背根神经节分离与原代培养对神经递质释放的研究
Summary
背根神经节的原代培养常用于研究感官神经元的生理功能或病理相关事件。在这里, 我们展示了使用腰椎背根神经节的文化, 以检测神经递质的释放后神经元肽 FF 受体2型刺激与选择性激动剂。
Abstract
背根神经节包含感觉神经元细胞体。这类神经元是伪单极, 有两个轴突, 支配周围组织, 如皮肤, 肌肉和内脏器官, 以及中枢神经系统的脊髓背角。感官神经元传递躯体感觉, 包括触摸, 疼痛, 热, 和本体的感觉。因此, 根根背根培养被广泛用于研究伤害的细胞机制、感官神经元的生理功能和神经发育。培养神经元可用于电生理、信号传导、神经递质释放或钙成像等研究。与根背节的主要文化, 科学家可能培养分离的背节神经元, 以监测在单个或多个细胞的生物化学变化, 克服许多与体内实验相关的限制。与商用神经节-杂交瘤细胞系或永生化背节神经元细胞系相比, 原代细胞的组成和性质更类似于组织中的感觉神经元。然而, 由于受培养的背根细胞的数量有限, 可以从单一的动物分离, 很难为药物靶向研究进行高通量的屏幕。本文介绍了背根背根的收集和培养过程。此外, 我们展示了用神经肽 FF 受体2型 (NPFFR2) 激动剂对培养的背根节细胞进行治疗, 以诱导释放肽类神经递质 (降钙素基因相关肽 (CRGP) 和 P 物质 (SP))。
Introduction
感觉神经元的细胞体包含在根背根内。这些神经元是伪单极和支配的周围组织和中枢神经系统。感觉神经元的周围神经末端在肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼, 以及其他组织中发现.他们将周围的感觉信号传送到脊髓背角的神经末梢, 然后通过不同的躯体感觉1,2的提升通路将信号传送到大脑。躯体感觉使身体感觉 (即触摸, 疼痛和热感觉) 和知觉运动和空间方向 (本体感觉)1,3。有四个子类的初级传入轴突, 包括第一组 (Aα) 纤维, 对本体的骨骼肌肉, 第二组 (Aβ) 纤维反应的皮肤 mechanoreceptors, 第三组 (Aδ) 和 V (C) 纤维, 反应疼痛和温度。只有 C 纤维是髓的, 而其余的是髓不同程度。
痛觉受器是主要的感官神经元, 由有害刺激 (机械, 热, 化学刺激) 激活, 具有潜在的组织损伤。这些神经元由髓 Aδ纤维和髓 C 纤维1,4组成。Aδ纤维表达神经生长因子 (NGF、trkA 受体)、CGRP 和 SP 的受体。c 纤维分为肽能和非肽能 c 纤维。另一方面, 非肽能 C 纤维表达了神经胶质源性神经营养因子 (GDNF、RET 和 GFR 受体)、isolectin IB4 和 ATP 门控离子通道亚型 (P2X3)5、6、7的受体。痛觉受器可以通过离子通道的表达和神经营养因子、细胞因子、肽类、ATP 或其他化合物的活化来区分.8。在刺激时, 神经递质, 包括 CGRP、SP 和谷氨酸可以从脊髓背角的感官神经元终端释放, 传递伤害信号2。根神经节不仅由神经元组成, 而且还含有卫星胶质细胞。卫星细胞环绕感觉神经元, 提供机械和新陈代谢支持9,10。有趣的是, 有越来越多的证据表明, 神经节中的卫星胶质细胞可能参与调节疼痛感觉11。
感觉神经元被报道为最常用的原发性神经细胞12 , 并已用于电生理、信号传导和神经递质释放研究。它们也通常用于探索神经细胞发育的细胞机制、炎症性疼痛、神经病理性疼痛、皮肤感觉 (如瘙痒) 和轴突生长因子12、13、14、15。根背节原代培养可以作为分离神经元来评估单个或多个细胞的生化变化, 使科学家能够进行不能在实验对象中进行的研究。近年来, 从人体器官捐献者那里成功地培养了根背根, 对转化研究有很大裨益16。另一方面, 感官神经元也可以培养成根神经节外植体。根背节外植体保留了原组织结构的神经元, 包括雪旺细胞和卫星胶质细胞, 并特别有用的研究神经元和非神经元细胞之间的相互作用17。根背根根的培养可以很容易地在2.5 小时内准备好。细胞的组成和性质是高度反射的源背节, 因此, 特定的背节 (腰椎或胸背节) 可以根据实验要求收集。胚胎和新生儿背根神经节神经元的培养需要神经生长因子存活并诱发轴突的生长, 但成年神经元的培养不需要增加营养因子到媒体12,17。还有商业上可利用的背根瘤细胞系, 如 ND7/23 和 F11, 不需要使用实验动物。然而, 缺乏瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 1 (TRPV1) 表达 (一个重要标志的小感官伤害神经元) 和不一致基因表达谱限制其应用18。最近, 永生化的神经节神经元细胞系来源于大鼠 (50B11)19和小鼠 (MED17.11)20, 适合用于药物靶向研究的高通量筛。然而, 这些细胞系的基因表达谱尚未完成。因此, 将这些永生化细胞与感官神经元进行比较的验证实验仍在进行中。
NPFFR2 是在背节和移位的神经节中合成的, 在脊髓后角21的感觉神经端。本文提供了一种培养腰椎背根细胞的方法, 并对其进行 NPFFR2 激动剂的治疗, 以诱导神经递质、CGRP 和 SP 的释放。利用 NPFFR2 小干扰 RNA (siRNA) 对 NPFFR2 的依赖性进行进一步测试, 可将其转染到培养的背根细胞中。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文对大鼠腰椎背节的采集、酶解分离和培养进行了说明。在神经生长因子支持下, 背节神经元的轴突在细胞播种后3天内延长。当细胞被染色为 CGRP 蛋白, 在细胞体细胞中合成并沿轴突纤维传输时, 扩展轴突明显可见。卫星细胞的过程也延长, 允许这些分裂的神经胶质细胞在几天之内环绕神经元。本协议所生长的原发根神经节细胞适于对调节感觉神经元的细胞机制进行研究。在这里, 我们通过选择?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢 m. 卡尔金斯博士的英文编辑。这项工作得到了长功夫纪念医院 (CMRPD1F0482)、长功夫大学、健康老龄化研究中心 (EMRPD1G0171) 和科学技术部 (105-2320-182-012-MY2) 的支持。
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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