Summary
Dorsal Root Ganglien (DRG) Primärkulturen werden häufig verwendet, um physiologische Funktionen oder Pathologie-Veranstaltungen in sensorischen Neuronen zu studieren. Hier zeigen wir den Einsatz von lumbalen DRG-Kulturen, die Freisetzung von Neurotransmittern zu erkennen, nachdem Neuropeptid FF-Rezeptor Typ 2 Stimulation mit ein selektiver Agonist.
Abstract
Dorsal Root Ganglien (DRG) enthalten Zellkörper der sensorischen Neuronen. Diese Art des Neurons ist Pseudo-unipolar, mit zwei Axone, die periphere Geweben wie Haut, Muskeln und viszeralen Organe sowie die Wirbelsäule Hinterhorn des zentralen Nervensystems innervieren. Sensorische Neuronen vermitteln somatische Gefühl, einschließlich Touch, Schmerzen, thermische und propriozeptive Empfindungen. Daher sind DRG Primärkulturen verbreitet, die zellulären Mechanismen der nozizeption, physiologische Funktionen des sensorischen Neuronen und neurale Entwicklung zu studieren. Die kultivierten Neuronen können in Studien mit Elektrophysiologie, Signaltransduktion, Neurotransmitter-Freisetzung oder Kalzium Imaging angewendet werden. Mit DRG Primärkulturen Wissenschaftler können dissoziierte DRG-Neuronen zur Überwachung der biochemischer Veränderungen in einzelnen Kultur oder mehrere Zellen, die viele der Einschränkungen zu überwinden in Vivo Experimente zugeordnet. Im Vergleich zu kommerziell sind verfügbar DRG-Hybridom-Zell-Linien oder verewigt DRG neuronalen Zelllinien, die Zusammensetzung und Eigenschaften von den Primärzellen sensorischen Neuronen im Gewebe viel ähnlicher. Aufgrund der begrenzten Anzahl von kultivierten DRG-Primärzellen, die von einem einzigen Tier isoliert werden können, ist es jedoch schwierig, Hochdurchsatz-Bildschirme für Drug targeting Studien durchführen. In dem aktuellen Artikel werden Verfahren für die DRG-Sammlung und Kultur beschrieben. Darüber hinaus zeigen wir Ihnen die Behandlung von kultivierten DRG Zellen mit Agonist Neuropeptid FF Rezeptor Typ 2 (NPFFR2), die Freisetzung von Neurotransmittern Peptid (Calcitonin-gen-related Peptid (CRGP) und Substanz P (SP)) zu induzieren.
Introduction
Die Zellkörper der sensorischen Neuronen sind in DRG enthalten. Diese Neuronen sind Pseudo-unipolar und innervieren peripheren Geweben und das zentrale Nervensystem. Die peripheren Nervenenden der sensorischen Neuronen finden sich in Muskeln, Haut, viszeralen Organe und Knochen, unter anderen Geweben. Sie Strahlen peripheren Empfindung Signale zu Nerven, die Endungen in der Wirbelsäule Hinterhorn und die Signale dann an das Gehirn über verschiedene aufsteigende Wege von somatischen Sensation1,2übertragen werden. Somatische Empfindung ermöglicht dem Körper zu fühlen (d.h., Berührungs-, Schmerz-, und thermische Empfindungen) und Bewegung und räumliche Orientierung (propriozeptive Empfindungen)1,3wahrnehmen. Es gibt vier Unterklassen der primären afferenten Axone, einschließlich der Gruppe I (Aα) Fasern, die Propriozeption der Skelettmuskulatur, Gruppe II (Aβ) Fasern, die Beantwortung von Mechanorezeptoren der Haut reagieren und Gruppe III (Aδ) und Gruppe V (C) Fasern, die auf Schmerzen reagieren und Temperatur. Nur die C-Fasern sind unmyelinierten, während der Rest sind Markhaltige in unterschiedlichem Ausmaß.
Nozizeptoren sind die primären sensorischen Neuronen, die durch Schmerzreize (mechanische, thermische und chemische Stimulation) aktiviert werden, das Potenzial für Gewebeschäden führen. Diese Neuronen bestehen aus Markhaltige Aδ-Fasern und unmyelinierten C Fasern1,4. Die Aδ-Fasern zum Ausdruck bringen, der Rezeptoren für den Nervenwachstumsfaktor (NGF, TrkA Rezeptor), CGRP und SP. Die C-Fasern sind entweder Peptidergic und nicht Peptidergic C-Fasern eingestuft. Auf der anderen Seite der nicht-Peptidergic-C-Fasern zum Ausdruck bringen der Rezeptoren für Glia-derived Neurotrophic Factor (GDNF, RET und GFR-Rezeptoren), Isolectin IB4 und ATP-gated Ion Channel Subtyp (P2X3)5,6,7. Nozizeptoren können zeichnet sich durch den Ausdruck von Ionenkanälen und durch neurotrophe Faktoren aktiviert, Zytokine, Neuropeptide, ATP oder andere chemische Verbindungen8. Nach Stimulation können Neurotransmitter, darunter CGRP, SP und Glutamat von sensorischen Neuron-Terminals in der Wirbelsäule Hinterhorn nozizeptiven Signale2übertragen entbunden werden. DRG bestehen nicht nur aus Neuronen, aber auch Satelliten Glia-Zellen enthalten. Satellitenzellen umgeben die sensorischen Neuronen und bieten mechanische und metabolische Unterstützung9,10. Interessanterweise gibt es eine wachsende Zahl von beweisen, die darauf hinweist, dass Sat-Gliazellen im DRG beteiligt sein können, bei der Regulierung der Schmerz Empfindung11.
Sensorische Neuronen wurden gemeldet, die am häufigsten verwendeten primären Nervenzellen12 und haben für Elektrophysiologie, Signaltransduktion und Neurotransmitter-Freisetzung Studien verwendet worden sein. Sie dienen häufig auch die zellulären Mechanismen der neuronalen Entwicklung, entzündliche Schmerzen, neuropathische Schmerzen, Hautgefühl (z. B. Juckreiz) und Axon Auswuchs12,13,14,15zu erkunden. DRG Primärkulturen können kultiviert werden, als dissoziierte Neuronen zu beurteilen, biochemische Veränderungen in einzelne oder mehrere Zellen, so dass Wissenschaftler, Studien durchzuführen, die in Versuchspersonen durchgeführt werden kann. Vor kurzem, DRG wurden erfolgreich kultiviert aus menschlichen Organspendern die translationale Forschung16profitieren könnte. Auf der anderen Seite können die sensorische Neuronen auch kultiviert werden wie DRG explants. Die DRG-Explantaten bewahren die ursprüngliche Gewebearchitektur der Neuronen, einschließlich Schwann-Zellen und Gliazellen Satelliten, und sind besonders nützlich, um Interaktionen zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen17zu untersuchen. DRG Primärkulturen können leicht innerhalb von 2,5 Stunden hergestellt werden. Die Zelle Zusammensetzung und Eigenschaften sind stark reflektierende der Quelle DRG, und als solche kann spezifische DRG (Lenden- oder Brustwirbelsäule DRG) gesammelt werden, nach experimentellen Anforderungen. Kulturen der embryonalen und neonatale DRG-Neuronen erfordern NGF zu überleben und Axon Auswuchs zu induzieren, aber Kulturen von Erwachsenen Nervenzellen benötigen keine Zugabe von neurotrophen Faktoren, die die Medien12,17. Außerdem gibt es im Handel erhältliche DRG-Hybridom-Zell-Linien wie SD7/23 und F11, die nicht den Einsatz von Versuchstieren erfordern. Jedoch der Mangel an der transienten Rezeptor potenzielle kation Kanal Unterfamilie V Mitglied 1 (TRPV1) Ausdruck (ein wichtiger Marker für kleine sensorischen nozizeptiven Neuronen) und inkongruente gen expressionsprofile begrenzen ihre Anwendungen18. Vor kurzem verwenden verewigt DRG neuronale Zelle, die Ratte (50B11)19 Linien abgeleitet worden und Maus (MED17.11)20, die geeignet sind für Drug targeting Studien im Hochdurchsatz-Bildschirme. Gen-Expression profiling für diesen Zelllinien muss jedoch noch durchgeführt werden. Somit sind die Validierung Experimente vergleicht diese verewigt Zellen zu sensorischen Neuronen noch nicht abgeschlossen.
NPFFR2 ist in der DRG synthetisiert und an den Klemmen sensorische Nerven in der Wirbelsäule Hinterhorn21umgesiedelt. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll für Lendenwirbelsäule DRG-Zellen kultiviert und Behandlung mit Agonist NPFFR2 induzieren die Freisetzung von Neurotransmittern, CGRP und SP. Die Abhängigkeit von NPFFR2 wird weiter getestet, mit NPFFR2 kleinen interferierende RNA (SiRNA), die in kultivierten Zellen DRG transfiziert werden kann.
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Protocol
Alle Methoden, die hier beschriebenen, die Versuchstiere benutzen stimmten die institutionellen Animal Care und verwenden Committee (IACUC) von Chang Gung University (CGU 13-014).
1. sammeln Sie lumbale DRG aus experimentellen Ratten
- Verwenden Sie 2 bis 3 Wochen alten Sprague-Dawley (SD) Ratten für Lendenwirbelsäule DRG-Sammlung.
Hinweis: DRG-Neuronen von Ratten gesammelt über 4 Wochen wachsen nicht gut unter den hier beschriebenen Kulturbedingungen. - Alle chirurgischen Instrumente im Autoklav zu sterilisieren.
- Betäuben Sie die Ratte mit einem 1:1 Mischung von tiletamin und Zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneale Injektion (IP)) zu und warten Sie, bis das Tier keine Fuß-Entzug Antwort in einem Zeh-Pinch-Test zeigt.
Hinweis: Verschiedene Anästhesie Strategien können erfolgreich in diesem Protokoll verwendet werden. - Die Ratte durch Enthauptung mit einer kommerziellen Guillotine zu opfern.
- Verwenden Sie die Guillotine, um den Körper-Stamm der Ratte zwischen der vordergliedmaße und Oberschenkelknochen zu isolieren. Siehe Abbildung 1A für ein Diagramm der Region gesammelt werden.
Hinweis: Die Caudale Schnittlinie sollte nur rostral in den Oberschenkelknochen. Die Lendenwirbelsäule L6-DRG wird herausgeschnitten werden, wenn die geschnittene Seite in der Wirbelsäule zu hoch ist. - Schneiden Sie entlang dem Brustbein und entfernen Sie alle Organe/Gewebe mit Dissektion Schere (Abbildung 2A-ein).
- Schneiden Sie entlang der Seite des Rumpfes, der dorsalen Teil der Ratte zu sammeln und die Haut abziehen. Siehe Abbildung 1 b für ein Foto von der seziert dorsalen Stamm.
- Bereiten Sie das Gewebe auf dem Eis vor der DRG zu sammeln. Reinigen Sie Fell und Blut von Handschuhen und Sterilisieren sie mit 75 % Ethanol, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Entfernen Sie die Muskeln für die Lendenwirbelsäule. Stellen Sie zunächst zwei Schnitten entlang den Seiten der Wirbelsäule (Links und rechts) und einem seitlichen Schnitt, rostral soweit der Lendenwirbelsäule zu markieren. Dann entfernen Sie die dorsalen Muskeln der Wirbelsäule mit Knochen schneiden Zange (Abb. 2A-b).
- Entfernen Sie den dorsalen Teil der Wirbel mit Knochen schneiden Pinzette und setzen Sie das Rückenmark.
- Entfernen Sie das Rückenmark mit Dissektion Schere (Abbildung 2A-c) und Zange (Abb. 2A-d).
- Identifizieren Sie die Lendenwirbelsäule DRG durch Wirbel aus der letzten Rippe (thorakale Wirbel 13) zählen. Ein Diagramm der Wirbel Positionen finden Sie unter Abbildung 1 .
- Sammeln Sie die bilaterale lumbale DRG (L1-L6) mit Mikro-Schere (Abbildung 2A-f) in einer 35-mm-Kulturschale mit 2 mL eiskaltes serumfreien Medium. Die neuronalen Fasern (wie in Abbildung 1) vom Anschluss DRG, dann transfer in der Kulturschale, die Reinheit der Kulturen zu verbessern.
Hinweis: Die gesammelten DRG kann im Medium für ca. 1 h auf Eis gehalten werden. Unterdessen können mehrere Ratten eingeschläfert werden, um einen größeren Pool von DRG zu erstellen.
(2) Primärkultur Ratte Holz DRG
Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.
- Bereiten Sie Kulturmedium mit 10 % fötalen Rinderserum, 100 mM Natrium Pyruvat und 1 X Penicillin/Streptomycin 1 x DMEM-F12.
- Mantel der Zellkultur behandelt 24-Well-Platte mit 200 µg/mL Poly-L-Lysin für 2 h dann mit sterilisierten Wasser waschen.
- Vor inkubieren Sie der Kulturschale mit 1 mL Kulturmedium in einem 37 ° C CO2 Inkubator vor Gebrauch für mindestens 30 min.
- Übertragen der DRG-haltigen 35 mm Schale in eine laminare Kapuze und waschen die DRG mit serumfreien Medium 3 Mal mit der Pipette.
Hinweis: Die Außenseite der Schale sollte mit 75 % Ethanol gereinigt werden, vor der Übertragung in die Haube. Die 35-mm-Schale kann DRG aus einer Reihe von Ratten enthalten (Dies hängt von den Anforderungen des experimentellen Designs). - Verschieben der DRG (aus einer einzigen Ratte oder Kombination aus mehreren Ratten) zu einer neuen 35 mm Kulturschale enthält 2 mL Kollagenase Typ IA (1 mg/mL in serumfreien Medium) mit einer sterilen Pinzette (Abbildung 2A-e).
Hinweis: Die Kollagenase-Lösung sollten sterilisiert werden, indem man es durch einen 0,22 µm Spritze Filter. - Die DRG in der Kollagenase-Lösung in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 30 min zu verdauen.
- Die Kollagenase-Lösung entfernen und waschen die DRG 3 Mal in 2 mL Hank ausgewogenen Salzlösung (HBSS).
Hinweis: Möglicherweise verbleibende Fasern oder Gewebe, die aus der DRG in die Lösung zu kommen. Entfernen sie die Pipette mit der Waschlösung. - Fügen Sie 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in der DRG-haltigen 35 Millimeter-Teller und verdauen der DRG in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 30 min vorgewärmt.
- Übertragen Sie 2 mL der DRG-haltige Lösung auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen Glaspipette.
Hinweis: Die DRG könnte um die Glaspipette kleben, so dass dieser Schritt mit Sorgfalt durchgeführt werden sollte. DRG-Verlust kann vermieden werden, indem die DRG-haltige Lösung in das spitz zulaufende Ende eine Glaspipette (ca. 0,5 mL) und die Lösung langsam in die Zentrifugenröhrchen zu übertragen, aber ohne Pause. - Zentrifugieren Sie die Lösung bei 290 X g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den überstand zu und fügen Sie ein weiteres 2-mL serumfreien Medium, um die DRG Aufschwemmen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 2 Mal aber Änderung serumfreien Medium vorgewärmt Nährmedium auf das letzte Mal.
- Genannte manuell die DRG etwa 60 mal mit einer Flamme poliert Pasteurpipette (Länge 230 mm und Spitze Kopf Innendurchmesser 1 mm). Siehe Abbildung 2 b für ein Foto, einen Vergleich der Öffnung von einer Flamme poliert Pasteurpipette, einer Pipette nicht poliert.
Hinweis: Der innere Durchmesser der Flamme poliert Pasteurpipette beträgt ca. 10 % kleiner als die Kontrolle Pipette und der Innenseite der das spitz zulaufende Ende reibungsloser. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erstellen, wenn die Zellen zu verreiben. - Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-beschichtete Schale aus dem CO2 Inkubator. Aspirieren inkubierten Kulturmedium aus der Schale, und Samen der dissoziierten Zellen auf die beschichtete Schale.
- Säen Sie die DRG-Zellen von einer Ratte (bilaterale Sammlung von L1-L6, für insgesamt 12 DRG) in vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte; Es gibt ca. 5 x 104 Zellen in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte.
Hinweis: Diese Dichte ist geeignet für den Nachweis von freigegebenen CGRP und SP und auch geeignet für Immunostaining. Für Western-Blot oder RNA-Extraktion Samen der DRG-Zellen von einer Ratte (bilaterale L1-L6) in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte. - Das Kulturmedium am folgenden Tag mit dem Zusatz von 10 µM Cytarabin (Ara-C) und 100 ng/mL NGF ersetzen, und das Medium danach alle zwei Tage zu aktualisieren.
Hinweis: Die thorakale DRG kann auch auch durch dieses Protokoll kultiviert werden, wenn sie von der Brustwirbelsäule gesammelt worden sind.
3. die Transfektion von NPFFR2 SiRNA in DRG-Zellen
- Führen Sie die Transfektion von NPFFR2 SiRNA und kontrollieren Sie SiRNA laut Protokoll des Herstellers zu.
Hinweis: Das Protokoll müssen angepasst werden, wenn das gewählte Transfection Reagens anders als wir verwendet (siehe die Tabelle der Materialien). - Am 3. Tag nach Zelle Beschichtung ändern Sie das Medium in 0,5 mL Pre warm serumfreien Medium und inkubieren Sie die DRG in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 1 h.
- Fügen Sie 50 nM von SiRNA (in 1 µL RNase-freies Wasser) in serumfreien Medium 12,5 µL.
- 2.5 µL Transfection Reagens in 10 µL serumfreien Medium hinzufügen.
- Mischen Sie die Lösung aus Schritte 3.3 und 3.4 von pipette und inkubieren Sie dieser gemischten Transfektion Lösung für 10 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die Transfektion Lösung in einer DRG-haltigen 24-Well-Platte und mischen Sie die Lösung mit Medium durch sanftes schütteln.
Hinweis: Mehrere Transfektion Lösungen sollten zur gleichen Zeit bereitgestellt werden, wenn mehrere Brunnen transfiziert werden müssen. - Inkubieren Sie die DRG in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 6 h.
- Hinzufügen von 0,5 mL/gut Kulturmedium, enthält 20 % fötalen Rinderserum, 100 mM Natrium Pyruvat und 1 X Penicillin/Streptomycin 1 x DMEM-F12, mit dem Zusatz von 10 µM Ara-C und 100 ng/mL NGF, in der 24-Well-Platte.
- Inkubieren Sie die DRG in einem 37 ° C CO2 Inkubator für eine weitere 66 h (Refresh das Medium bei 48 h).
4. Freisetzung von Neurotransmittern aus primären DRG Zellen
- An Tag 6 nach Zellen (72 h nach SiRNA Transfection) überzogen wurden, ändern Sie das Kulturmedium in 200 µL serumfreien Medium, und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C CO2 Inkubator für 30 min.
- 1 µL Stimulation Chemical(s) hinzufügen und vorsichtig mischen der Medien durch pipettieren. Eingestellten Zeit inkubieren Sie das Gericht in einem 37 ° C CO2 Inkubator.
Hinweis: In diesem Artikel wurden die kultivierten Zellen mit NPFFR2 Agonist, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 Nmol) für 1 h stimuliert. - Sammeln Sie das Kulturmedium aus der Kulturschale und Zentrifuge bei 5.000 X g für 5 min bei 4 ° C, suspendierten Verunreinigungen zu entfernen.
- Sammle den überstand von der Zentrifugation und verdünnen die Proben mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), je nach Bedarf. Bestimmen Sie die Höhe der Neurotransmitter mit Enzym-Immunoassay (EIA)-Kits.
Hinweis: Hier wurden die Überstände verdünnt 1: 100 vor der Analyse der Ebene der CGRP. Der Überstand wurde nicht verdünnt vor der Analyse der Ebene der SP.
5. CGRP und SP UVP
- Analysieren Sie die Proben sofort nach der CGRP und SP UVP Kit des Herstellers Protokoll.
Hinweis: Das Protokoll variiert je nach Kit verwendet. - Spülen Sie die CGRP EIA-Brunnen 5 Mal mit Waschpuffer innerhalb der Bausatz geliefert.
- Fügen Sie 100 µL Proben mit 100 µL Anti-CGRP Acetylcholinesterase (AChE) Tracer in die Vertiefungen CGRP EIA hinzu, und fügen Sie 50 µL Proben, 50 µL Anti-SP AChE Tracer und 50 µL Anti-SP Antiserum in die SP UVP Vertiefungen.
- Versiegeln Sie die CGRP und SP Brunnen mit Kunststoff-Folie, die innerhalb der Kits enthalten ist.
- Der Brunnen über Nacht bei 4 ° c inkubieren
- Waschen Sie die Brunnen 5 Mal mit CGRP oder SP waschen Sie Puffer und entfernen Sie die restliche Lösung aus dem Brunnen zu.
- Fügen Sie 200 µL Ellman Reagenz in der CGRP und SP Brunnen, die innerhalb der entsprechenden UVP-Kits enthalten ist.
- Die CGRP-Brunnen für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, und der SP-Brunnen für 90 min bei Raumtemperatur inkubieren. Schützen Sie der Brunnen vor Licht für beide Assays.
- Lesen Sie die Platten bei nm Wellenlänge 414 und berechnen Sie die Ergebnisse nach der entsprechenden UVP-Instrument.
Hinweis: Berühren Sie die Unterseite der Brunnen von hand ständig und reinigen Sie die Wasserflecken von gut unten durch Objektiv Reinigungstücher vor dem Hinzufügen der Ellman Reagenz.
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Representative Results
In Kulturmedium mit zusätzlichen Ara-C, Glia Zellproliferation hemmen und NGF, neuronale Wachstum zu unterstützen wurde Ratte lumbale DRG-Neuronen, in einer 24-Well-Platte, kultiviert angebaut. Die Morphologie der lebenden Zellen DRG wurde beobachtet. Wie in Abbildung 3gezeigt, war der Zellkörper eines einzelnen Neurons angebracht an der Unterseite eines Tellers an Tag1 und für die Beobachtung ausgewählt. Axon Wachstum wurde ab Tag 1 – 3 überwacht. Die Gliazellen dupliziert und erweiterte Prozesse, die Zellkörper der sensorischen Neuronen zu umgeben. In einer anderen Kultur war CGRP Protein befleckt werden, um die Form der Neuronen zu offenbaren. In Abbildung 4wird CGRP Protein Beflecken in den Zytoplasma und Axone der sensorischen Neuronen. Die nukleare Morphologien von Neuronen und Gliazellen unterscheiden sich beim mit DAPI angefärbt. Die Nervenzellen haben einen größeren und runderen Kern als Gliazellen. Im Vergleich dazu sind die Kerne der Glia mehr Oval (Abbildung 4 b).
Die selektive NPFFR2 Agonist, dNPA, wurde verwendet, um die Freisetzung von CGRP und SP. stimulieren Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der Freisetzung von Neurotransmittern dNPA-angeregt von NPFFR2 von transfecting Zellen mit SiRNA NPFFR2 getestet. NPFFR2 SiRNA oder Kontrolle SiRNA wurden in die primäre DRG Zellen 72 h vor der Agonist Behandlung transfiziert. DRG-Zellen wurden für 1 h mit dNPA (5 Nmol) behandelt und die Freisetzung von CGRP und SP wurde durch separate EIA Kits gemessen. Die Simulation der DRG mit dNPA erhöht das Niveau der CGRP und SP in den Medien (Abbildung 5A, B). Allerdings war nur die dNPA-induzierte CGRP Freigabe durch Expression von NPFFR2 SiRNA in kultivierten DRG-Zellen gehemmt. Die in Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse aus einer früheren Veröffentlichung geändert wurden und werden hier mit Erlaubnis22verwendet.
Abbildung 1: Gewebe Verarbeitung Diagramme. Lumbale DRG sind von 3 Wochen alte Ratten gesammelt. (A) die Positionen, wo die Guillotine verwendet werden, um das Tier zu schneiden, sind durch gestrichelte Linien angedeutet. (B) der dorsale Stamm mit Haut entfernt und (C) die Standorte der Lendenwirbelsäule DRG (von L1-L6) werden angezeigt. Die Einfügung stellt die DRG und die verbindenden Fasern (die durch die Pfeile gekennzeichnet sind). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: spezielle Ausrüstung benötigt für die Isolierung von Primärkulturen DRG. (A) chirurgische Instrumente benutzt in der Sammlung der DRG. Von links nach rechts: (ein) Dissektion Schere (groß), (b) Knochen schneiden, Zange, (c) Sektion Schere (klein), (d, e) zeigen, Pinzetten und (f) Mikro-Schere. (B) ein regelmäßiger Pasteurpipette und einer Flamme poliert Pasteurpipette. "a" bezeichnet den inneren Durchmesser von regelmäßigen Pasteurpipette und "b" bezeichnet das innere Durchmesser der Flamme poliert Pasteurpipette. b / a ≒ 0,9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die Morphologie der lebenden Zellen DRG. Live DRG-Zellen wurden von Mikroskopie überwacht. Zellen werden angezeigt (A) einen Tag nach der Aussaat, (B) zwei Tage nach der Aussaat, und (C) drei Tage nach der Aussaat. Pfeile zeigen Neuron und Pfeilspitzen zeigen Glia. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Immunostaining kultivierten Zellen DRG. DRG-Zellen wurden Immunostained mit Anti-CGRP Antikörper, Neuronen und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für die Kerne von Neuronen und Gliazellen zu zeigen. (A) CGRP Protein drückte sich in sensorischen Neurons Zellkörper und Axon Fasern. (B) Kerne von Neuronen und Glia waren mit DAPI gefärbt. (C) zusammengeführten Bild von A und B. Pfeil kennzeichnet eine Neuron und Pfeilspitze einer Gliazelle. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: die Freisetzung von Neurotransmittern aus kultivierten Zellen DRG. Die selektive NPFFR2 Agonist, dNPA, wurde verwendet, um die Freisetzung von CGRP und SP aus DRG Kulturen stimulieren. Die Abhängigkeit der Freisetzung von Neurotransmittern NPFFR2 wurde von transfecting Zellen mit SiRNA NPFFR2 überprüft. (A und B) nach DRG-Zellen wurden transfiziert mit NPFFR2 SiRNA oder nicht-targeting Kontrolle SiRNA (72 h), dNPA (5 Nmol) galt für 1 h induzieren die Freisetzung von CGRP und SP. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) ausgedrückt und analysiert wurden durch t wo-Way Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni post Hoc tests. p < 0,01, ***p < 0,001; im Vergleich zum entsprechenden Fahrzeug-Kontrollen (N = 12 pro Gruppe). Panels A und B wurden von Lin Et Al. modifiziert 22 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Artikel zeigen wir die Sammlung, Enzym-Dissoziation und Kultur der Ratte Lenden DRG. Mit der neurotrophe Unterstützung von NGF erweitert die Axone der DRG-Neuronen innerhalb von 3 Tagen nach der Aussaat der Zelle. Die erweiterte Axone waren eindeutig beobachtbaren, nachdem Zellen für CGRP Protein, gebeizt wurden die in der Zelle Soma synthetisiert und entlang den Axon Fasern transportiert. Die Prozesse der satellitenzellen auch erweitert, so dass diese teilenden Gliazellen umgeben die Neurone innerhalb von Tagen. Die primäre DRG-Zellen gewachsen durch dieses Protokoll eignen sich für Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die sensorische Neuronen zu regulieren. Hier fördern wir die Freisetzung von Neuropeptiden, CGRP und SP, von kultivierten DRG-Neuronen durch eine selektive NPFFR2 Agonist, dNPA. NPFFR2 ist die cognate Rezeptor für NPFF und wurde zur Teilnahme an Schmerz Empfindung und Verordnung Wege22,23berichtet. Die NPFFR2-Abhängigkeit von CGRP und SP-Version wurde weiter durch den Einsatz von SiRNA NPFFR2 überprüft.
DRG-Kulturen enthalten sensorischen Neuronen und Gliazellen Satelliten. Die Satelliten-Gliazellen Neuronen metabolische unterstützen und pflegen neuronale Funktionen9,10. In den Immunostaining Bildern, es ist leicht zu identifizieren, die Neuronen und Gliazellen, da ihre Kerne anders geformt sind (zeigen Sie in Abbildung 4 b). Die Existenz von Satelliten-Zellen in der Kulturschale könnte problematisch, wenn es eine experimentelle Nachfrage die spezifische Funktion der Neuronen und Glia zu unterscheiden. Zum Beispiel ist es unbestreitbar, dass satellitenzellen sich in der Entwicklung und Wartung von Schmerz11,24 engagieren, und in einigen Studien, die Aktionen von Neuronen und Gliazellen schwer wäre zu unterscheiden, mit DRG-Kulturen.
In diesem Protokoll gibt es ein paar wichtige Schritte, die erfordern besondere Vorsicht walten lassen. Zuerst, da die DRG gesammelt werden, außerhalb der laminaren Haube, Extraobacht während das Gewebe Inkasso achten Zelle Kontamination zu vermeiden. Sollte keine Notwendigkeit, einen sterilen Raum, wie in einem menschlichen OP Raum, schaffen aber Instrument Sterilisation und eine saubere Betätigungsraum sind unerlässlich. Tipps zur Vermeidung von Kontaminationen sind sterilisierte Instrumente auf die Sterilisation Beutel bei Nichtgebrauch zu halten und vermeiden unnötige Gegenstände zu berühren. Außerdem darf kontaminierenden Organismen auf Fell erfolgen, die an der Ratte Körper Stamm oder Handschuhe halten kann. Als solche sollten Fell und Blutflecken auf Handschuhe entfernt werden, durch die Reinigung mit 75 % Ethanol. Es ist auch hilfreich für den Betreiber tragen einen Mundschutz um Organismen aus dem Atem oder Speichel zu verhindern. Darüber hinaus sollten die 35-mm-Schale geschlossen zu halten, zu allen Zeiten und nur geöffnet, wenn Platzierung DRG innen seziert. Es ist wichtig, die 35-mm-Schale durch ein neues Gericht vor Enzym Verdauung zu ersetzen. Während der Verdauung Enzym nicht verlängern Sie die Inkubationszeit, da over Verdauung die Nervenzellen schädigen kann. Achten Sie darauf, die Trypsin-EDTA auf 37 ° C vorwärmen, um entsprechende Verdauung Wirkungsgrad zu erreichen. Die Effizienz wird drastisch reduziert werden, bei niedrigeren Temperaturen, und es wird schwierig sein, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erreichen, wenn der DRG von Flamme poliert Pasteurpipette verreiben. Flamme polieren die Pipette wird die Öffnung zu glätten und verhindern, dass die scharfen Glaskante der Neuronen zu verletzen. Überhitzung der Pipette mit einer Flamme wird stellen Sie jedoch Innen Durchmesser zu klein, und Gewebe - oder Handy-haltige Lösung werden schwer zu durchqueren. Dieser reduzierte Durchmesser verursachen auch viele Bläschen zu bilden während der Verreibung Stufe reduziert die Sammlerstücke Anzahl der DRG-Neuronen. Zu guter Letzt DRG Kulturen behandelt werden sanft zu allen Zeiten, besonders wenn Mittel- oder darstellende medikamentöse Behandlung zu ändern.
Die DRG-Neuronen werden berichtet, die am häufigsten verwendeten primären kultivierten neuronalen Zellen12. Sie können für eine Vielzahl von verschiedenen Studien von Elektrophysiologie oder Zelle Biologie bis hin zu erkunden die physiologischen oder pathologischen Funktionen der sensorischen Neuronen genutzt werden. Die größte Beschränkung der DRG Primärkulturen ist, dass sie nicht gut geeignet für Hochdurchsatz-Screening. Die Anzahl der Zellen, die von der DRG eine einzige Ratte gesammelt werden kann sind begrenzt, und die Neuronen sind nicht in der Lage, in der Kultur zu duplizieren. Wegen der begrenzten Handynummer wurden mehrere DRG-Hybridom-Zell-Linien oder verewigt DRG neuronale Zellformen entwickelt, um die Primärkulturen18,19,20ersetzen. Jedoch die Protein-expressionsprofile von DRG-Zell-Linien möglicherweise nicht identisch mit der ursprünglichen DRG und jedes Modellsystem muss daher sorgfältig geprüft werden. Abgesehen von den Zellen im Labor zu isolieren, wurden Ratte embryonale oder neonatale DRG-Neuronen im Handel zur Verfügung gestellt. Daher kann Kauf von kommerziellen Quellen eine praktikable Alternative zu frisch zubereiteten DRG Kulturen sein.
DRG Primärkulturen haben seit vielen Jahren als eine wertvolle experimentelles Werkzeug eingesetzt, die meist in Schmerzen im Zusammenhang mit Studien angenommen wird. Dieses Modellsystem ist wahrscheinlich nicht in naher Zukunft ersetzt werden. Mit guter Qualität DRG-Neuronen können Wissenschaftler stabile und reproduzierbare Ergebnisse erhalten, die viele Bereiche der Neurowissenschaften Studie profitieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. M. Calkins für englische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) und Ministerium für Wissenschaft und Technologie (105-2320-B-182-012-MY2) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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