Summary
Dorsalrotsganglier ganglier (DRG) primära kulturer används ofta att studera fysiologiska funktioner eller patologi-relaterade händelser i sensoriska nervceller. Här visar vi användningen av ryggradens DRG kulturer att identifiera frisättningen av signalsubstanser efter neuropeptid FF receptorn typ 2 stimulering med en selektiv agonist.
Abstract
Dorsalrotsganglier (DRG) innehåller cellen organ sensoriska nervceller. Denna typ av neuron är pseudo unipolär, med två axoner som innerverar perifera vävnader, såsom hud, muskler och viscerala organ, samt spinal dorsala hornen av centrala nervsystemet. Sensoriska nervceller överföra somatisk sensation, inklusive beröring, smärta, termisk och proprioceptiva förnimmelser. DRG primära kulturer används därför allmänt att studera cellulära mekanismer för nociception, fysiologiska funktioner sensoriska nervceller och neural utveckling. De odlade nervcellerna kan tillämpas i studier elektrofysiologi, signaltransduktion, neurotransmitterfrigöraren eller kalcium imaging. Med DRG primära kulturer, forskare kan kultur dissocierade DRG nervceller för att övervaka biokemiska förändringar i singel eller flera celler, att övervinna många av begränsningarna som är associerade med in-vivo -experiment. Jämfört med kommersiellt är tillgängliga DRG-hybridoma cellinjer eller förevigade DRG neuronala cellinjer, sammansättning och egenskaper hos de primära cellerna mycket mer liknar sensoriska nervceller i vävnad. På grund av det begränsade antalet odlade DRG primära celler som kan isoleras från ett enskilt djur, är det dock svårt att utföra hög genomströmning skärmar för läkemedel inriktade studier. I nuvarande artikel beskrivs förfaranden för DRG samling och kultur. Dessutom visar vi behandling av odlade DRG celler med en agonist av neuropeptid FF receptorn typ 2 (NPFFR2) för att inducera frisättning av peptid signalsubstanser (kalcitonin gene-relaterad peptid (CRGP) och substans P (SP)).
Introduction
De cellen organ sensoriska nervceller som ingår i DRG. Dessa nervceller är pseudo unipolär och innerverar både perifera vävnader och centrala nervsystemet. Perifera nervändar av sensoriska nervceller finns i muskler, hud, viscerala organ och ben, bland andra vävnader. De sänder perifera sensation signaler till nerv ändelser i spinal dorsala hornen och signaler som sedan överförs till hjärnan via olika stigande vägar av somatisk sensation1,2. Somatisk sensation gör att kroppen att känna (dvs, beröring, smärta och termisk förnimmelser) och uppfattar rörelse och rumslig orientering (proprioceptiva förnimmelser)1,3. Det finns fyra underklasser av primära afferenta axoner, inklusive grupp I (Aα) fibrer som svarar på proprioception av skelettmuskulaturen, grupp II (Aβ) fibrer som svarar på mekanoreceptorer i huden, och grupp III (Aδ) och grupp V C fibrer som reagerar på smärta och temperatur. Endast de C-fibrerna är unmyelinated, medan resten är myeliniserade till olika grader.
Nociceptorer är primära sensoriska nervceller, som aktiveras av skadliga stimuli (mekanisk, termisk och kemisk stimulering) som bär risken för vävnadsskada. Dessa nervceller består av myeliniserade Aδ-fibrer och unmyelinated C fibrer1,4. Den Aδ-fibrer express receptorerna för nervtillväxtfaktor (NGF, trkA receptor), CGRP och SP. De C-fibrerna klassificeras som antingen peptiderga och icke-peptiderga C-fibrer. Däremot, express de icke-peptiderga C-fibrerna receptorerna för gliaceller neurotrofa faktorn (GFR GDNF och RET-receptorer), isolectin IB4 och ATP-gated ion kanal subtyp (P2X3)5,6,7. Nociceptorer kan kännetecknas av uttrycket av jonkanaler och aktiveras av neurotrofa faktorer, cytokiner, neuropeptider, ATP eller andra kemiska föreningar8. Vid stimulering befrias signalsubstanser, inklusive CGRP, SP och glutamat från sensoriska neuron terminaler i spinal dorsala horn överföra nociceptiva signaler2. DRG är inte bara består av nervceller, men också innehåller satellit gliaceller. Satellit celler omger sensoriska nervceller och ge support för mekaniska och metabola9,10. Intressant, finns det en växande mängd bevis som visar att satellit gliaceller i DRG kan vara inblandade i regleringen av smärta sensation11.
Sensoriska nervceller har rapporterats vara mest ofta Använd primära neuronala celler12 och har utnyttjats för elektrofysiologi, signaltransduktion och signalsubstansen release studier. De används också ofta att utforska de cellulära mekanismerna av neuronal utveckling, inflammatorisk smärta, neuropatisk smärta, känsla i huden (som kliar) och axon utväxt12,13,14,15. DRG primära kulturer kan vara odlade som dissocierade nervceller att bedöma biokemiska förändringar i en eller flera celler, så att forskare att utföra studier som inte kan utföras i experimentella ämnen. Nyligen, DRG odlades framgångsrikt från mänskliga organdonatorer som kraftigt skulle gynna translationell forskning16. Däremot, kan sensoriska nervceller också vara odlade som DRG explants. De DRG bladsticklingar bevara den ursprungliga vävnad arkitekturen av nervceller, inklusive Schwann celler och satellit gliaceller, och är särskilt användbara för att studera interaktioner mellan neuronala och icke-neuronala celler17. DRG primära kulturer kan förberedas enkelt inom 2,5 h. Cell sammansättning och egenskaper är starkt reflekterande av källan DRG, och som sådan, specifika DRG (ländryggen eller bröstkorg DRG) kan samlas in enligt experimentella krav. Kulturer av embryonala och neonatal DRG nervceller kräver NGF att överleva och framkalla axon utväxt, men kulturer av vuxen nervceller kräver inte tillsats av neurotrofa faktorer till media12,17. Det finns också kommersiellt tillgängliga DRG-hybridoma cellinjer som ND7/23 och F11, som inte kräver användning av försöksdjur. Men avsaknaden av transient receptor potential cationen kanal underfamilj V medlem 1 (TRPV1) uttryck (en viktig markör för små sensoriska nociceptiva neuroner) och inkongruenta gen uttryck profiler begränsa deras program18. Nyligen, förevigade DRG neuronala cell linjer har hämtats från råtta (50B11)19 och mus (MED17.11)20, som är lämpliga för användning i hög genomströmning skärmar för läkemedel inriktade studier. Genuttryck profilering för dessa cellinjer har emellertid ännu som ska utföras. Således pågår de validering experiment jämföra dessa förevigade celler till sensoriska nervceller fortfarande.
NPFFR2 syntetiseras i DRG och flyttad till sensoriska nerver terminaler i spinal dorsala horn21. I denna artikel ger vi ett protokoll för odling ländryggen DRG celler och behandla dem med en agonist av NPFFR2 att inducera frisättning av signalsubstanser, CGRP och SP. Beroendet av NPFFR2 ytterligare provas med NPFFR2 små störande RNA (siRNA), som kan vara transfekterade till de odlade DRG-cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs häri som använder försöksdjur godkändes av institutionella djur vård och använda kommittén (IACUC) av Chang Gung universitet (KGE 13-014).
1. samla in ländryggen DRG från experimentell råttor
- Använd 2 till 3 veckor gamla Sprague-Dawley (SD) råttor för ländryggen DRG samling.
Obs: DRG nervceller som samlats in från råttor över 4 veckors ålder växer inte bra under de odlingsbetingelser som beskrivs häri. - Sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav.
- Söva råtta med en 1:1 blandning av Tiletamin och zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneal injektion (IP)) och vänta tills djuret visar ingen mul-återkallande svar i en tå-nypa testet.
Obs: Olika anestesi strategier kan användas framgångsrikt i detta protokoll. - Offra råtta genom halshuggning med en kommersiell giljotin.
- Använda giljotinen för att isolera kroppen stammen av råtta mellan framben och lårbenet. Se figur 1A för ett diagram i regionen att samlas.
Obs: Den kaudala skära linjen bör bara rostralt om lårbenet. Den lumbala L6-DRG kommer vara censurerade om snittet webbplatsen är för hög i ryggraden. - Skär längs bröstbenet och ta bort alla organ/vävnader med dissektion sax (figur 2A-en).
- Skär längs sidan av stammen att samla ryggdelen av råttan och ta bort skinnet. Se figur 1B för ett fotografi av dissekerade dorsala stammen.
- Förbereda vävnaden på is innan du samlar in DRG. Rengör den päls och blod från handskar och sterilisera dem med 75% etanol innan du fortsätter till nästa steg.
- Ta bort de muskler som täcker ländryggen. Först gör två snitt längs sidorna av ryggrads-kolonnen (vänster och höger) och en laterala snittet att markera rostralt omfattningen av ländryggen. Ta sedan bort dorsala musklerna i ryggraden med ben skärande pincett (figur 2A-b).
- Ta bort den dorsala delen av kotorna med ben skära tång och exponera ryggmärgen.
- Avlägsna ryggmärgen med dissektion sax (figur 2A-c) och pincett (figur 2A-d).
- Identifiera den lumbala DRG genom att räkna ryggkotor från revbenet (bröstkorg kotan 13). Se figur 1 c för ett diagram av Kotor positioner.
- Samla in de bilaterala ländryggen DRG (L1-L6) med micro-sax (figur 2A-f) i en 35 mm kultur maträtt med 2 mL iskallt serumfritt medium. Ta bort den neuronala fibrer (som anges i figur 1 c) från att ansluta DRG och sedan överföra det till kultur skålen att förbättra renheten av kulturerna.
Obs: Den insamlade DRG kan hållas i medium på is för ca 1 h. Under tiden kan flera råttor bli euthanized för att skapa en större pool av DRG.
2. primär kultur råtta virke DRG
Obs: Följande steg bör utföras i en LAF.
- Förbereda odlingsmedium som innehåller 10% fetalt bovint serum, 100 mM natrium pyruvat och 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12.
- Kappa i cell-kultur behandlas 24-väl tallrik med 200 µg/mL poly-L-lysin för 2 h och sedan tvätta med steriliserat vatten.
- Preinkubera kultur skålen med 1 mL odlingsmedium i en 37 ° C CO2 inkubator före användning i minst 30 min.
- Överföra DRG-innehållande 35 mm skålen i en laminär huva och tvätta DRG med serumfritt medium 3 gånger med pipett.
Obs: Utsidan av skålen bör rengöras med 75% etanol innan du överför till huven. 35 mm skålen kan innehålla DRG från ett antal råttor (Detta beror på kraven på experimentell design). - Flytta DRG (från en enda råtta eller kombinerade från flera råttor) till en ny 35 mm kultur maträtt, som innehåller 2 mL av kollagenas typ IA (1 mg/mL i serumfritt medium) med steril pincett (figur 2A-e).
Obs: Kollagenas lösningen bör steriliseras genom passering genom ett 0,22 µm spruta filter. - Smälta DRG i kollagenas lösningen i en 37 ° C CO2 inkubator för 30 min.
- Ta bort kollagenas lösningen och tvätta de DRG 3 gånger i 2 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS).
Obs: Det kan finnas kvarstående fibrer eller vävnader som lossnar DRG i lösningen. Ta bort dem med pipett med tvättlösningen. - Tillsätt 2 mL värmas före 0,05% trypsin-EDTA i DRG-innehållande 35 mm maträtt och smälta DRG i en 37 ° C CO2 inkubator för 30 min.
- Överföra de 2 mL av DRG-innehållande lösning till en 15 mL centrifugrör med glas pipett.
Obs: DRG kan hålla sig till glas pipetten så detta steg bör utföras med omsorg. DRG förlust kan undvikas genom att hålla den DRG-innehållande lösningen i den spetsiga änden av glas pipett (ca 0,5 mL) och överföra lösningen i centrifugröret långsamt men utan paus. - Centrifugera lösningen vid 290 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lägga till en annan 2-mL serumfritt medium för att resuspendera DRG.
- Upprepa steg 2.10 2 gånger men förändring i serumfritt medium till pre värmde odlingsmedium på förra gången.
- Manuellt pulverisera den DRG cirka 60 gånger med en flamma-polerad Pasteur-pipett (längd 230 mm och spets huvud inre diameter 1 mm). Se figur 2B för ett fotografi jämföra öppningen av en flame-polerad Pasteur-pipett till en icke-polerad pipett.
Obs: Insidan diameter av flame-polerad Pasteur pipetten är ungefär 10% mindre än kontroll pipetten och insidan av den spetsiga änden bör vara smidigare. Var noga med att inte skapa bubblor när triturating cellerna. - Ta bort poly-L-lysin-coated skålen från CO2 inkubatorn. Aspirera ruvade odlingssubstratet från skålen och utsäde dissocierade cellerna på bestruket skålen.
- Utsäde DRG cellerna från en råtta (bilaterala samling från L1-L6, för 12 totala DRG) i fyra brunnar i en 24-bra platta. Det finns cirka 5 x 104 celler i ett väl 24-bra platta.
Obs: Denna densitet är lämplig för detektion av den släppta CGRP eller SP och även lämplig för immunfärgning. För Western blot eller RNA-extraktion, utsäde DRG cellerna från en råtta (bilaterala L1-L6) i en brunn 6-bra platta. - Ersätta odlingssubstratet följande dag med tillägg av 10 µM cytarabin (Ara-C) och 100 ng/mL NGF och uppdatera mediet varje två dagar därefter.
Obs: Den bröstkorg DRG också kan också vara odlade av detta protokoll, om de har samlats in från bröstkorgens ryggrad.
3. transfection av NPFFR2 siRNA i DRG celler
- Utföra transfection av NPFFR2 siRNA och styra siRNA enligt tillverkarens protokollet.
Obs: Protokollet kommer att behöva anpassas om valt transfection reagenset är annorlunda än den vi använde (se Tabell för material). - På dag 3 efter cell plätering, ändra mediet till 0,5 mL före varma serumfritt medium och inkubera i DRG i en 37 ° C CO2 inkubator för 1 h.
- Tillsätt 50 nM siRNA (i 1 µL RNase-fritt vatten) till 12,5 µL serumfritt medium.
- Tillsätt 2,5 µL transfection reagens till 10 µL serumfritt medium.
- Blanda lösningen från steg 3.3 och 3.4 av pipett, och inkubera detta blandade transfection lösning under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg till transfection lösningen i en DRG-innehållande 24-väl plattan och blanda lösningen med medium genom mild omskakning.
Obs: Flera transfection lösningar bör distribueras samtidigt om flera brunnar behöver vara transfekterade. - Inkubera i DRG i en 37 ° C CO2 inkubator för 6 h.
- Tillsätt 0,5 mL/väl av odlingsmedium som innehåller 20% fetalt bovint serum, 100 mM natrium pyruvat och 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12, med tillägg av 10 µM Ara-C och 100 ng/mL NGF, i 24-väl plattan.
- Inkubera i DRG i en 37 ° C CO2 inkubator för en annan 66 h (uppdatera mediet vid 48 h).
4. frisättning av signalsubstanser från primära DRG celler
- Dag 6 efter celler var förgylld (72 h efter siRNA transfection), ändra på odlingsmediet till 200 µL serumfritt medium och inkubera cellerna i en 37 ° C CO2 inkubator för 30 min.
- Lägg till 1 µL stimulering kemikalie och blanda försiktigt media genom pipettering. Inkubera skålen i en 37 ° C CO2 inkubator för den angivna tiden.
Obs: I denna artikel, de odlade cellerna stimuleras med den NPFFR2-agonist, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), för 1 h. - Samla in odlingssubstratet från kultur skålen och centrifugera vid 5 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C att ta bort eventuella suspenderade föroreningar.
- Samla in supernatanten från centrifugeringen och späd ut proverna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), som behövs. Assay nivåerna av signalsubstanser med enzyme immunoassay (EIA) kit.
Obs: Här, supernatanterna var utspädd 1: 100 innan analysera nivån av CGRP. Supernatanten var inte spädas före analysera nivån på SP.
5. CGRP och SP EIA
- Analysera proverna omedelbart enligt CGRP eller SP EIA kit tillverkarens protokollet.
Obs: Protokollet varierar beroende på den utrustning som används. - Skölj CGRP EIA brunnarna 5 gånger med tvättbuffert medföljer i kitet.
- Tillsätt 100 µL prov med 100 µL anti-CGRP acetylkolinesteras (AChE) tracer i CGRP EIA brunnar, och tillsätt 50 µL prov, 50 µL anti-SP värk tracer och 50 µL anti-SP antiserum i SP EIA brunnar.
- Försegla CGRP och SP brunnarna med plastfilm som levereras inom kit.
- Inkubera brunnarna över natten vid 4 ° C.
- Tvätta brunnarna 5 gånger med CGRP eller SP tvätta buffert och ta bort alla återstående lösningen från brunnarna.
- Tillsätt 200 µL Ellmans reagens i CGRP eller SP brunnar som levereras inom de motsvarande EIA-kit.
- Inkubera CGRP brunnarna i 30 min i rumstemperatur och inkubera SP brunnarna under 90 minuter vid rumstemperatur. Ljuskänsligt brunnarna för båda analyser.
- Läs plattorna vid våglängden 414 nm och beräkna resultaten enligt motsvarande EIA instrument.
Obs: Undvik att vidröra botten av brunnarna för hand hela tiden och rengör vattenfläckar från väl botten av linsen rengöringsdukar innan du lägger den Ellmans reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rat ländryggen DRG nervceller, odlade i en 24-well platta, odlades i odlingsmedium med ytterligare Ara-C att hämma glial cell spridning och NGF att stödja neuronal tillväxt. Morfologi av levande DRG celler observerades. I figur 3visas cellkroppen av en enda neuron var fäst på undersidan av en maträtt på dag 1 och för observation. Axon tillväxt var övervakas från dag 1 – 3. Gliacellerna dubblerat eller utökat processer att omge cellkroppen av sensoriska neuron. I en annan kultur, var CGRP protein färgade för att avslöja formen av nervceller. I figur 4visas CGRP protein färgning i cytoplasman och axoner av sensoriska nervceller. De nukleära morfologier neuron och gliaceller är distinkta när fläckade DAPI. Nervceller har en större och mer avrundad kärna än gliaceller. Som jämförelse är kärnorna av glia mer ovala i formen (figur 4B).
Den selektiva NPFFR2 agonist, dNPA, användes för att stimulera frisättning av CGRP och SP. Dessutom testades av dNPA-stimulerad neurotransmitterfrigöraren beroende av NPFFR2 av transfecting celler med NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA eller kontroll siRNA var transfekterade in i primära DRG cellerna 72 h före agonist behandling. DRG celler behandlades med dNPA (5 nmol) för 1 h och frisläppandet av CGRP och SP mättes genom separata EIA kit. Simulering av DRG med dNPA ökade nivån av CGRP och SP i media (figur 5A, B). Endast dNPA-inducerad CGRP utgivningen hämmades dock av uttryck av NPFFR2 siRNA i odlade DRG-celler. Resultaten visas i figur 5 ändrades från en tidigare publikation och används här med tillstånd22.
Figur 1: vävnad bearbetning diagram. Ländryggen DRG samlas från 3 veckor gamla råttor. (A) de positioner där giljotinen bör användas för att skära djuret indikeras av streckade linjer. (B) dorsala stammen med hud tas bort och (C) platserna av ryggradens DRG (från L1-L6) visas. Skäret representerar DRG och anslutande fibrerna (som anges av pilarna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: särskild utrustning behövs för att isolera DRG primära kulturer. (A) kirurgiska instrument som används i insamling av DRG. Från vänster till höger: (en) dissektion sax (stor), (b) ben skära tång, (c) dissektion sax (liten), (d, e) punkt pincett, och (f) mikro-sax. (B), en vanlig Pasteur-pipett och en flamma-polerad Pasteur-pipett. ”a” betecknar insidan diameter av regelbundna Pasteur-pipett och ”b” betecknar insidan diameter på den lågan-polerad Pasteur-pipetten. b / a ≒ 0,9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: morfologi av levande DRG celler. Levande DRG celler övervakades av mikroskopi. Celler visas (A) en dag efter sådd, (B) två dagar efter sådd, och (C), tre dagar efter sådd. Pilarna anger neuron och pilspetsar indikerar glia. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: immunfärgning av odlade DRG celler. DRG celler var immunostained med anti-CGRP antikropp att Visa nervceller, och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för atomkärnor av neuron och gliaceller. (A), CGRP protein uttrycktes i sensoriska neuron cell organ och axon fibrer. (B) kärnor i nervceller och glia var fläckade av DAPI. (C) sammanfogad bild från A och B. pil anger en neuron och pilspets anger en glial cell. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: frigöraren av signalsubstanser från odlade DRG cellerna. Den selektiva NPFFR2 agonist, dNPA, användes för att stimulera frisättning av CGRP och SP från DRG kulturer. Beroendet av neurotransmitterfrigöraren på NPFFR2 kontrollerades av transfecting celler med NPFFR2 siRNA. (A och B) efter DRG celler var transfekterade med NPFFR2 siRNA eller icke-targeting kontroll siRNA (72 h), dNPA (5 nmol) tillämpades för 1 h att inducera frisättning av CGRP och SP. Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) och analyserades av t Wo-vägs variansanalys (ANOVA) med Bonferroni post hoc tester. p < 0,01, ***p < 0,001; jämfört med motsvarande fordonets reglage (N = 12 per grupp). Paneler A och B har ändrats från Lin et al. 22 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel, vi visar insamling, enzym-dissociation och kultur av råtta ländryggen DRG. Med neurotrofa stöd från NGF extended axoner av nervceller som DRG inom 3 dagar efter cell sådd. Den utöka axoner var tydligt observerbara efter celler var målat för CGRP protein, som syntetiseras i den cellen soma och transporteras längs axonet fibrerna. Processerna för satellit celler också utvidgas, så att dessa avdelande gliaceller att omge nervceller inom dagar. De primära DRG-celler som odlas av detta protokoll är lämpliga för utredningar av de cellulära mekanismer som reglerar sensoriska nervceller. Här, stimulera vi frisättning av neuropeptider, CGRP och SP, från odlade DRG nervceller av en selektiv NPFFR2 agonist, dNPA. NPFFR2 är besläktat receptorn för NPFF och har rapporterats att delta i smärta känsla och förordning vägar22,23. NPFFR2-beroendet av CGRP och SP release verifierades ytterligare genom användning av NPFFR2 siRNA.
DRG kulturer innehålla både sensoriska nervceller och satellit gliaceller. Gliacellerna satellit ge metabola stöd till nervceller och upprätthålla neuronala funktioner9,10. I immunfärgning bilderna, är det lätt att identifiera neuron och gliaceller, eftersom deras kärnor är formade på olika sätt (Visa i figur 4B). Förekomsten av satellit celler i kultur skålen kan bli problematiskt om det finns en experimentell efterfrågan att skilja mellan den specifika funktionen av nervceller och glia. Till exempel, är det obestridligt att satellit celler är inblandade i utveckling och underhåll av smärta11,24, och i några studier, neuron och gliaceller agerande skulle vara svårt att skilja använder DRG kulturer.
I detta protokoll finns det några viktiga steg som kräver extra försiktighet. Först, eftersom DRG samlas utanför laminar huven, extra försiktighet iakttas under processen vävnad samling att undvika cell kontaminering. Man behöver inte skapa en steril utrymme, som i en mänsklig operationssal, men instrumentet sterilisering och en ren förarutrymme är viktiga. Tips för att undvika kontaminering inkluderar hålla de steriliserade instrument på sterilisering påsen när inte i använda och undvika beröring av alla onödiga saker. Kontaminerande organismer får också transporteras på päls som kan sticka till råtta kropp stammen eller handskar. Som sådan, bör päls och blodfläckar på handskar avlägsnas genom rengöring med 75% etanol. Det är också bra för operatören att bära en kirurgisk mask för att förhindra överföring av organismer från andedräkt eller saliv. Dessutom bör 35 mm skålen vara stängda vid alla tider och bara öppnas när utsläppande dissekeras DRG inuti. Det är viktigt att ersätta 35 mm skålen med en ny maträtt innan enzym matsmältningen. Under enzym matsmältningen, omfatta inte inkubationstiden, eftersom alltför matsmältningen kan skada nervceller. Se till att före värma den trypsin-EDTA till 37 ° C för att uppnå lämpliga matsmältningen effektivitet. Effektiviteten minskar dramatiskt i lägre temperaturer, och det blir svårt att uppnå en enda cellsuspension när triturating DRG med flame-polerad Pasteur-pipett. Lågan polering pipetten kommer jämna öppningen och förhindra skarpa glaskanten från skadade nervceller. Dock överhettning pipetten med låga gör insidan diameter för liten och vävnad - eller cell-innehållande lösning kommer att bli svårt att passera. Denna reducerad diameter kan också orsaka många bubblor bildas under sönderdelning, kraftigt minska antalet collectable DRG nervceller. Slutligen, DRG kulturer bör hanteras försiktigt hela tiden, speciellt när du byter medium eller utför läkemedelsbehandling.
De DRG nervcellerna uppges vara mest använda primära odlade neuronala celler12. De kan utnyttjas för en mängd olika studier, alltifrån elektrofysiologi eller cell biologi att utforska de fysiologiska eller patologiska funktionerna av sensoriska nervceller. Den största begränsningen av DRG primära kulturer är att de inte är lämpade för high-throughput screening. Antalet celler som kan samlas in från DRG på en enda råtta är begränsade, och nervceller inte kan duplicera i kultur. På grund av begränsad cell nummer, har flera DRG-hybridoma cellinjer eller förevigade DRG neuronala cellinjer utvecklats för att ersätta den primära kulturer18,19,20. Men protein uttryck profiler av DRG cellinjer kanske inte samma som den ursprungliga DRG och således varje modellsystem behöver kontrolleras noggrant. Bortsett från isolera cellerna i labbet, har råtta embryonala eller neonatal DRG nervceller gjorts kommersiellt tillgängliga. Köp från kommersiella källor kan därför ett lönsamt alternativ till nylagad DRG kulturer.
DRG primära kulturer har använts i många år som ett värdefullt experimentella verktyg som antas mestadels i smärta i samband med studier. Detta modellsystem är osannolikt att ersättas inom en snar framtid. Med god kvalitet DRG nervceller, kan forskare få stabila och reproducerbara resultat som gynnar många områden neurovetenskap studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. M. Calkins för engelska redigering. Detta arbete stöddes av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung universitetet, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) och ministeriet för vetenskap och teknik (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W.
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
