العصبية nociceptive الحسية الصغيرة) وملامح التعبير الجيني تتعارض تحد من تلك التطبيقات18. في الآونة الأخيرة، مخلدة الخلايا العصبية الرسم خطوط مستمدة من الفئران (50B11)19 و20من الماوس (MED17.11)، التي مناسبة لاستخدام في شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. بيد أن التعبير الجيني التنميط لخطوط الخلية هذه لم تتم. وهكذا، التحقق من صحة التجارب المقارنة بين هذه الخلايا مخلدة للخلايا العصبية الحسية لا تزال جارية.
NPFFR2 هو توليفها في الرسم وذوبانها للمحطات الطرفية العصبية الحسية في العمود الفقري الظهرية القرن21. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكولا لاستزراع خلايا DRG القطنية والتعامل معهم بمؤثر NPFFR2 للحث على الإفراج عن العصبية، كجرب و sp. الاعتماد على NPFFR2 هو اختبار المزيد من استخدام NPFFR2 صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، التي قد ترانسفيكتيد في الخلايا المستزرعة DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الأساليب الموضحة هنا أن استخدام الحيوانات التجريبية "رعاية الحيوان المؤسسية" واللجنة استخدام (إياكوك) من جامعة الأمنيون تشانغ (CGU 13-014).
1-جمع DRG القطني من الفئران التجريبية
- استخدام 2 3 الفئران سبراغ داولي (SD) أسبوع من العمر لمجموعة الرسم القطني.
ملاحظة: الرسم الخلايا العصبية التي تم جمعها من الفئران أكثر من 4 أسابيع عمر لا تنمو جيدا في ظروف الثقافة الموضحة هنا. - تعقيم كل الأدوات الجراحية في اﻷوتوكﻻف.
- تخدير الفئران مع خليط 1:1 من تيليتاميني وزولازيبام (20 مغ/كغ؛ الحقن داخل (IP)) وانتظر حتى يظهر الحيوان أي استجابة الانسحاب سيرا على الأقدام في اختبار تو-قرصه.
ملاحظة: استراتيجيات التخدير المختلفة يمكن أن تستخدم بنجاح في هذا البروتوكول. - التضحية الفئران بقطع الرأس بمقصلة تجارية.
- استخدام المقصلة لعزل جذع الجسم من الفئران بين فوريليمب وعظم الفخذ. انظر الشكل 1A لرسم تخطيطي للمنطقة التي سيتم جمعها.
ملاحظة: يجب أن يكون السطر قطع والذيلية روسترال فقط لعظم الفخذ. وسوف اقتطعت DRG L6 القطني إذا كان الموقع قطع مرتفع جداً في العمود الفقري. - قص على طول القص وإزالة جميع الأجهزة/الأنسجة مع مقص التشريح (الشكل 2 أ-).
- قص على طول الجانب من الجذع لجمع الجزء الظهرية من الفئران وإزالة الجلد. انظر الشكل 1 باء لالتقاط صورة لتشريح الجذع الظهرية.
- إعداد الأنسجة على الجليد قبل جمع DRG. تنظيف الفراء والدم من القفازات، وتعقيم لهم مع الإيثانول 75% قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- إزالة العضلات تغطي القطنية. أولاً، إجراء تخفيضات اثنين على طول جانبي العمود الفقري (اليمين واليسار) وقطع أفقية واحدة وضع علامة على مدى روسترال للعمود الفقري القطني. ثم إزالة العضلات الظهرية العمود الفقري مع ملقط قطع العظام (الشكل 2 أ-ب).
- إزالة الجزء الفقرات الظهرية مع ملقط قطع العظام والكشف عن الحبل الشوكي.
- إزالة الحبل الشوكي مع مقص التشريح (الشكل 2 أ-ج) والملقط (الشكل 2 أ-د).
- تحديد الرسم القطني قبل عد فقرات من الضلع الأخير (الصدر فقرة 13). انظر الشكل 1 لرسم تخطيطي لفقرات ومواقف.
- تجميع الرسم القطني الثنائية (L1-L6) مع مايكرو-مقص (الشكل 2A-f) في طبق ثقافة 35 ملم مع 2 مل المثلج المتوسطة خالية من المصل. إزالة الألياف العصبية (كما هو مبين في الشكل 1) من ربط الرسم، ثم تحويلها إلى الطبق الثقافة لتحسين نقاء الثقافات.
ملاحظة: يمكن أن يوضع الرسم التي تم جمعها في المتوسط على الجليد لحوالي 1 ساعة. ومن ناحية أخرى، يمكن أن euthanized الفئران متعددة لإنشاء تجمع أكبر من الرسم.
2-الابتدائي ثقافة الفئران الخشب DRG
ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات التالية في غطاء الاندفاق الصفحي.
- تعد الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين وبيروفات صوديوم 100 مم x 1 البنسلين/ستربتوميسين في 1 × دميم-F12.
- معطف الخلية-الثقافة التعامل مع لوحة 24-جيدا مع 200 ميكروغرام/مل بولي-L-يسين ح 2 ثم أغسل بالماء المعقم.
- قبل احتضان ثقافة الطبق مع 1 مل الثقافة المتوسطة في 37 درجة مئوية CO2 حاضنة قبل الاستخدام لأقل من 30 دقيقة.
- نقل الطبق الذي يحتوي على الرسم 35 ملم في غطاء الصفحي، وتغسل الرسم مع خالية من المصل متوسطة 3 مرات ماصة.
ملاحظة: يجب تنظيف السطح الخارجي للطبق مع الإيثانول 75% قبل نقل إلى غطاء محرك السيارة. طبق 35 ملم يمكن أن تحتوي على مجموعات التشخيص المتماثلة من عدد من الفئران (هذا يعتمد على متطلبات التصميم التجريبي). - تتحرك في الرسم (من الفئران وحيدة أو مجتمعة من الفئران متعددة) إلى طبق ثقافة جديدة 35 مم، الذي يحتوي على 2 مل نوع كولاجيناز IA (1 ملغ/مل في المتوسط خالية من المصل) مع ملاقط معقمة (الشكل 2 ألف-هاء).
ملاحظة: ينبغي تعقيم حل كولاجيناز بتمريره من خلال مرشح حقنه 0.22 ميكرومتر. - هضم الرسم في حل كولاجيناز في حاضنة2 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة الحل كولاجيناز والمياه والصرف الصحي الرسم 3 مرات في 2 مل هانك متوازنة الحل الملح (حبس).
ملاحظة: قد يكون هناك ألياف المتبقية أو الأنسجة التي تؤتي ثمارها في الرسم إلى الحل. إزالتها من ماصة مع الحل الغسيل. - إضافة 2 مل استعد مسبقاً 0.05% التربسين-يدتا في الطبق الذي يحتوي على الرسم 35 ملم وهضم الرسم في حاضنة2 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- نقل 2 مل الحل الذي يحتوي على الرسم لأنبوب الطرد مركزي 15 مل ماصة زجاجية.
ملاحظة: قد تتمسك الرسم ماصة زجاجية حيث ينبغي أن يكون تنفيذ هذه الخطوة بعناية. يمكن تجنب فقدان الرسم قبل حفظ الحل الذي يحتوي على الرسم في نهاية مدبب ماصة زجاجية (حوالي 0.5 مل) ونقل الحل في أنبوب الطرد المركزي ببطء ولكن دون توقف. - الطرد المركزي الحل في 290 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وإضافة أخرى متوسطة 2 مل خالية من المصل ريسوسبيند في الرسم.
- كرر الخطوة 2.10 2 مرات ولكن التغير المتوسط خالية من المصل إلى حرارة ما قبل الثقافة المتوسطة في المرة الأخيرة.
- تريتوراتي يدوياً الرسم حوالي 60 مرة باستخدام ماصة باستور مصقول لهب (طول 230 ملم وتلميح رئيس القطر الداخلي 1 مم). انظر الشكل 2 لالتقاط صورة مقارنة الفوهة ماصة باستور مصقول الشعلة إلى ماصة غير مصقول.
ملاحظة: الداخل قطر ماصة باستور مصقول اللهب هو 10% تقريبا أصغر من ماصة السيطرة وينبغي أن تكون داخل نهاية مدبب أكثر سلاسة. كن حذراً لا لخلق فقاعات عندما تريتوراتينج الخلايا. - إزالة الطبق بولي-L-يسين-المغلفة من حاضنة2 CO. نضح المتوسطة الثقافة المحتضنة من الطبق، والبذور الخلايا منفصلان على الطبق المغلفة.
- بذور الخلايا الرسم من أحد الفئران (جمع الثنائية من المستوى 1-L6، للرسم الإجمالي 12) إلى أربعة آبار لصفيحة 24-جيدا؛ وهناك حوالي 5 × 104 خلايا في بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا.
ملاحظة: هذه الكثافة مناسبة للكشف عن كجرب أو SP المفرج عنهم ومناسبة أيضا إيمونوستينينج. لطخة غربية أو استخراج الحمض النووي الريبي، البذور الخلايا الرسم من أحد الفئران (الثنائية L1-L6) في بئر واحدة للوحة 6-جيدا. - استبدال 100 نانوغرام/مليلتر ستموت والمتوسطة الثقافة اليوم التالي مع إضافة 10 ميكرون cytarabine (ارا-ج)، وتحديث المتوسط كل يومين بعد ذلك.
ملاحظة: DRG الصدر أيضا يمكن أيضا أن تكون مثقف بهذا البروتوكول، إذا كانت قد جمعت من العمود الفقري والصدر.
3-تعداء siRNA NPFFR2 في خلايا DRG
- أداء تعداء من NPFFR2 siRNA والتحكم في siRNA وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: سوف تحتاج إلى البروتوكول إلى تكييف إذا كان مختلفاً عن ذلك الذي كنا الكاشف تعداء المختارة (انظر الجدول للمواد). - في يوم 3 بعد طلاء الخلية، تغيير المتوسط إلى متوسط خالية من مصل قبل الحار 0.5 مل واحتضان الرسم في 37 درجة مئوية CO2 حاضنة ح 1.
- إضافة 50 نانومتر siRNA (في 1 ميليلتر خالية رناسي المياه) إلى 12.5 ميليلتر المتوسط خالية من المصل.
- إضافة كاشف تعداء ميليلتر 2.5 إلى 10 ميليلتر المتوسطة خالية من المصل.
- مزيج الحل من حل الخطوات 3.3 و 3.4 قبل "الماصة؛"، واحتضان هذا تعداء المختلطة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة حل تعداء في لوح واحد 24-البئر الذي يحتوي على الرسم ومزج الحل مع المتوسطة بالهز لطيف.
ملاحظة: ينبغي نشر حلول تعداء متعددة في نفس الوقت إذا كانت الآبار متعددة بحاجة إلى أن تكون ترانسفيكتيد. - احتضان الرسم في 37 درجة مئوية CO2 حاضنة ح 6.
- إضافة 0.5 مل/جيدا من الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 20% مصل بقرى الجنين وبيروفات صوديوم 100 مم x 1 البنسلين/ستربتوميسين في 1 × دميم-F12، بالإضافة إلى 10 ميكرون ارا-C و 100 نانوغرام/مليلتر ستحل، في لوحة 24-جيدا.
- احتضان الرسم في 37 درجة مئوية CO2 حاضنة لآخر ح 66 (تحديث المتوسطة في 48 ساعة).
4-الإفراج عن أجهزة الإرسال العصبية من خلايا الرسم الأساسي
- في يوم 6 بعد أن تم مطلي الخلايا (ح 72 بعد تعداء siRNA)، تغيير المتوسطة الثقافة إلى 200 ميليلتر المتوسطة خالية من المصل، واحتضان الخلايا في حاضنة2 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أضف 1 ميليلتر التحفيز ملامسة ولطف مزيج وسائل الإعلام التي بيبيتينج. احتضان الطبق في 37 درجة مئوية CO2 حاضنة للوقت المحدد.
ملاحظة: في هذه المقالة، الخلايا المستزرعة حفز مع مؤثر NPFFR2، دنبا (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2، 5 نمول)، عن ح 1. - جمع المتوسطة الثقافة من صحن الثقافة وأجهزة الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لإزالة أية شوائب مع وقف التنفيذ.
- جمع المادة طافية الطرد المركزي وتمييع العينات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، حسب الحاجة. الاعتداء مستويات العصبية مع مجموعات إنزيم المناعة (تقييم الأثر البيئي).
ملاحظة: هنا، supernatants كانت المخفف 1: 100 قبل تحليل مستوى CGRP. وكان لا تضعف المادة طافية قبل تحليل مستوى sp.
5-كجرب وتقييم الأثر البيئي SP
- تحليل العينات فورا وفقا لبروتوكول كجرب أو تقييم الأثر البيئي SP طقم الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: تتنوع البروتوكول تبعاً لمجموعة المواد المستخدمة. - شطف الآبار CGRP تقييم الأثر البيئي 5 مرات مع الغسيل المخزن المؤقت ضمن هذه المجموعة.
- إضافة 100 ميليلتر العينات مع 100 ميليلتر CGRP مكافحة أستيلكولينستراز (وجع) التتبع في آبار CGRP تقييم الأثر البيئي، وإضافة 50 ميليلتر عينات، 50 ميليلتر SP مكافحة وجع الراسم و 50 ميليلتر SP مكافحة antiserum في الآبار SP تقييم الأثر البيئي.
- ختم الآبار كجرب وليرة سورية مع الأفلام البلاستيكية التي يتم توفيرها ضمن المجموعات.
- احتضان الآبار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الآبار 5 مرات مع كجرب أو حزمة الخدمة SP يغسل المخزن المؤقت وإزالة جميع الحل المتبقي من الآبار.
- إضافة كاشف 200 ميليلتر Ellman في آبار كجرب أو SP التي يتم توفيرها ضمن مجموعات تقييم الأثر البيئي المقابلة.
- احتضان آبار كجرب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واحتضان الآبار ليرة سورية لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حماية الآبار من الضوء لفحوصات على حد سواء.
- قراءة اللوحات في الطول الموجي 414 نيوتن متر وحساب النتائج وفقا لتقييم الأثر البيئي الأداة المقابلة.
ملاحظة: تجنب لمس الجزء السفلي من الآبار باليد طوال الوقت وتنظيف البقع المياه من أسفل جيدا بتنظيف مناديل قبل إضافة كاشف Ellman العدسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا العصبية DRG القطني الفئران، مثقف في صفيحة 24-جيدا، كانت تزرع في الثقافة المتوسطة مع ج ارا إضافية لكبح انتشار الخلايا الدبقية وستموت لدعم نمو الخلايا العصبية. مورفولوجية المعيشة لوحظ الخلايا DRG. كما هو موضح في الشكل 3، تعلق على الجزء السفلي من الطبق في يوم 1 الجسم الخلية من خلية واحدة والمحددة للمراقبة. وتم رصد نمو محور عصبي من يوم 1 – 3. الخلايا الدبقية تكرار وتوسيع نطاق العمليات لتطويق الجسم خلية من الخلايا العصبية الحسية. كان الملون بروتين CGRP في ثقافة أخرى، تكشف عن شكل الخلايا العصبية. في الشكل 4، يظهر تلطيخ بروتين CGRP في السيتوبلازم ومحاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية. وتتميز مورفولوجيس النووية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية عندما ملطخة DAPI. الخلايا العصبية يكون نواة أكبر حجماً وأكثر دائرية من الخلايا الدبقية. وعلى سبيل المقارنة، النواة لإطلاق أكثر بيضاوية الشكل (الشكل 4 باء).
مؤثر NPFFR2 انتقائية، دنبا، كان يستخدم لحفز الإفراج عن كجرب و sp. وعلاوة على ذلك، تم اختبار اعتماد الإصدار العصبي حفزت دنبا على NPFFR2 من الخلايا ترانسفيكتينج مع NPFFR2 siRNA. NPFFR2 تم transfected siRNA siRNA أو التحكم في خلايا الرسم الأساسي ح 72 قبل العلاج مؤثر. وتم علاج الخلايا DRG مع دنبا (نمول 5) ح 1 والإفراج عن كجرب وليرة سورية تم قياسه بواسطة مجموعات منفصلة في تقييم الأثر البيئي. محاكاة للرسم مع دنبا زيادة مستوى CGRP وليرة سورية في وسائل الإعلام (الشكل 5 أ، ب). ومع ذلك، كان تحول دون فقط الناجمة عن دنبا CGRP الإفراج عن بالتعبير عن siRNA NPFFR2 في الخلايا المستزرعة من الرسم. تستخدم هنا مع إذن22النتائج هو موضح في الشكل 5 وتم تعديلها من منشور سابق.
رقم 1: رسومات تخطيطية لتجهيز الأنسجة. الرسم القطني جمعت من 3 أسبوع الفئران. (أ) يتم الإشارة إلى المواقف التي ينبغي أن تستخدم فيها المقصلة لقطع الحيوان بخطوط منقطة. (ب) إزالة الجذع الظهرية مع الجلد وترد مواقع الرسم القطني (من المستوى 1-L6) (ج). ويمثل الإدراج في الرسم، وتوصيل الألياف (التي يشار إليها بالأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المعدات الخاصة اللازمة لعزل الثقافات الأولية DRG. (أ) الأدوات الجراحية المستخدمة في تحصيل الرسم. من اليسار إلى اليمين: () تشريح المقص (كبير)، (ب) عظم القص الملقط، (ج) تشريح المقص (الصغيرة)، (د، ه) نقطة ملاقط، ومقص الصغرى (f). ماصة باستور العادية (ب) وماصة باستور مصقول اللهب. "" تشير إلى الداخل القطر ماصة باستور العادية، و "ب" تشير إلى الداخل قطر ماصة باستور مصقول اللهب. ب/a ≒ 0.9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مورفولوجية معيشة الخلايا DRG. وراقب يعيش DRG خلايا مجهرية. تظهر الخلايا (A) يوم واحد بعد البذر، (ب) يومين بعد البذر، و (ج) ثلاثة أيام بعد البذر. تشير الأسهم إلى الخلايا العصبية ورؤوس أسهم تشير إلى إطلاق. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: Immunostaining مثقف DRG الخلايا. وكانت الزنزانات DRG إيمونوستاينيد مع الأجسام المضادة كجرب المضادة لإظهار الخلايا العصبية، و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لنواة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. وأعرب البروتين (أ) CGRP في الهيئات الخلايا العصبية الحسية وألياف إكسون. (ب) نويات الخلايا العصبية وإطلاق كانت ملطخة DAPI. ممزوج (ج) صورة من أ وب سهم يشير إلى خلية والسهم يشير إلى إحدى خلايا الدبقية. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الإفراج عن أجهزة الإرسال العصبية من استزراع الخلايا DRG. مؤثر NPFFR2 انتقائية، دنبا، استخدمت لحفز الإفراج عن كجرب وليرة سورية من الثقافات DRG. تم التحقق من اعتماد الإصدار العصبي على NPFFR2 بالخلايا ترانسفيكتينج مع NPFFR2 siRNA. (أ و ب) تم transfected الخلايا "بعد الرسم" مع NPFFR2 siRNA أو عدم استهداف التحكم siRNA (ح 72) وطبق دنبا (نمول 5) ح 1 للحث على الإفراج عن كجرب وبيانات sp. يتم التعبير عنها ك ± يعني الخطأ المعياري للوسط (SEM) وتم تحليلها بواسطة t اختبارات wo-طريقة تحليل التباين (ANOVA) مع بونفيروني وظيفة المخصصة . ف < 0.01، * * *ف < 0.001؛ بالمقارنة مع عناصر التحكم المركبة المقابلة (N = 12 كل مجموعة). تم تعديل لوحات A و B من لين et al. 22 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المادة، نبدي جمع وإنزيم-الانفصال، وثقافة الفئران القطني DRG. مع دعم نيوروتروفيك من ستموت، مد محاور عصبية من الخلايا العصبية الرسم في غضون 3 أيام بعد البذر الخلية. محاور عصبية طويلة كانت واضحة يمكن ملاحظتها بعد الخلايا كانت الملون لبروتين CGRP، التي يتم توليفها في سوما الخلية ونقلها على طول الألياف إكسون. عمليات الخلايا الأقمار الصناعية أيضا تمديد، تسمح هذه تقسيم الخلايا الدبقية بمحاصرة الخلايا العصبية في غضون أيام. الخلايا الأولية DRG نمت بموجب هذا البروتوكول مناسبة لإجراء تحقيقات في الآليات الخلوية التي تنظم الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن حفز الإفراج عن neuropeptides، كجرب، وسورية، من الخلايا العصبية DRG مثقف بمؤثر NPFFR2 انتقائية، دنبا. NPFFR2 مستقبلات المشابهة نبف وتم الإبلاغ عن المشاركة في الألم الإحساس وتنظيم مسارات22،23. كذلك تم التحقق من NPFFR2-الاعتماد على كجرب وليرة سورية بالإفراج عن طريق استخدام NPFFR2 siRNA.
الثقافات الرسم تحتوي على كل من الخلايا العصبية الحسية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية تقديم الدعم الأيضية للخلايا العصبية، والحفاظ على الوظائف العصبية9،10. في الصور إيمونوستينينج، فمن السهل تحديد الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، حيث تتشكل على الأنوية بشكل مختلف (تظهر في الشكل 4B). وجود خلايا الأقمار الصناعية في الطبق الثقافة قد تصبح مشكلة إذا كان هناك مطلب تجريبية للتمييز بين الوظيفة المحددة للخلايا العصبية وإطلاق. على سبيل المثال، أنه لا يمكن إنكار أن الخلايا الأقمار الصناعية تشارك في تطوير وصيانة ألم11،24، وفي بعض الدراسات، أعمال الخلايا العصبية والخلايا الدبقية سيكون من الصعب التمييز بين الثقافات الرسم باستخدام.
في هذا البروتوكول، وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي تتطلب الحذر. أولاً، حيث جمعت في الرسم خارج هود الصفحي، إضافي الحرص أثناء عملية جمع الأنسجة لتجنب تلوث الخلية. وينبغي أن تكون هناك حاجة لإنشاء مساحة عقيمة، مثل في غرفة العمليات جراحية بشرية ولكن صك التعقيم وتنظيف مساحة تشغيل ضرورية. نصائح لتجنب التلوث تشمل حفظ أدوات معقمة في الحقيبة التعقيم عندما لا تكون قيد الاستعمال، وتجنب لمس أي عناصر غير ضرورية. أيضا، يمكن أن يتم تلويث الكائنات الحية على الفراء أنه يجوز التمسك جذع الجسم الفئران أو القفازات. على هذا النحو، يجب إزالة الفراء وثيابهم قفازات بالتنظيف باستخدام الإيثانول 75%. كما أنها مفيدة للمشغل على ارتداء قناع جراحي لمنع نقل الكائنات الحية من التنفس أو اللعاب. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تظل مغلقة في جميع الأوقات الطبق 35 ملم وفتحه إلا عند وضع تشريح الرسم داخل. من المهم أن استبدال طبق 35 ملم مع طبق جديد قبل إنزيم الهضم. خلال إنزيم الهضم، لا تمتد فترة الحضانة، منذ الهضم المفرط قد تلف الخلايا العصبية. تأكد قبل الحارة التربسين أدتا إلى 37 درجة مئوية من أجل تحقيق كفاءة الهضم المناسبة. سيتم خفض الكفاءة هائلة في درجات الحرارة المنخفضة، وسيكون من الصعب تحقيق تعليق خلية واحدة عندما تريتوراتينج الرسم واسطة ماصة باستور مصقول اللهب. سوف السلس الفوهة لهب التلميع الماصة والحيلولة دون إصابة الخلايا العصبية على حافة زجاج حادة. لكن الانهاك ماصة بلهب سيجعل الداخل سوف يصبح من الصعب على تمر عبر حل قطرها صغير جداً، والتي تحتوي على الأنسجة أو الخلايا. قد يسبب هذا القطر انخفاض أيضا فقاعات كثيرة إلى نموذج أثناء مرحلة تريتوريشن، خفض كبير لعدد الخلايا العصبية DRG التحصيل. وأخيراً، ينبغي التعامل مع الثقافات DRG برفق في جميع الأوقات، لا سيما عند تغيير العلاج من تعاطي المخدرات أو متوسطة أو المنفذ.
الخلايا العصبية DRG يقال أن الأكثر استخداماً الخلايا العصبية مثقف الابتدائي12. يمكن أن تستخدم مجموعة متنوعة من الدراسات المختلفة، بدءاً من الأحياء الكهربية أو خلية لاستكشاف الوظائف الفسيولوجية أو المرضية للخلايا العصبية الحسية. القيد الرئيسي الثقافات الرسم الأساسي أنها ليست مناسبة تماما للفرز الفائق. عدد الخلايا التي يمكن أن تجمع من الرسم من الفئران واحدة محدودة، والخلايا العصبية غير قادر على تكرار في الثقافة. بسبب عدد الخلايا محدودة، قد وضعت عدة خطوط خلايا هيبريدوما DRG أو خطوط الخلايا العصبية DRG مخلدة ليحل محل19،،من18الثقافات الابتدائي20. بيد أن ملامح التعبير البروتين الرسم خطوط الخلايا قد لا تكون نفس الرسم الأصلي، وهكذا، كل نموذج النظام يحتاج إلى التحقق بعناية. وبصرف النظر عن عزل الخلايا في المختبر، بذلت الفئران الجنينية أو الولدان DRG الخلايا العصبية المتاحة تجارياً. ولذلك، قد يكون الشراء من مصادر تجارية بديلاً مجديا للثقافات DRG الطازجة.
وقد استخدمت الثقافات الرسم الأساسي لسنوات عديدة كأداة قيمة تجريبية التي اعتمد معظمها في الدراسات المتعلقة بالألم. من غير المرجح هذا النظام النموذجي لتحل محلها في المستقبل القريب. مع الخلايا العصبية DRG ذات نوعية جيدة، يمكن الحصول على العلماء مستقرة واستنساخه من نتائج تفيد العديد من مجالات دراسة علم الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور م. Calkins لتحرير اللغة الإنجليزية. وكان يؤيد هذا العمل تشانغ Gung التذكاري مستشفى (CMRPD1F0482) وجامعة الأمنيون تشانغ، ومركز بحوث الشيخوخة الصحية (EMRPD1G0171) ووزارة العلوم والتكنولوجيا (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
