Summary
背根神经节的原代培养常用于研究感官神经元的生理功能或病理相关事件。在这里, 我们展示了使用腰椎背根神经节的文化, 以检测神经递质的释放后神经元肽 FF 受体2型刺激与选择性激动剂。
Abstract
背根神经节包含感觉神经元细胞体。这类神经元是伪单极, 有两个轴突, 支配周围组织, 如皮肤, 肌肉和内脏器官, 以及中枢神经系统的脊髓背角。感官神经元传递躯体感觉, 包括触摸, 疼痛, 热, 和本体的感觉。因此, 根根背根培养被广泛用于研究伤害的细胞机制、感官神经元的生理功能和神经发育。培养神经元可用于电生理、信号传导、神经递质释放或钙成像等研究。与根背节的主要文化, 科学家可能培养分离的背节神经元, 以监测在单个或多个细胞的生物化学变化, 克服许多与体内实验相关的限制。与商用神经节-杂交瘤细胞系或永生化背节神经元细胞系相比, 原代细胞的组成和性质更类似于组织中的感觉神经元。然而, 由于受培养的背根细胞的数量有限, 可以从单一的动物分离, 很难为药物靶向研究进行高通量的屏幕。本文介绍了背根背根的收集和培养过程。此外, 我们展示了用神经肽 FF 受体2型 (NPFFR2) 激动剂对培养的背根节细胞进行治疗, 以诱导释放肽类神经递质 (降钙素基因相关肽 (CRGP) 和 P 物质 (SP))。
Introduction
感觉神经元的细胞体包含在根背根内。这些神经元是伪单极和支配的周围组织和中枢神经系统。感觉神经元的周围神经末端在肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼, 以及其他组织中发现.他们将周围的感觉信号传送到脊髓背角的神经末梢, 然后通过不同的躯体感觉1,2的提升通路将信号传送到大脑。躯体感觉使身体感觉 (即触摸, 疼痛和热感觉) 和知觉运动和空间方向 (本体感觉)1,3。有四个子类的初级传入轴突, 包括第一组 (Aα) 纤维, 对本体的骨骼肌肉, 第二组 (Aβ) 纤维反应的皮肤 mechanoreceptors, 第三组 (Aδ) 和 V (C) 纤维, 反应疼痛和温度。只有 C 纤维是髓的, 而其余的是髓不同程度。
痛觉受器是主要的感官神经元, 由有害刺激 (机械, 热, 化学刺激) 激活, 具有潜在的组织损伤。这些神经元由髓 Aδ纤维和髓 C 纤维1,4组成。Aδ纤维表达神经生长因子 (NGF、trkA 受体)、CGRP 和 SP 的受体。c 纤维分为肽能和非肽能 c 纤维。另一方面, 非肽能 C 纤维表达了神经胶质源性神经营养因子 (GDNF、RET 和 GFR 受体)、isolectin IB4 和 ATP 门控离子通道亚型 (P2X3)5、6、7的受体。痛觉受器可以通过离子通道的表达和神经营养因子、细胞因子、肽类、ATP 或其他化合物的活化来区分.8。在刺激时, 神经递质, 包括 CGRP、SP 和谷氨酸可以从脊髓背角的感官神经元终端释放, 传递伤害信号2。根神经节不仅由神经元组成, 而且还含有卫星胶质细胞。卫星细胞环绕感觉神经元, 提供机械和新陈代谢支持9,10。有趣的是, 有越来越多的证据表明, 神经节中的卫星胶质细胞可能参与调节疼痛感觉11。
感觉神经元被报道为最常用的原发性神经细胞12 , 并已用于电生理、信号传导和神经递质释放研究。它们也通常用于探索神经细胞发育的细胞机制、炎症性疼痛、神经病理性疼痛、皮肤感觉 (如瘙痒) 和轴突生长因子12、13、14、15。根背节原代培养可以作为分离神经元来评估单个或多个细胞的生化变化, 使科学家能够进行不能在实验对象中进行的研究。近年来, 从人体器官捐献者那里成功地培养了根背根, 对转化研究有很大裨益16。另一方面, 感官神经元也可以培养成根神经节外植体。根背节外植体保留了原组织结构的神经元, 包括雪旺细胞和卫星胶质细胞, 并特别有用的研究神经元和非神经元细胞之间的相互作用17。根背根根的培养可以很容易地在2.5 小时内准备好。细胞的组成和性质是高度反射的源背节, 因此, 特定的背节 (腰椎或胸背节) 可以根据实验要求收集。胚胎和新生儿背根神经节神经元的培养需要神经生长因子存活并诱发轴突的生长, 但成年神经元的培养不需要增加营养因子到媒体12,17。还有商业上可利用的背根瘤细胞系, 如 ND7/23 和 F11, 不需要使用实验动物。然而, 缺乏瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 1 (TRPV1) 表达 (一个重要标志的小感官伤害神经元) 和不一致基因表达谱限制其应用18。最近, 永生化的神经节神经元细胞系来源于大鼠 (50B11)19和小鼠 (MED17.11)20, 适合用于药物靶向研究的高通量筛。然而, 这些细胞系的基因表达谱尚未完成。因此, 将这些永生化细胞与感官神经元进行比较的验证实验仍在进行中。
NPFFR2 是在背节和移位的神经节中合成的, 在脊髓后角21的感觉神经端。本文提供了一种培养腰椎背根细胞的方法, 并对其进行 NPFFR2 激动剂的治疗, 以诱导神经递质、CGRP 和 SP 的释放。利用 NPFFR2 小干扰 RNA (siRNA) 对 NPFFR2 的依赖性进行进一步测试, 可将其转染到培养的背根细胞中。
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Protocol
本文介绍的所有使用实验动物的方法均经 IACUC 大学动物保育和使用委员会 (问 13-014) 批准。
1. 从实验大鼠中收集腰椎背节
- 使用2至3周-大 (SD) 大鼠腰背根节收集。
注: 从4周龄大鼠收集的背根神经节神经元在此处描述的文化条件下生长不良好。 - 在高压釜内消毒所有手术器械。
- 麻醉鼠与1:1 混合 tiletamine 和 zolazepam (20 毫克/千克; 腹腔注射 (IP)), 并等待, 直到动物显示没有徒步撤退反应的脚趾捏试验。
注意: 在本协议中可以成功使用不同的麻醉策略。 - 用一个商业断头台, 用斩首来牺牲老鼠。
- 用断头台隔离大鼠前肢和股骨之间的躯干。有关要收集的区域的图表, 请参见图 1A 。
注意: 尾部切断线应该只是延髓股骨。如果脊柱的切口部位太高, 腰椎 L6 根节会被切除。 - 沿胸骨切开切除所有器官/组织用解剖剪刀 (图 2Aa)。
- 沿树干一侧切开, 收集鼠背部, 取出皮肤。见图 1B为解剖背躯干的照片。
- 在收集根背节前准备好冰上的组织。清洁手套的皮毛和血液, 并在继续下一步之前用75% 乙醇消毒。
- 去掉腰部的肌肉。首先, 两个切口沿脊柱两侧 (左和右) 和一个侧面切口, 以标记延髓程度的腰椎。然后, 用骨切割钳去除脊柱背肌 (图 2A-b)。
- 用骨切开钳去除椎骨的背部, 并暴露脊髓。
- 用解剖剪刀 (图 2A-c) 和镊子 (图 2A-d) 取出脊髓。
- 用最后肋骨 (胸椎 13) 计数椎骨来鉴别腰椎背节。请参阅图 1C中的椎骨位置图。
- 将双侧腰椎背节 (L1-L6) 与微剪刀 (图 2A-f) 收集到35毫米培养皿中, 2 毫升无冰的无血清培养基。移除神经元纤维 (如图 1C所示) 从连接背节, 然后转移到培养皿, 以提高文化的纯度。
注: 收集的根背根可在冰中保存约1小时。同时, 多大鼠可以被安乐死, 以创建一个更大的根背根。
2. 大鼠木材根背根的原代培养
注: 以下步骤应在层流罩中执行。
- 在 1x DMEM-F12 中制备含有10% 胎牛血清、100毫米丙酮酸钠和1x 青霉素/链霉素的培养基。
- 以200µg/毫升聚 l-赖氨酸为2小时, 用灭菌水冲洗细胞培养24井板。
- 用1毫升培养基在37°c2孵化器前孵化培养皿, 至少使用30分钟。
- 将背节含35毫米的盘子转移到层流罩中, 用吸管用无血清培养基3次清洗背节。
注意: 盘子的外面应该用75% 乙醇清洗, 然后再转到引擎盖。35毫米的菜肴可以包含一些大鼠的背节 (这将取决于实验设计的要求)。 - 将根背节 (从一只老鼠或从多个大鼠组合) 移动到新的35毫米培养皿中, 其中含有2毫升的胶原酶 (1 毫克/毫升, 无血清培养基) 与无菌镊子 (图 2A-e)。
注: 胶原酶溶液应通过0.22 µm 注射器过滤器进行灭菌。 - 消化在胶原酶溶液中的背节在37°c2孵化器30分钟。
- 去除胶原酶溶液, 并在2毫升的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 中清洗背节3次。
注: 可能有残余纤维或组织脱落的背根到溶液中。用吸管用洗涤液取出。 - 加入2毫升预热的0.05% 胰蛋白酶-EDTA 进入背节含35毫米菜, 并消化在37°c CO2孵化箱为30分钟的背节。
- 用玻璃吸管将2毫升的背根节的溶液转移到15毫升离心管上。
注: 背节可能会粘在玻璃吸管上, 所以这一步应该小心执行。在玻璃吸管 (约0.5 毫升) 的锥形端留有背节的溶液, 并缓慢而无停顿地将溶液输送到离心管中, 可以避免背节的损耗。 - 离心溶液在 290 x g 5 分钟4摄氏度。取出上清液, 再添加2毫升无血清培养基, 并用重悬背根节。
- 重复步骤 2.10 2 次, 但最后一次将无血清培养基改为预热培养基。
- 用火焰抛光的巴斯德吸管 (长度230毫米和尖头内径1毫米) 手工 triturate 根背根大约60次。如图2B 所示, 将火焰抛光的巴斯德吸管的孔与非抛光的吸管进行比较的照片。
注: 火焰抛光的巴斯德吸管的内径约比控制吸管小 10%, 锥形端内侧应较平滑。注意不要在研制过程细胞时产生气泡。 - 从 CO2孵化器中取出聚 l-赖氨酸涂层的菜肴。从盘子中吸取孵化的培养基, 将离解的细胞播种到涂敷的盘子上。
- 将一只大鼠的背根细胞 (从 L1-L6 的双侧收集, 12 全背根) 转化为24井板的四井;有大约 5 x 104细胞在一个井的24井板。
注: 此密度适用于检测释放的 CGRP 或 SP, 也适用于染色。对于西方的印迹或 RNA 提取, 种子的背根细胞从一大鼠 (双侧 L1-L6) 成一个井的6井板块。 - 在第二天替换培养基, 添加10µM cytarabine (阿糖 C) 和 100 ng/毫升 NGF, 并在此后每两天刷新培养基。
注: 胸背节也可以通过本协议培养, 如果他们已经从胸椎收集。
3. NPFFR2 siRNA 在背根细胞中的转染
- 根据制造商的协议, 执行 NPFFR2 siRNA 的转染和控制 siRNA。
注意: 如果选择的转染试剂与我们使用的不同 (见材料表), 则需要修改该协议。 - 在3天的细胞电镀后, 改变培养基到0.5 毫升前温热无血清培养基和孵化的根节在37摄氏度 CO2孵化器为 1 h。
- 添加 50 nM 的 siRNA (在1µL RNase 无水) 成12.5 µL 无血清培养基。
- 将2.5 µL 转染试剂添加到10µL 无血清培养基中。
- 用吸管将溶液从步骤3.3 和3.4 混合, 在室温下孵化出10分钟的混合转染溶液。
- 将转染液加入一个含背节的24井板中, 用温和的震动将溶液与培养基混合。
注: 如果需要对多个井进行转染, 则应同时部署多个调入解决方案。 - 孵化在37°c2孵化器6小时的背节。
- 添加0.5 毫升/井的培养基中含有20% 胎牛血清, 100 毫米丙酮酸钠, 1x 青霉素/链霉素在 1x DMEM-F12, 增加10µM 阿糖 C 和 100 ng/毫升 NGF, 进入24井板块。
- 在37摄氏度 CO2孵化器中孵育根节, 另66小时 (在48小时内刷新培养基)。
4. 从原根背根细胞释放神经递质
- 在6天在细胞被镀 (72 小时以后 siRNA 转染), 改变培养基到200µL 无血清培养基, 并且孵化细胞在37°c CO2孵化器为30分钟。
- 添加1µL 刺激化学物质, 并通过吹打轻轻混合培养基。孵化的菜在一个37摄氏度 CO2孵化器指定的时间。
注: 在这篇文章中, 培养的细胞被刺激与 NPFFR2 激动剂, dNPA (d. Asn-亲 (n-i) 的 Gln Gln--列伊--NH2, 5 nmol), 1 小时。 - 从培养皿和离心机中收集培养基, 在4摄氏度时以 5000 x g为5分钟, 除去任何悬浮杂质。
- 根据需要, 从离心中收集上清液, 并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 稀释样品。用酶免疫分析试剂盒测定神经递质的含量。
注: 在分析 CGRP 水平之前, 上清液稀释了1:100。在分析 SP 水平前, 未对上清液进行稀释。
5. CGRP 和 SP 环境影响评估
- 根据 CGRP 或 SP 环境影响评估套件制造商的协议立即分析样品。
注意: 该协议将根据所使用的套件而有所不同。 - 用套件内提供的洗涤缓冲器冲洗5次 CGRP EIA 井。
- 将100µL 样品与100µL 抗 cgrp 乙酰胆碱酯酶 (疼痛) 示踪剂添加到 CGRP eia 井中, 并将50µL 样品、50µL 抗 sp 疼痛示踪剂和50µL 抗 sp 抗体添加到 SP eia 井中。
- 用包内提供的塑料薄膜密封 CGRP 和 SP 井。
- 在4摄氏度的夜间孵化水井。
- 用 CGRP 或 SP 洗涤缓冲器清洗水井5次, 从井中取出所有残留液。
- 在相应的 EIA 套件中添加200µL 埃尔曼试剂到 CGRP 或 SP 井中。
- 在室温下孵育 CGRP 井30分钟, 在室温下孵育 SP 井90分钟。在两种化验中保护油井不受光照。
- 阅读波长 414 nm 的板块, 并根据相应的 EIA 仪器计算结果。
注: 在添加埃尔曼试剂之前, 应尽量避免用手触摸井底, 并用镜片清洗湿巾清洁井底的水渍。
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Representative Results
大鼠腰椎节段神经元, 培养在一个24井板, 生长在培养基与额外的阿糖 C, 以抑制胶质细胞增殖和 NGF 支持神经元生长。观察了活背根细胞的形态。如图 3所示, 单个神经元的细胞体在1天的盘子底部附着, 并被选择观察。轴突生长由天1–3监测。胶质细胞复制和扩展的过程包围的感官神经元的细胞体。在另一种文化中, CGRP 蛋白被染色, 以揭示神经元的形状。图 4中, CGRP 蛋白染色出现在感觉神经元胞浆和轴突中。在 DAPI 染色时, 神经元和胶质细胞的核形态是不同的。神经元的细胞核比胶质细胞更大、更圆。相比之下, 胶质细胞的细胞核形状更加椭圆形 (图 4B)。
选择性 NPFFR2 激动剂 dNPA, 用于刺激 CGRP 和 SP 的释放。dNPA 刺激的神经递质释放对 NPFFR2 的依赖性由转染细胞与 NPFFR2 siRNA 检测。NPFFR2 siRNA 或控制 siRNA 在激动剂治疗前转染成原发背节细胞72小时。用 dNPA (5 nmol) 对背根细胞进行了1小时的治疗, 并通过单独的 EIA 试剂盒测定了 CGRP 和 SP 的释放量。用 dNPA 对背根节的模拟提高了介质中 CGRP 和 SP 的水平 (图 5A, B)。然而, 在培养的背根细胞中, NPFFR2 siRNA 的表达抑制了 dNPA 诱导的 CGRP 释放。图 5中显示的结果是从以前的出版物修改的, 并在这里使用权限22。
图 1: 组织处理图.腰椎背节是从3周大的老鼠收集。(A) 使用断头台切割动物的位置用虚线表示。(B) 切除皮肤的背躯干, 并 (C) 显示腰椎根节的位置 (从 L1-L6)。该插入表示背节和连接纤维 (由箭头指示)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 隔离根背根原代培养所需的特殊设备.(A) 用于收集根背根的外科器械。从左到右: (a) 解剖剪刀 (大), (b) 骨切割钳, (c) 解剖剪刀 (小), (d, e) 点镊子, (f) 微剪刀。(B) 常规的巴斯德吸管和火焰抛光的巴斯德吸管。"a" 表示常规巴斯德吸管的内径, "b" 表示火焰抛光的巴斯德吸管的内径。b/a ≒0.9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 活背根细胞的形态学.用显微术监测活背根细胞。细胞在播种后的某一天显示 (a), (B) 播种后两天, (C) 播种后三天。箭头表示神经元和箭头表示胶质细胞。刻度条 = 20 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4: 培养的背根细胞的染色.神经节细胞 immunostained 抗 CGRP 抗体, 显示神经元, 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 的神经元和胶质细胞的细胞核。(A) CGRP 蛋白在感官神经元细胞体和轴突纤维中表达。(B) 神经元和胶质细胞的细胞核被 DAPI 染色。(C) 从 A 和 b 箭头合并的图片表示神经元和箭头表示神经胶质细胞。刻度条 = 30 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 5: 从培养的背根细胞释放神经递质.选择性 NPFFR2 激动剂, dNPA, 被用来刺激释放 CGRP 和 SP 的根背节培养。NPFFR2 siRNA 转染细胞对 NPFFR2 神经递质释放的依赖性进行了验证。(A和B) 在背根细胞转染 NPFFR2 siRNA 或非靶向控制 siRNA (72 小时) 后, dNPA (5 nmol) 应用于1小时, 诱导 CGRP 和 SP 的释放. 数据表示为均值标准误差 (SEM), 并进行了分析。方差分析与 Bonferroni后的随机试验。**p < 0.01, **p < 0.001;与相应的车辆控制 (每组 N = 12) 相比。A 组和 B 组已从林等进行了修改。22请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文对大鼠腰椎背节的采集、酶解分离和培养进行了说明。在神经生长因子支持下, 背节神经元的轴突在细胞播种后3天内延长。当细胞被染色为 CGRP 蛋白, 在细胞体细胞中合成并沿轴突纤维传输时, 扩展轴突明显可见。卫星细胞的过程也延长, 允许这些分裂的神经胶质细胞在几天之内环绕神经元。本协议所生长的原发根神经节细胞适于对调节感觉神经元的细胞机制进行研究。在这里, 我们通过选择性 NPFFR2 激动剂 dNPA 刺激神经肽、CGRP 和 SP 的释放。NPFFR2 是 NPFF 的同源受体, 据报道参与疼痛感觉和调节通路22,23。NPFFR2 siRNA 的使用进一步证实了 CGRP 和 SP 释放的 NPFFR2-dependence。
根背节培养既包括感官神经元, 也包含卫星胶质细胞。卫星胶质细胞为神经元提供代谢支持, 维持神经元功能9,10。在染色图片中, 很容易识别神经元和胶质细胞, 因为它们的细胞核形状不同 (如图 4B所示)。如果有实验性的需求来区分神经元和胶质细胞的特异功能, 那么在培养皿中存在卫星电池可能会有问题。例如, 不可否认的是, 卫星细胞参与了疼痛11、24的发展和维持, 在一些研究中, 神经元和胶质细胞的作用很难用背根背根培养来区分。
在本协议中, 有一些关键步骤需要格外小心。首先, 由于根背根在层流罩外收集, 在组织收集过程中应格外小心以避免细胞污染。应该没有必要创造一个不育的空间, 就像在人类的外科病房, 但仪器灭菌和清洁的操作空间是必不可少的。避免污染的提示包括在不使用时将灭菌的器械放在灭菌袋上, 避免接触任何不必要的物品。此外, 污染的有机体可能会携带毛皮, 可能会粘在老鼠身上的躯干或手套。因此, 在手套上的毛皮和血迹应该用75% 乙醇清洗去除。操作者戴上手术面罩, 防止生物体从呼吸或唾液中转移, 也有帮助。此外, 35 毫米的菜肴应保持关闭的时刻, 只有打开时, 放置解剖根背节内。在酶消化前, 用新菜代替 35 mm 菜是很重要的。在酶消化过程中, 不要延长潜伏期, 因为过度消化可能会损伤神经元。一定要预热的胰蛋白酶-EDTA 到37°c, 以达到适当的消化效率。在较低的温度下, 效率将显著降低, 在用火焰抛光的巴斯德吸管研制过程背节时, 很难实现单细胞悬浮。火焰抛光的吸管将平滑的孔和防止尖锐的玻璃边缘伤害神经元。然而, 用火焰加热吸管会使内径太小, 而组织或细胞的溶液将很难通过。这种减少的直径也可能导致许多气泡形成在研磨阶段, 大大减少了可收集的神经节神经元数量。最后, 在任何时候都应轻柔地处理背根背根, 尤其是在改变培养基或进行药物治疗时。
背根神经节神经元被报告为最常用的原代培养神经细胞12。它们可以用于各种不同的研究, 包括电生理学或细胞生物学, 以探索感官神经元的生理或病理功能。根背根原代培养的主要局限是它们不适合高通量筛选。从一只老鼠的背根中可以收集到的细胞数量有限, 神经元在文化中无法复制。由于细胞数目有限, 已开发出几种背根瘤细胞系或永生化的神经节神经元细胞系, 以取代原代培养物18、19、20。然而, 背根细胞系的蛋白表达谱可能与原根背节不相同, 因此每个模型系统都需要经过仔细的验证。除了在实验室中分离细胞外, 还有老鼠胚胎或新生儿背根神经节神经元已经在商业上获得了。因此, 从商业来源购买可能是一个可行的替代新准备的背节文化。
根背根原代培养作为一种重要的实验工具, 在疼痛相关研究中得到了广泛应用。这个模型系统在不久的将来不太可能被替换。随着优良的背根神经节神经元, 科学家可以获得稳定和重现的结果, 有利于许多领域的神经科学研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
感谢 m. 卡尔金斯博士的英文编辑。这项工作得到了长功夫纪念医院 (CMRPD1F0482)、长功夫大学、健康老龄化研究中心 (EMRPD1G0171) 和科学技术部 (105-2320-182-012-MY2) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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