Summary
שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.
Abstract
שורש העץ הגרעינים (DRG) מכילים תא גופות של נוירונים סנסוריים. סוג זה של נוירון הוא unipolar מדומים, עם שני אקסונים זה innervate רקמות היקפיים, כגון עור, שריר, איברים מהבטן, כמו גם הקרן בעמוד השדרה הגבי של מערכת העצבים המרכזית. החישה הניריונים לשדר תחושה הסומטית, כולל מגע, כאב, תחושות תרמי, נראה שההתפתחות שלהם. לכן, תרבויות העיקרי DRG נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים התאיים של nociception, פונקציות פיזיולוגיים של נוירונים סנסוריים, והתפתחות עצבית. ניתן ליישם את הנוירונים בתרבית מחקרים שכללו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, שחרור נוירוטרנסמיטר או סידן הדמיה. עם תרבויות העיקרי DRG, מדענים ייתכן תרבות הפומבית נוירונים DRG כדי לעקוב אחרי שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, התגברות על רבים מן המגבלות המשויך ויוו ניסויים. בהשוואה מסחרית זמינים שורות תאים DRG-ליפידים או מונצחים שורות תאים עצביים DRG, הרכב ואת המאפיינים של התאים הראשי דומים הרבה יותר החישה הניריונים ברקמות. עם זאת, בגלל מספר מוגבל של בתרבית תאים DRG הראשי ניתן לבודד מחיה יחיד, קשה לבצע מסכי תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. במאמר הנוכחי, מתוארים הליכים DRG אוסף ותרבות. בנוסף, נדגים את הטיפול בתרבית תאים DRG עם אגוניסט של neuropeptide FF קולטן מסוג 2 (NPFFR2) כדי לעודד את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים פפטיד (פפטיד הקשורות ג'ין קלציטונין (CRGP), חומר P (SP)).
Introduction
הגופות בתא החישה הניריונים נכללות DRG. נוירונים אלה unipolar מדומים, innervate רקמות היקפיים והן על מערכת העצבים המרכזית. קצות העצבים ההיקפיים של נוירונים סנסוריים מצויים שרירים, עור, איברים מהבטן, העצם, בין רקמות אחרות,. הן מעבירות תחושה היקפיים אותות עצבים סופים הקרן בעמוד השדרה הגבי, את האותות מועברים לאחר מכן אל המוח דרך מסלולים שונים בסדר עולה של תחושה סומאטית1,2. התחושה סומאטית מאפשר לגוף להרגיש (קרי, מגע, כאב, תחושות תרמי) וקולטים תנועה ו-1,מרחבית (תחושות נראה שההתפתחות שלהם)3. יש ארבע מחלקות של האקסונים מביא הראשי, כולל קבוצת אני הסיבים (Aα) להגיב קינסטזיה של שרירי השלד, סיבי II (Aβ) קבוצה מגיבים mechanoreceptors של העור, וקבץ השלישי (Aδ) וסיבים V (C) של קבוצה מגיבים לכאב, טמפרטורה. רק את סיבי C הם unmyelinated, ואילו השאר הם סיבי העצב על דרגות שונות.
Nociceptors הם נוירונים סנסוריים העיקרי, אשר מופעלים על ידי גירויים רעילים (גירוי מכני, תרמי, כימי) שנושאים פוטנציאל נזק לרקמות. נוירונים אלה מורכבים סיבי העצב סיבי Aδ ו- unmyelinated C סיבים1,4. הסיבים Aδ אקספרס קולטני גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי, קולטן trkA), CGRP של SP. סיבי C מסווגים peptidergic או אי-peptidergic סיבי C. מצד שני, סיבי C peptidergic שאינם מבטאים את קולטני neurotrophic גליה-derived factor (קולטנים GDNF, רט ו- GFR), isolectin IB4 של יונים ממותגת ATP ערוץ המשנה (P2X3)5,6,7. Nociceptors יכול להיות מכובד על-ידי הביטוי של תעלות יונים, מופעל על ידי גורמים neurotrophic, ציטוקינים, neuropeptides, ATP או כימיקלים אחרים תרכובות8. על גירוי, נוירוטרנסמיטרים, כולל CGRP, SP ו גלוטמט יכול להשתחרר מהתחנות נוירון חישה ב הצופר בעמוד השדרה הגבי לשדר אותות nociceptive2. DRG אינם רק המורכבת של נוירונים, אך גם להכיל לוויין גלייה. תאי לוויין להקיף את החישה הניריונים, מספקים תמיכה מכנית וחילוף9,10. מעניין, יש גוף גדל והולך של ראיות המצביעות על לוויין גלייה ב הרפובליקה עשויים להיות מעורבים בוויסות תחושה כאב11.
החישה הניריונים דווחו ביותר לעתים קרובות משמש ראשי תאים עצביים12 , כבר נעזרו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, ומחקרים שחרור נוירוטרנסמיטר. הם גם משמשים כדי לחקור את המנגנונים התאיים של ההתפתחות העצבית, כאבים דלקתיים, כאב נוירופטי, תחושה בעור (כמו גירוד) האקסון תוצר12,13,14,15. להיות תרבותי תרבויות העיקרי DRG כמו נוירונים חלופה מועדפת כדי להעריך שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, מאפשרת למדענים לבצע מחקרים כי לא ניתן לבצע במקצועות ניסיוני. לאחרונה, DRG היו בהצלחה תרבותי של תורמי איברים אנושיים אשר ייתכן נהנים מאוד המחקר translational16. מצד שני, גם יכול להיות תרבותי החישה הניריונים כפי DRG explants. Explants DRG לשמר את הארכיטקטורה הרקמה המקורית של הנוירונים, לרבות תאי שוואן ותאי גלייה בלוויין, הן שימושיות במיוחד ללמוד אינטראקציות בין עצביים ותאי שאינם עצבית17. תרבויות העיקרי DRG ניתן להכין בקלות בתוך 2.5 h. תא הרכב ואת מאפייני הן מאוד רעיוני של מקור DRG, בתור שכזה, ניתן לאסוף DRG ספציפי (או בית החזה המותני DRG) בהתאם לדרישות ניסיוני. תרבויות של נוירונים DRG עובריים ו neonatal לדרוש גורם הגדילה העצבי לשרוד זירוז תוצר האקסון, אבל תרבויות של נוירונים בוגרים שאינם מצריכים התוספת של גורמים neurotrophic12,מדיה17. ישנם גם זמינים מסחרית שורות תאים DRG-ליפידים כגון ND7/23 והוא F11, שאינן דורשות השימוש של חיות ניסוי. עם זאת, העדר הקטיון פוטנציאליים קולטן ארעי ערוץ חבר תת V 1 (TRPV1) ביטוי (סמן חשוב עבור קטן החישה הניריונים nociceptive), ביטוי גנים incongruent פרופילים להגביל שלהם יישומים18. לאחרונה, מונצחים DRG עצביים תא קווים עיטורית שאבו עכברוש (50B11)19 ועכבר (MED17.11)20, אשר מתאימים עבור השתמש במסכים תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. עם זאת, ביטוי גנים פרופילים עבור שורות תאים אלה טרם שיש לבצע. כך, הניסויים אימות השוואת לתאי החישה הניריונים immortalized אלה הם עדיין בעיצומה.
NPFFR2 הוא מסונתז הרפובליקה, translocated אל המסופים העצבים החישה עמוד השדרה הגבי קרן21. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול culturing תאים DRG המותני ועיבוד אותם עם אגוניסט של NPFFR2 לזירוז בשחרור של נוירוטרנסמיטרים, CGRP ו- SP. התלות NPFFR2 נבדק עוד יותר באמצעות NPFFR2 קטן מפריעות RNA (siRNA), אשר עשוי להיות transfected לתוך התאים DRG בתרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות בזאת המשתמשות חיות ניסוי אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה (IACUC) של צ'נג קונג אוניברסיטת (CGU 13-014).
1. איסוף DRG המותני חולדות הניסוי
- השתמש 2 כדי 3 בת שבוע ספראג-Dawley (SD) חולדות לאוסף DRG המותני.
הערה: נוירונים DRG שנאסף חולדות מעל גיל 4 שבועות לא צומחים גם תחת תרבות לתנאים המפורטים להלן. - לעקר כל מכשירי ניתוח ב החיטוי.
- עזים ומתנגד העכברוש בתערובת 1:1 של tiletamine ו- zolazepam (20 מ"ג/ק"ג; הזרקת בקרום הבטן (IP)) והמתן עד החיה מראה שום תגובה רגל-גמילה במבחן הבוהן-קורט.
הערה: אסטרטגיות הרדמה שונים יכולים לשמש בהצלחה פרוטוקול זה. - להקריב את החולדה ע י עריפת ראשו עם הגיליוטינה מסחרי.
- השתמש הגיליוטינה כדי לבודד את תא המטען של הגוף של העכברוש בין forelimb לבין עצם הירך. ראה איור 1A עבור דיאגרמה של האזור להיות שנאספו.
הערה: השורה שגזרת סימטרית צריך להיות רק rostral את עצם הירך. להוציא את DRG L6 המותני אם האתר לחתוך גבוהה מדי השדרה. - חתך לאורך עצם החזה ולהסיר כל האיברים/רקמות עם חיתוך מספריים (איור 2 א-).
- חותכים לאורך הצד של תא המטען כדי לאסוף את החלק הגבי של העכברוש ולהסיר את העור. ראה איור 1B תצלום של המטען הגבי גזור.
- להכין את הרקמות על הקרח לפני איסוף DRG. לנקות את הפרווה ואת הדם של כפפות, ולחטא אותם עם 75% אתנול לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הסר את השרירים המכסים עמוד השדרה המותני. ראשית, להפוך שני חתכים לאורך צידי השדרה (ימינה ושמאלה) אחד חתך לרוחב כדי לסמן את מידת rostral של עמוד השדרה המותני. לאחר מכן, הסר את שרירי עמוד השדרה הגבי עם מלקחיים חיתוך עצם (איור 2 א-ב).
- להסיר את החלק הגבי של החוליות עם מלקחיים חיתוך עצם ולחשוף את חוט השדרה.
- הסר את חוט השדרה עם מספריים לנתיחה (איור 2 א-ג), מלקחיים (איור 2 א-ד).
- לזהות את DRG המותני בספירת חוליות מן הצלע האחרונה (13 חוליה בית החזה). ראה איור 1C דיאגרמה של עמדות חוליות.
- לאסוף DRG המותני הדו-צדדיים (L1-L6) עם מיקרו-מספריים (איור 2 א-f) לתוך תבשיל תרבות 35 מ מ 2 מ"ל בינונית ללא סרום קר כקרח. הסר את סיבים עצביים (כפי שמצוין באיור 1C) להתחבר DRG ולאחר מכן להעביר אותו לתוך המנה תרבות כדי לשפר את הטוהר של התרבויות.
הערה: הרפובליקה שנאספו יכול להישמר בינוני על קרח לשעה בערך. בינתיים, חולדות מרובים יכולים להרדימם ליצירת מאגר גדול יותר של DRG.
2. ראשי תרבות של עכברים עץ DRG
הערה: השלבים הבאים צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
- להכין תרבות בינוני המכיל 10% סרום שור עוברית פירובט נתרן 100 מ מ, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין 1 x DMEM-F12.
- המעיל התרבות התאים שטופלו 24-ובכן צלחת עם 200 µg/mL פולי-L-ליזין כבר שעתיים ואז לשטוף עם מים מעוקר.
- מראש דגירה המנה תרבות עם תרבות 1 מ"ל במדיום חממה2 ° 37 C CO לפני השימוש למשך 30 דקות לפחות.
- להעביר את המנה 35 מ מ המכילות DRG ברדס למינריות, לשטוף את הרפובליקה בינונית ללא סרום 3 פעמים על ידי פיפטה.
הערה: החלק החיצוני של המנה צריך לנקות עם 75% אתנול לפני העברת לתוך המנוע. המנה 35 מ מ יכול להכיל DRG ממספר חולדות (זה יהיה תלוי בדרישות של הנבחנים). - להזיז את DRG (מעכברוש בודד או בשילוב של חולדות מרובים) לצלחת תרבות 35 מ מ חדש, אשר מכיל 2 מ"ל של collagenase מסוג IA (1 מ"ג/מ"ל במדיום נטול סרום) עם פינצטה סטרילי (איור 2 א-י).
הערה: הפתרון collagenase צריכים לעקר על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 של מזרק מיקרומטר. - לעכל את DRG בהפתרון collagenase חממה2 ° 37 C CO למשך 30 דקות.
- הסר את הפתרון collagenase ומאוזנת לשטוף DRG 3 פעמים ב 2 מ"ל האנק של תמיסת מלח (HBSS).
הערה: ייתכנו שאריות סיבים או רקמות שיורדות הרפובליקה לתוך הפתרון. להסיר אותם באמצעות פיפטה עם הפתרון כביסה. - להוסיף 2 מ"ל מראש חימם 0.05% טריפסין-EDTA לתוך צלחת 35 מ מ המכילות DRG תקציר הרפובליקה בחממה2 37 ° C CO למשך 30 דקות.
- העברה mL 2 של פתרון המכילות DRG שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות פיפטה מזכוכית.
הערה: הרפובליקה עלול לדבוק פיפטה מזכוכית אז שלב זה צריך להתבצע בזהירות. אובדן DRG יכול להימנע על ידי שמירה על הפתרון המכילות DRG בסוף מחודדות פיפטה מזכוכית (כ- 0.5 מ"ל) והעברת הפתרון לתוך הצינור צנטריפוגה לאט אבל בלי הפסקה. - Centrifuge הפתרון ב x 290 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע והוסף 2-mL ללא סרום באמצעי אחר כדי resuspend הרפובליקה.
- חזור על שלב 2.10 2 פעמים אבל שינוי המדיום ללא סרום לבינונית תרבות ומחוממת מראש על הפעם האחרונה.
- באופן ידני triturate הרפובליקה כ-60 פעמים באמצעות פיפטה פסטר מלוטשים להבה (אורך 230 מ"מ ו עצה ראש הקוטר הפנימי 1 מ"מ). ראה איור 2B עבור תצלום השוואת כגדולים של פיפטה פסטר מלוטשים להבה על פיפטה הלא מלוטשים.
הערה: הבתוך בקוטר של פיפטה פסטר הלהבה מלוטשים הוא קטן יותר מאשר פיפטה שליטה כ- 10%, בתוך הסוף מחודדות צריכה להיות חלקה יותר. יש להיזהר לא ליצור בועות כאשר triturating את התאים. - הסר את המנה פולי-L-ליזין-מצופה החממה2 CO. האחות המדיום תרבות incubated מתוך קערה, זרע את התאים dissociated לתוך קערה מצופה.
- זרע תאים DRG מן עכבר אחד (דו צדדיים אוסף של L1-L6, עבור DRG הכולל 12) לתוך מארבע בארות של צלחת 24-טוב; ישנם כ 5 x 104 תאים אחד טוב של צלחת 24-. טוב.
הערה: צפיפות זו הוא מתאים זיהוי CGRP שהופצו או SP ומתאים גם immunostaining. תספיג חלבון או החילוץ-RNA, זרע את התאים DRG עכבר אחד (דו צדדיים L1-L6) לתוך אחד טוב של צלחת 6-. טוב. - להחליף את המדיום תרבות למחרת עם התוספת של 10 מיקרומטר cytarabine (Ara-C) ו- 100 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה העצבי, לרענן את המדיום בכל יומיים לאחר מכן.
הערה: הרפובליקה בית החזה גם יכול גם להיות תרבותי על ידי פרוטוקול זה, אם הם היו שנאספו מעמוד השדרה החזי.
3. תרביות תאים של NPFFR2 siRNA בתאים DRG
- לבצע תרביות של תאים של NPFFR2 siRNA ושליטה siRNA לפי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: הפרוטוקול יהיה צורך להתאים אם הכימית תקנים שבחרת שונה מזו שהיינו (ראה את הטבלה של חומרים). - ביום השלישי לאחר יופיצ תא, שנה המדיום לבינונית 0.5 mL חם מראש ללא סרום, דגירה הרפובליקה בחממה2 37 ° C CO לשעה.
- להוסיף 50 ננומטר של siRNA (ב 1 µL RNase נטול מים) לתוך ללא סרום בינוני 12.5 µL.
- הוספת ריאגנט תרביות תאים µL 2.5 לתוך בינונית ללא סרום µL 10.
- מערבבים את פתרון מהפתרון שלבים 3.3 ו- 3.4 באמצעות פיפטה, דגירה תרביות תאים מעורב הזה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את הפתרון תרביות תאים לתוך צלחת 24-ובכן אחד המכיל DRG ומערבבים הפתרון בינונית ע י ניעור עדין.
הערה: פתרונות תרביות תאים מרובים כדאי לפרוס באותו זמן אם מספר בארות צריך להיות transfected. - דגירה הרפובליקה בחממה2 CO 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
- להוסיף 0.5 mL/טוב של תרבות בינוני המכיל 20% סרום שור עוברית פירובט נתרן 100 מ מ, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין 1 x DMEM-F12, עם התוספת של 10 מיקרומטר Ara-C ו- 100 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה העצבי, המשקולת 24-. טוב.
- דגירה הרפובליקה בחממה2 37 ° C CO עבור h 66 אחר (רענון המדיום-48 שעות).
4. בשחרור של נוירוטרנסמיטרים מתאי DRG ראשי
- ביום השישי לאחר תאים מצופים (72 h לאחר siRNA תקנים), לשנות את המדיום תרבות בינונית ללא סרום µL 200, דגירה התאים חממה2 ° 37 C CO למשך 30 דקות.
- להוסיף 1 µL גירוי chemical(s) ומערבבים בעדינות התקשורת על-ידי pipetting. תקופת דגירה המנה בחממה2 37 ° C CO של סדר מסוים.
הערה: במאמר זה, התאים בתרבית היו מגורה עם אגוניסט NPFFR2, dNPA (Phe D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg--NH2, 5 nmol), עבור 1 h. - לאסוף את המדיום תרבות מן התרבות מאכל צנטריפוגה ב 5,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר כל הטומאות מושעה.
- לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה, לדלל את הדגימות בתמיסת באגירה פוספט (PBS), לפי הצורך. Assay רמות נוירוטרנסמיטרים עם ערכות מתכלה (EIA) אנזים.
הערה: כאן, supernatants היו בטחונות מדולל לפני ניתוח הרמה של CGRP. תגובת שיקוע היה לא מדולל לפני ניתוח הרמה של SP.
5. CGRP ו- SP EIA
- לנתח את הדגימות מיד על פי פרוטוקול CGRP או SP EIA קיט של היצרן.
הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם ערכת בשימוש. - לשטוף הבארות CGRP EIA 5 פעמים עם שטיפת המאגר שסופק בתוך הערכה.
- להוסיף 100 דגימות µL עם 100 µL anti-CGRP אצטילכולין אסטראז (AChE) מעקב הבארות CGRP EIA, ולהוסיף 50 דגימות µL, 50 µL anti-SP כאב מעקב 50 תרופת נגד-SP µL לתוך הבארות SP EIA.
- חותם הבארות CGRP ו- SP עם הסרט פלסטיק אשר מסופק בתוך ערכות.
- דגירה הבארות בין לילה ב 4 º C.
- לשטוף את בארות 5 פעמים עם CGRP או SP לשטוף מאגר ולהסיר כל הפתרון שיורית מן הבארות.
- הוספת ריאגנט של 200 µL אלמן לתוך הבארות CGRP או SP אשר מסופק בתוך ערכות EIA המתאימים.
- דגירה הבארות CGRP למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, דגירה הבארות SP במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. להגן על הבארות אור עבור שני מבחני.
- לקרוא את הצלחות בגל 414 nm, לחשב את התוצאות לפי הכלי המתאים EIA.
הערה: להימנע מלגעת בתחתית הבארות ביד כל הזמן, לנקות את הכתמים מים מהתחתית היטב על ידי עדשה ניקוי מגבונים לפני הוספת ריאגנט של אלמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החולדה המותני DRG הנוירונים, תרבותי לתוך צלחת 24-ובכן, גדלו במדיום תרבות נוספים Ara-C כדי לעכב את התפשטות תא גליה, גורם הגדילה העצבי לתמוך בצמיחה עצביים. המורפולוגיה של החיים DRG תאים נצפתה. כפי שמוצג באיור3, בגוף התא של נוירון אחד היה מצורף בתחתית צלחת על יום 1 ונבחר להשגחה. האקסון הצמיחה היה פיקוח מיום 1 – 3. וזאנה משוכפלים והרחבה תהליכים להקיף לגוף התא של נוירון חישה. בתרבות אחרת, חלבון CGRP היה מוכתם כדי לחשוף את הצורה של נוירונים. איור 4, צביעת חלבון CGRP מופיע ציטופלזמה, האקסונים של נוירונים סנסוריים. מורפולוגיות הגרעין של נוירונים ותאי גלייה הם ברורים כאשר צבעונית עם דאפי. הנוירונים יש גרעין גדול ועגול יותר מאשר גלייה. לשם השוואה, הגרעינים של עכשיו, דונלד הם יותר אובלית (איור 4B).
אגוניסט NPFFR2 סלקטיבית, dNPA, השתמשו כדי לעורר את שחרורו של CGRP ו- SP. יתר על כן, התלות של שחרור dNPA-גירוי עצבי NPFFR2 נבחנה על ידי תאים transfecting עם NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA siRNA או פקד היו transfected לתוך התאים DRG העיקרי 72 h לפני טיפול אגוניסט. DRG תאים שטופלו dNPA (5 nmol) עבור 1 h ואת שחרורו של CGRP ו- SP נמדדה על ידי ערכות EIA נפרדים. הסימולציה של DRG עם dNPA גדלה רמת CGRP SP בתקשורת (איור 5 א, ב'). עם זאת, רק שחרור CGRP הנוצרות על-ידי dNPA היה מעוכבים על ידי ביטוי של siRNA NPFFR2 בתאים DRG בתרבית. התוצאות המוצגות באיור 5 שונו מפרסום הקודם, משמשים כאן עם הרשאה22.
איור 1: דיאגרמות עיבוד רקמה. DRG המותני נאספים של חולדות בת שבוע 3. (א) העמדות איפה הגיליוטינה אמור לשמש לחתוך את החיה מצוינים באמצעות קווים מנוקדים. להסיר תא המטען הגבי עם העור (B), (ג) המיקומים של DRG המותני (מ L1-L6) מוצגים. תותב מייצג את DRG הסיבים המחבר (אשר יצוינו באמצעות החצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ציוד מיוחד לצורך בידוד תרבויות העיקרי DRG. (א) כלי ניתוח שימוש באוסף של DRG. משמאל לימין: () חיתוך מספריים (גדול), עצם (b) חיתוך מלקחיים ומספריים לנתיחה (c) (קטן), (d, e) הצבע פינצטה, (f) מיקרו-מספריים. פיפטה פסטר רגיל (B) A, על פיפטה פסטר מלוטשים להבה. "a" מציין הפנימי בקוטר של פיפטה פסטר רגיל, ו "b" מציין הפנימי בקוטר של פיפטה פסטר הלהבה מלוטשים. b / a ≒ 0.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: המורפולוגיה של חיים תאים DRG. תאים חיים DRG נוטרו באמצעות מיקרוסקופ. והתאים מוצגים (א) יום לאחר זריעה, (B) יומיים לאחר זריעה, ו- (ג) שלושה ימים לאחר זריעה. חיצים מציינים נוירון ולציין ראשי חץ עכשיו, דונלד. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Immunostaining של תאים בתרבית DRG. תאים DRG היו immunostained עם נוגדן anti-CGRP להראות נוירונים, ו- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) עבור הגרעינים של נוירונים ותאי גלייה. (א) CGRP חלבון בא לידי נוירון חישה תא גופות וסיבים האקסון. גרעינים (B) של נוירונים, עכשיו, דונלד, היו מוכתמים דאפי. (ג) ממוזג תמונה מא' ב' החץ מצביע על נוירון ואת ראש החץ מצביע על תא גליה. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: השחרור של הנוירוטרנסמיטרים בתרבית תאים DRG. אגוניסט NPFFR2 סלקטיבית, dNPA, שימש כדי לעורר את שחרורו של CGRP ו- SP מתרבויות DRG. התלות של שחרור נוירוטרנסמיטר NPFFR2 אומתה על ידי תאים transfecting עם NPFFR2 siRNA. (A ו- B) לאחר DRG התאים היו transfected עם NPFFR2 siRNA או ללא פילוח siRNA שליטה (72 h), dNPA (5 nmol) הוחלה על h 1 לגרום לשחרור CGRP ו SP. מבוטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) ונתונים נותחו על ידי t וו-הדרך השונות (ANOVA) עם Bonferroni פוסט הוק בדיקות. p < 0.01, * * *p < 0.001; לעומת שולט ברכב המתאים (N = 12 לכל קבוצה). לוחות A ו- B שונו מ. Lin et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר הנוכחי, נדגים את האוסף, אנזים-דיסוציאציה והתרבות של עכברוש המותני DRG. עם תמיכה neurotrophic של גורם הגדילה העצבי, האקסונים של נוירונים DRG מורחב בתוך 3 ימים לאחר תא זריעה. האקסונים המורחבת היו בבירור הנצפה לאחר התאים היו מוכתם CGRP חלבון, אשר מסונתז בסומה תא והוא מועבר לאורך הסיבים האקסון. התהליכים של תאים הלוויין גם מורחב, המאפשר אלה גלייה החלוקה להקיף את הנוירונים בתוך ימים. התאים DRG העיקרי מיוצרת על ידי פרוטוקול זה מתאימים חקירות המנגנונים הסלולר המסדירים נוירונים סנסוריים. כאן, אנו לעורר את שחרורו של neuropeptides, CGRP ו- SP, מן הנוירונים DRG בתרבית על ידי אגוניסט NPFFR2 סלקטיבית, dNPA. NPFFR2 הוא רצפטור NPFF cognate, דווחה להשתתף כאב תחושה ורגולציה מסלולים22,23. NPFFR2-התלות של שחרור CGRP ו- SP אומתה עוד יותר על ידי שימוש NPFFR2 siRNA.
תרבויות DRG מכילים החישה הניריונים והן בלוויין גלייה. לוויין וזאנה לספק תמיכה מטבולית את הנוירונים ולשמור על פונקציות עצביים9,10. בתמונות immunostaining, קל יותר לזהות את נוירונים ותאי גלייה, מאז בגרעין עוצבו באופן שונה (הצג באיור 4B). קיומו של תאים הלוויין בצלחת תרבות עלולה להיות בעייתית, אם יש דרישה ניסיוני להבחין בין הפונקציה ספציפי של נוירונים עכשיו, דונלד. לדוגמה, זה לא מוטל בספק כי תאים הלוויין מעורבים בפיתוח ותחזוקה של כאב11,24, וכי בחלק מהמחקרים, הפעולות של נוירונים ותאי גלייה יהיה קשה להבחין באמצעות תרביות DRG.
פרוטוקול זה, ישנם כמה צעדים קריטיות הדורשות לנקוט משנה זהירות. קודם כל, מאז הרפובליקה נאספים מחוץ למכסה למינריות, נוספת להקפיד בתהליך איסוף הרקמה כדי למנוע זיהום תא. צריך להיות אין צורך ליצור חלל סטרילי, כמו בחדר ניתוח אנושי, אבל מכשיר העיקור ומרחב הפעולה נקי חיוניים. טיפים כדי למנוע זיהום כוללים שמירה על כלי הנגינה סטיריליים על עיקור לתיק כשאינו בשימוש, הימנעות את הנגיעות של פריטים מיותרים. כמו כן, מזהם אורגניזמים עשוי להתבצע על פרווה זה עשוי מקל המטען הגוף עכברוש או כפפות. ככזה, פרווה, כתמי הדם על הכפפות יש להסיר על ידי ניקוי עם 75% אתנול. זה גם עוזר למפעיל ללבוש מסיכה כירורגית למניעת העברת אורגניזמים נשימה או רוק. יתר על כן, המנה 35 מ מ צריך להיות כל הזמן סגור כל הזמן ופתח רק כאשר הצבת גזור DRG בפנים. חשוב להחליף את המנה 35 מ מ עם תבשיל חדש לפני אנזים עיכול. במהלך אנזים עיכול, לא להרחיב את זמן הדגירה, מאז עיכול יתר עלול לגרום נזק הנוירונים. הקפד לחמם את טריפסין-EDTA עד 37 ° C כדי להשיג יעילות עיכול המתאים. היעילות יקטן באופן משמעותי בטמפרטורות נמוכות, יהיה קשה להשיג השעיה תא בודד כאשר triturating הרפובליקה על ידי להבה מלוטשים פיפטה פסטר. להבה ליטוש של פיפטה חלקה כגדולים ולמנוע קצה זכוכית חד ופצעו את הנוירונים. עם זאת, התחממות יתר על פיפטה עם להבה יעשה הבתוך קוטר קטן מדי, רקמות או תא-המכילים פתרון יהפוך קשה מאוד לעבור. זה בקוטר מופחת עלול לגרום גם בועות רבות לטופס במהלך שלב trituration, מאוד לצמצם את מספר הנוירונים DRG לאספנים. לבסוף, צריך להיות מטופל DRG תרבויות בעדינות בכל עת, במיוחד בעת שינוי בינוני או ביצוע הטיפול.
הנוירונים DRG מדווחים להיות הנפוצות ביותר בשימוש ראשוני בתרבית תאים עצביים12. הם יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של מחקרים שונים, החל ביולוגיה אלקטרופיזיולוגיה או תא לחקור את הפונקציות הפיזיולוגיות או פתולוגית של נוירונים סנסוריים. המגבלה העיקרית של תרבויות העיקרי DRG היא שהם לא מתאים היטב להקרנה תפוקה גבוהה. מספר התאים העשוי להיאסף מן הרפובליקה של עכברוש בודד מוגבל, הנוירונים מסוגלים לשכפל בתרבות. בשל המספר מוגבל תא, מספר שורות תאים DRG-ליפידים או שורות תאים עצביים DRG מונצחים פותחו כדי להחליף את תרבויות ראשי18,19,20. עם זאת, פרופילי ביטוי חלבון של שורות תאים DRG לא בהכרח זהה הרפובליקה המקורי וצריך, לפיכך, כל מערכת מודל לאמת בקפידה. מלבד לבודד את התאים במעבדה, החולדה הנוירונים DRG עובריים או neonatal נעשו זמינים מסחרית. לכן, רכישה ממקורות מסחריים עשויים להיות אלטרנטיבה מעשית לתרבויות DRG המוכנים באופן טרי.
תרבויות העיקרי DRG שימשו במשך שנים רבות ככלי ניסיוני רב ערך זה בעיקר מאומץ במחקרים הקשורים לכאב. זו מערכת מודל סביר להחליפו בעתיד הקרוב. עם איכות טובה DRG הנוירונים, מדענים יכולים להשיג תוצאות לשחזור ויציבה להועיל בתחומים רבים של מדעי המוח במחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Calkins מ ר לצורך עריכה באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי צ'נג קונג לבית חולים (CMRPD1F0482), צ'נג קונג אוניברסיטת, המרכז לחקר הזדקנות בריאה (EMRPD1G0171), משרד המדע וטכנולוגיה (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
