Summary
ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM 関連の眼疾患の分子メカニズムを理解することに役立つでしょう。
Abstract
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は単一細胞の遺伝子発現解析、組織切片の細胞集団を濃縮します。LCM は、細胞分化と開発と緑内障を含むさまざまな病気の進行の基礎となる分子メカニズムの研究のための素晴らしいツールです。緑内障は、進行性視神経症の家族で構成されは、不可逆的失明の最も一般的な原因です。構造変化と小柱網 (TM) 内の損傷は、緑内障の開発のための主要な危険因子である増加の眼内圧 (眼圧) で起因できます。ただし、関与する正確な分子メカニズムはまだよくわかっていません。遺伝子発現解析を実行する能力は、さらにこれらの細胞と眼圧と緑内障の開発の規則に於いての役割の機能に洞察力を得ることに重要になります。これを達成するため、高度を隔離するための再現可能な方法と濃縮マウスの目と下流の遺伝子発現解析法の凍結切片から TM で、Rt-qpcr と RNA シーケンスが必要なよう。記載方法は、下流のデジタル PCR およびマイクロ アレイの分析のためマウスの目から非常に純粋な TM を分離するため開発されています。さらに、この手法は、他の高濃縮眼細胞とマウスの目から隔離することは困難されている細胞区画の隔離のために容易に適応することができます。LCM および RNA 解析の組み合わせは、緑内障の基礎となる細胞のイベントのより包括的な理解に貢献できます。
Introduction
緑内障は、視神経ニューロパチーと最終的に永続的な失明1,2につながる網膜症によって特徴づけられる疾患群です。2020 以上で全世界 7000 万人が病3,4,5,6、7のいくつかのフォームに生活すると推定されます。主な開放隅角緑内障 (POAG)、最も一般的なタイプの緑内障では、房 (AH) 流出増加眼圧 (IOP)8,9,10につながるの減少によって特徴付けられる 11,12,13,143,15,16,17,18。左の未処理、慢性的な高眼圧は、網膜と視神経乳頭径の色覚異常1,2,19を原因とする進行性で不可逆的な損傷に します。毛様体による AH の生産の率の減少またはそれの流出1,8,9,を高めることによって眼圧を低減に着目した緑内障の進行を遅らせるためのすべての現在の方法10,11,12,13,14. 小柱網 (TM) は、積極的に主要な AH 流出経路の調節に重要な役割を果たしているし、その関数の不適切な高血圧性緑内障1,2,19の原因因子であります。ただし、TM 機能不全と AH 排水を調節する方法に関連する分子メカニズムはまだ完全には理解されていないと緑内障研究1,2,19、の主要な焦点は、現在20しますいくつかのゲノムワイド関連研究 (GWAS) 持っている遺伝子の数がリンクしている緑内障と TM で AH 流出施設に抵抗の増加、病気につながるではない正確な分子メカニズムまだ完全に理解21 。,22,23,24,25。
動物モデルを大幅に拡充 (3,15,16,26,27,28、見直し広く緑内障進行の私達の現在の知識 29,30,31,32,33)。TM34,35,36を研究するいくつかの先駆的な方法が開発されているし、これらのメソッドは、正常と病気の組織の私たちの現在の理解を進めるため広く使用されています。広く探索されていない 1 つの領域は、遺伝子組み換えマウス TM 障害の分子機構を研究するモデルの使用です。遺伝子ノックインとミオシリン (Myoc)37,38とCyp1b139などの関連付けられている TM 遺伝子のノックアウト マウスの研究は、TM の分子機構を研究するための主要なツールをされています。関数。当然のことながら、マウス TM の小さなサイズは、この組織の研究を開始するために克服しなければならない深刻なハードルを表します。マウス モデルは、LCM の技術の進歩は、TM を含む最小かつ最も繊細な組織の研究に力を与えるに必要なツールを提供しながら、遺伝学と疾患の分子機構を研究するための強力なツールを表します。
このレポートでは、後続の RNA の隔離と下流の発現解析の増幅とともにマウスの目から高濃縮 TM の LCM を堅牢で再現性のある方法を紹介します。マウスで正常に同様のメソッドを使用されて目組織40,41,42,43,44の他の種類を分離するが、その他に報告した方法論を適用できます。RNA、マイクロ Rna、DNA およびタンパク質を研究する目の離散的組織。重要なは、この手法により、緑内障の眼疾患3,15,16,17 TM 障害発症の分子機構を理解するための遺伝子組み換えマウスの使用 ,18,26,31,45,46。LCM によってマウスの目の TM を分離する機能をさらにいくつかの眼疾患の分子メカニズムに洞察力を得ることに有用な手法となります。
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Protocol
環境健康科学の国立研究所 (NIEHS) 動物のケアおよび使用委員会 (ACUC)、NIEHS 動物研究提案 IIDL 05 46 下本研究のすべての方法論を承認しました。
1. 最適な組織コレクション レーザー顕微解剖用
- 2 歳 3 か月のマウスを取得男性または女性 C57BL/6。最低 1 分のまたは呼吸が停止している CO2と安楽死させます。動物をケージから取り外し、頚部転位, 茎頂切除や開胸による死を保証します。
- 解剖、解剖のすべてのツールは、清潔で滅菌確認してください。
注: 目の除去のため曲線はさみと鋸歯状の先端に鉗子 (先端サイズを優先: 0.5 × 0.4 mm) が必要になります。 - 目、簡単に利用できるように、マウスをその側で平らな面に置きます。眼球は、ソケットから簡単に撮影することができますまでガイドとして目のソケットを使用して目の周りカット、目から曲線に直面して、曲線はさみを使用し、マウスを安定させるために鉗子で外眼角 (角目) に把握 (ない曲線を使用して、 はさみの先端)。
- そっと引くし、視神経は、軌道のソケットから目を解放曲線はさみを使用してカットします。目とすすぎ 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x から非眼組織を注意深く取り外します。反対側の眼に 1.3 1.4 を繰り返します。
- 埋め込む前に、水分を除去する組織ワイプで目をしみ。ベンチ上に平行なレンズと視神経を矢状のセクションを取得するために、試験片金型 (25 × 20 × 5 mm3) に目を配置します。最適な切削温度 (O.C.T.) 化合物目を埋め込み、ドライアイス凍結の上に配置します。冷凍保存-80 ° C でブロック
2. レーザー顕微解剖用凍結切片作製
- 使用する前に、45 分の最大電力で UV 架橋剤のポリエチレン ポリエチレンテレフタ レート (PET) 膜スライドを孵化させなさい。
- ブラシ、鉗子、jar ファイルを結合し、チャックを取り付けに RNase 除染液をスプレーします。徹底的に拭いてください。ヌクレアーゼ フリー水ですすぎ、乾燥します。交差汚染を避けるために 100% エタノール クライオスタットを拭きます。
- クライオスタット-18 ° c を調整します。ドライアイス クライオスタットに-80 ° C のフリーザーから一度に 1 つの冷凍ブロックを削除し。10 分以上用クライオスタットの温度で平衡に冷凍のブロックを許可します。
- 取付チャンク (図 1 a) に O.C.T. の少量を絞ると組織ブロック、金型から削除し、慎重に取付チャック (図 1 b) ブロックを配置します。取付チャック組織ブロックが凍って、クライオスタット (図 2 a) の試料ホルダーに挿入します。
- 8 μ m のセクションをカットし、組織サンプルに到達するための O.C.T. ブロックを慎重にセクション クライオスタットを調整します。組織を観察すると、一度切断を停止、きれいなかみそりの刃を使用してすべての側で冷凍ブロックをトリミングしてペイント ブラシ (図 2 b) の処理を有効に組織を囲む O.C.T. の 3-4 mm のまま。サンプルのクロス汚染を避けるために各サンプルの変更間のロール プレートの代わりに新しいきれいなペイント ブラシを使用します。
- 迅速に作業の目を通してセクション。早いワンステップ ヘマトキシリンとエオシン (H & E) とスライドを洪水によってすべての 3 番目のセクション 60 のステイン汚れ s、水道水ですすいでください、自然乾燥、クリア剤でクリアし観察を持つ荷電ガラス スライドのマウントします。顕微鏡下で見るし、断面カットのセクションで TM が明らかになるまで続けます。
- TM を表示する開始、2 つのセクションをカット、H & E LCM を切るのためのマップを形成する染色をルーチンの荷電ガラス スライド上にマウントします。
注: は、地図と染色の詳細についてのセクション 3 を参照してください。 - 最初の H & E は、スライドをマップ後、カット 6 クリオスタットでシリアル 8 μ m 厚いセクションのラインアップし、ペット膜スライド (図 3 a, B) に同時にマウントします。簡単に膜の背面に沿って手袋をはめた親指をスライドさせて組織を付着します。取り付け後ドライアイスのスライド ボックスにペット膜スライドをすぐに配置します。
注: より少ないセクションをマウント可能性があります、ただし、各セクションが常温の空気にさらされている時間の量を制限することにより RNA の劣化を減らすために推奨はスライド上に複数のセクションを一度に取り付け。 - 目の 6 セクションごとの 2 つのペットの膜スライド後のセクション、H & E 染色の別の地図のスライドを作成する荷電ガラス スライド上の 2 つのセクションの収集を続けます。断面、約 100 シリアル 8 μ m 厚いセクション TM が表示されなくなるまで続けます。すぐに荷電ガラス スライド (2.6 を参照してください) の 1 つのセクションを染色して確認します。
- 後で LCM 使用-80 ° C ですべてのペット膜スライドを保存します。
3 H & E マップ スライドの汚損のプロトコルおよび形態学的検討
- 視覚化して荷電ガラス スライドで地図スライドをレビュー修正染色瓶にすぐに転送することによってティッシュいっぱい迅速定着液 100 mL で 7 s. リンスのスライドにそれを浸すことによって蒸留水 10-20 回、クリーンの蒸留水とカップリングの瓶にスライドを転送します。
- 水からスライドを外し、ティッシュで拭きます乾燥エッジのしみ。ピペット 200 μ L 変更各セクションにハリス ヘマトキシリンをフィルターし、インキュベートする 30 室温で s。慎重に水が明確な実行されるまで水道の流水下でスライドをすすいでください。ティッシュで拭きます (3.2 3.5 から各ステップ間のしみ) 各ステップ間のスライドの最後をしみ余分な液体を除去します。
- 30 室温で 1 × PBS の場所スライド s。その後、慎重に 30 の水道の流水下でスライドをすすいでください s。
- 95% エタノールお風呂に 3-4 回スライドを浸しなさい。15 インキュベートし、スライドの組織をカバーする十分なエオシン Y 色素溶液を適用室温で s。
- 2 回 10-20 各簡単なディップを持つ 95% エタノール バースのスライドをすすいでください。2 回 10-20 各簡単なディップを持つ 100% エタノール バースのスライドをすすいでください。その後、キシレン浴中 (10 20 クイック dip 各) 2 回スライドをリンスします。
- マウント樹脂マウント媒体を組織に適用することによって、慎重に空気の泡を回避し、フードで一晩乾燥させて下さい coverslip を追加します。
- 視覚的にまたはデジタル スライド スキャナーを使用して、H & E のスライドを確認します。TM 明確に表示され、切断のアクセスと地図のスライドを識別します。ペットを使用して、これらの間の膜のスライドは最小公倍数のスライドをマップします。
4. ポリエチレン ポリエチレンテレフタ レート (PET) 膜スライド加工・染色プロトコル
- 冷凍庫から削除ペット スライドは最初クレシル バイオレット 75% エタノール 20 mL に 0.3 g クレシル バイオレット酢酸を溶解することにより原液を準備し、上に置く前に 6 月より 2 h. フィルター 0.22 μ m 滅菌フィルター ユニットとは、もはや 4 ° c ストア ソリューションのシェーカーths。
- エオシン Y 1:4 の比率で新鮮な 75% エタノールのアルコール溶液を準備します。氷の上クリーン、ヌクレアーゼ フリー、50 mL コニカル ポリプロピレン チューブで固定 (75% エタノール) と脱水ソリューション (100% ・ 95%、75% エタノール) を準備します。各ソリューションに RNase 阻害剤を追加します。
- -80 ° C のフリーザーから凍結するティッシュ セクションを含むスライド ボックスを削除し、ドライアイスの上に置きます。時に 1 つのスライドを処理します。30 の冷たい 75% エタノールはすぐにスライドを配置することによって、スライドを固定 s。
- 優しくティッシュ セクションを妨げることがなく O.C.T. を溶解する 10-15 s のヌクレアーゼ フリー水のスライドを浸しなさい。
- 慎重にピペットのセクションに直接 1.5% クレシル バイオレット酢酸溶液を 300 μ l 添加し 45, 室温で s。30 s. ピペット 200 μ L エオシン Y ソリューションのセクションに 75% エタノールお風呂にそれを置くことによって 1 つの時間を洗浄し、3-5 秒間インキュベートします。
- エタノール 75%、95% エタノール, そして最後に、30 の 100% エタノールお風呂でその後スライドを配置することによって組織を脱水それぞれ秒。余分な液体を削除するすべてのステップの間にティッシュで拭きますスライドの最後をしみ。スライド空気 5 分のフードの下で完全に乾燥してみましょう。一度乾燥し、その後すぐに LCM を実行します。
注: この手順のキシレンの使用を避けるためにお勧め、それは不十分な結合膜スライドするティッシュ セクションを引き起こすことができます、組織捕獲の効率が低下します。
5. UV レーザー マイクロダイゼクション
- コンピューターをオンにし、ブートすることができます。顕微鏡ホワイト ライト電源を入れます。UV レーザー キーと黄色の LED が点灯を入れます。LCM ソフトウェアを起動、それが完全にロードしてライブ ビデオが表示されますを許可します。コント ローラー ボックスのレーザー ボタンを押すし、緑色の LED が点灯します。
- 顕微鏡ステージ上に新しいガラス スライドをロードしてステンド グラスの組織面をスライド ガラスの上に直接下向とペット膜スライドを配置します。顕微鏡ステージ上、膜とガラスのスライドがしっかりとペアであることを確認します。
- 最初にスライドの制限を設定して開始 LCM。最低 4 X を選択する目的のパネル (図 4) の倍率。その後、金属と膜が交わる左上隅がライブ ビデオ フィード、プレスのロードマップの「限界 1」ボタンや赤の四角形を表示で表示されるまで顕微鏡 xy ステージを移動することによって膜スライドの作業領域を定義します。次に、反対側の隅に xy ステージに移動し、「2 を制限する」ボタンを押します。膜やセットの制限の間の組織のロードマップ イメージを作成するには、「スキャン」ボタンを押します。
- ロードマップ内目のセクションの 1 つの TM の近くをダブルクリック、TM は、虹彩角膜角 (図 5 a) の頂点近くに位置することができます。TM が識別されたら、表示倍率 10 X、手動で TM にフォーカス。20 X、40 X 目標を繰り返します。TM 40 × 対物 (図 5 b) にフォーカスが、近くに空白領域に移動 (フォーカスは少し調整する必要があります)、「フリーハンド描画ツール」を選択し、組織の空白の領域に長い線を引きます。
- レーザーのパラメーターを設定「カット速度」は 34%、「フォーカス」は 58% であり「力」は 70 (図 4)、「カット」ボタンを押します。明確な切断線観察 (参照してください図 5) まで速度、フォーカス、および電源パラメーターに細かいレーザー調整を行います。精密切削、切削アクション次の描画線を確認します。
- 分離管蓋をキャップ ホルダーに読み込むし、チューブを開きます。キャップ上昇にキャップ ホルダーを取り付けます、チューブが反転していることを確認します。接着剤のキャップ材ははみ出て希望組織が正しくキャプチャされることを確認するためにキャップの先端を保証します。
- ソフトウェア パネルで「マニュアル」郭清モードを選択します。(図 5 b) TM は、絶縁管の直下に、慎重に確認します。ホワイト バランスを設定し、最適なイメージ品質 (図 4) を取得する明るさを調整します。
- 切削を開始、手動でフォーカスを調整し [フリーハンド] ツールを使用して線を描画、コレクション キャップがまだ触れて膜上の位置に残ることを必ずください。TM が強膜 (図 5) を満たしている近く描画部分円を押します「カット」最初のカットが終わったら、下の位置にキャップを配置し、フォーカスを再調整、プレス「カット」セクションから組織を収集し、TM の周りに円を完了する 2 つの部分の円を結ぶ空間あるいは無料で 2 つの線を描く、TM はマイクロダイ セクション キャップ (図 5 D F) で取り上げられたことを確認します。
- キャップの位置を上の位置に戻ると、残りのセクションに (5.2 5.8) を繰り返します。分離のすべてのサンプルがキャップに収まるし、(図 5) と重ならないので若干キャップの位置を調整します。一貫性を保つのため 1 つのスライドの時間帯は 20 分 1 匹少ないセクションのスライドをすべてのセクションから TM を隔離するためにより多くの時間が必要な場合使用です。次ペット膜新しい絶縁管を挿入し、セクション 5 を繰り返します。
6. Microdissected TM 組織の溶解
- 新鮮な LCM 分離した組織を溶解する RNA 換散バッファーを準備します。10 μ L β-メルカプトエタノールを各 1 mL の溶解バッファーに追加します。もはや 1 ヶ月以上の室温で β-メルカプトエタノールの換散バッファーを格納します。
- キャップ ホルダー、レーザーマイクロダイ セクションの開始から 20 分以内から絶縁管を削除します。TM の捕獲を確実に目でキャップ サーフェスを視覚化します。
- 慎重にピペットの換散バッファーを完全網羅した microdissected TM コレクション チューブの蓋に 10 μ L の換散バッファー。軽く接着剤のキャップを閉じ、コレクション チューブ逆さま 10 分室温で孵化させなさい。インキュベーション後、2 分間 800 x g で遠心し、ドライアイスのライセートを配置します。後の精製および分析-80 ° c の lysates を格納します。
7. RNA の隔離と質の分析
- 常温試料を融解によって RNA の品質を分析します。プール一緒にすべてのサンプルは、1 つ RNase フリー 1.5 mL および microfuge の管に単一のマウスから分離されました。
注: たとえば、各生物の複製の溶解液の 10 μ L の microdissected キャップが 10-12 チューブ生成され、すべての lysates 各生物の複製 (100-120 μ L ライセート) の単管に移った。 - 溶解した各ソリューションに作りたての 70% のエタノール (RNase フリーの水で作られた) の 1 つのボリュームを追加します。総 RNA RNA 分離キット ユーザー ガイドラインに従うを浄化します。各 RNA サンプルからゲノム DNA の除去を確保します。
注: ゲノム DNA は、下流の RNA 解析と干渉することができます。 - それぞれのマウスからのサンプルを一緒に分かち合うと (図 6 a) リボソーム RNA の整合性の分析により、TM から分離された RNA の品質を測定します。
注: TM のサイズが小さいためリボソーム RNA のピークでないかもしれない観測 (図 6 b) RNA の品質のプロファイル (2 つのピークが観察図 6 aCの 1,000-4,000 bp 間) (鈴) RNA の整合性を計算に用いられる47。- RNA の整合性をより正確に測定するとより豊富な膜スライド残り組織からの RNA を隔離します。代表鈴、ピペッティング 10 膜スライドの眼組織から特定の RNA を取得するには、μ L 換散バッファーの 1 つの組織切片上に、RNA の隔離を実行します。RNA の品質を分析し、鈴 (図 6) を計算します。
- 下流 RNA 用 TM を分離再現屈する配列や cDNA ライブラリを生成するための低入力 RNA キット結果 LCM のとして 80 セクションから使用します。
8. 解析
- 収集した組織が TM に関連する遺伝子で濃縮されて実際にことを確認、microdissected 全体の目、強膜、虹彩、網膜、角膜、3 独立したマウスからレンズから複数追加 RNA を収集します。TM と 4 独立したマウスから収集した毛様体を分離する使用 LCM との組み合わせでこの RNA からの RNA を収集します。
- Microdissected サンプルからの RNA は、cDNA cDNA 逆のトランスクリプション キットを使用してに変換します。LCM の隔離のサンプルからの RNA を増幅し、cDNA cDNA キット低入力 RNA を使用して変換します。
- 小柱網ミオシリン (MYOC), α アクチン 2 (ACTA2)、遺伝子を表現するためのすべての RNA を解析し、デジタル PCR (図 7 aB) によるHSP90a1ハウスキーピング遺伝子を用いた正規化します。
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Representative Results
LCM は、TM から RNA を収集し、4 の別のマウスから毛様体が遺伝子発現を分析し、全体の目、強膜、虹彩、網膜、角膜、3 つの独立したマウスから隔離されたレンズでその式を比較できるために分離されました。TM は遺伝子発現、 MYOC48 , ACTA249を分離 TM サンプルが TM で濃縮した確かに高いことを確認するためのすべての収集された組織に行った。LCM のサンプルからの cDNA の非常に低い量のためより少ない材料50再現可能デジタル PCR だった使用実証されました。MYOCとACTA2式HSP90a1ハウスキーピング遺伝子を使用して、正規化されたし、各組織が全体の目と比較しました。これらの結果表現することを示すMYOC (図 7 a) とACTA2 (図 7 b) は高い TM のサンプルで確認する下流の RNA のための高濃縮の TM のサンプルから高品質の RNA の分離を成功させる解析。概念の証拠として、この手法は TM 免 RNA WT マウスからは高架の IOP 表現型を持つマウスのひずみを準備し、マイクロ アレイ解析に適用されました。この分析には、TM の WT マウスと緑内障表現型 (図 7) とマウスの発現、緑内障に関与する多くの遺伝子が識別されます。
図 1: 凍結するティッシュの配置をクリオスタットでブロックします。(A) O.C.T 取り付け中は、クライオスタット取付チャンクに適用されます。(B)冷凍標本ブロックは取付チャックに均等に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: セクショニングのクリオスタットで凍結の眼組織のプロシージャです。(A)切断面の眼組織に到達するための準備。(B)レーザーマイクロダイ セクションを収集する前に冷凍ブロックのトリミング O.C.T.。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: クリオスタットの凍結切片を作製します。(A) 、クライオスタット、6 連続 8 μ m 厚い切片が並んでいます。(B)セクションは、同時にペット膜スライドのマウントされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: スクリーン ショットのレーザー顕微解剖ソフトウェアの重要な機能を強調表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 小柱網と小柱網の適切な分離の UV レーザーのパラメーター設定の場所。(A)レーザー顕微解剖用小柱網の強調表示ペット膜上の 1 つのセクションの (4 X) の低倍率。小柱網と隣接する組織の(B) (40 倍) の高倍率。(C)最初の部分的な円を最大の位置でキャップと強膜近傍 TM のカットします。(D)最終は下の位置にキャップと TM の周りに円を実行空き領域にカットします。(E) TM (F)キャップ取り付けられたセクションから削除します。(G)複数カット セクション重複していない同じペット膜から付着にカット キャップ。S (強)、サウスカロライナ(シュレムの運河)、 TM (小柱網)、 AC (前房)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: microdissected 小柱網組織から得られた総 RNA の収量と品質の推定。(A)小柱網の 80 のセクションからの総 RNA (近似領域のサイズは 0.8 mm2)。(B)小柱網の 20 のセクションからの総 RNA (近似領域のサイズは 0.2 mm2)。(C)レーザ切断後の残りの眼組織からの総 RNA。鈴、RNA の整合性の数。bp、塩基対。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: LCM の下流の RNA 解析分離小柱網。LCM によって分離された TM の TM に関連する遺伝子の定量的デジタル PCR 解析。TM に関連する遺伝子(A) MYOC (B) ACTA2 LCM において高い発現が目の他組織と比較して TM サンプルを捕獲しました。(C)小柱網 RNA のマイクロ アレイ解析から得られたデータから生成されたヒートマップ WT マウスと KO から高架の IOP 表現型を持つマウスを分離しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: ティッシュの準備最適化前に、と後の比較します。目のセクション カットし置いたペット膜スライド(A)標準の 95% エタノール脱水準備(B)または最適化された 75% エタノール脱水準備のいずれかの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
TM は積極的に中の恒常性の維持に重要な役割を果たしているし、機能障害は高血圧性緑内障1,2,19の主な原因となる要因として広く受け入れられています。GWAS 解析によって識別されるいくつかの遺伝子の一塩基多型の数は、増加の緑内障の危険と TM; で AH 流出施設に抵抗の増加にリンクされています。しかし、この病気を生じさせる詳細な分子メカニズムは、まだ完全には理解21,22,23,24,25ではありません。遺伝的マウスモデルでは、緑内障の分子機構を研究するための強力なツールを提供できます。ただし、マウス TM 組織の小さなサイズは、マウスの目と遺伝子発現解析のための高品質 RNA から濃縮 TM の隔離のための手ごわい挑戦を表します。LCM は単一または低細胞数を隔離するための貴重な技術を特定の細胞型の濃縮組織サンプルの遺伝子発現を研究するため。本研究では堅牢かつ再現可能な LCM 法、高濃縮 TM および遺伝子発現及びセルシグナ リング TM での規制を調査する使用することができます高品質の RNA を分離する説明します。さらに、説明の LCM 法は眼内の他の組織にも適用できます。
LCM の技術と組織の処理の最適化のためのディテールにこだわり、この手法の開発に成功した重要な役割を果たした。組織の温存との分離の方法論は、遺伝子発現プロファイリングのための高品質の RNA を隔離するのに重要なコンポーネントです。LCM 染色, 脱水、レーザーマイクロダイ質 RNA51を得ることに成功するの時間を解剖、セクショニング、固定、細部に非常に高い注目が必要です。組織切片厚を増やすことができます。ただし、厚さが増加するので、紫外線レーザーの電力が必要があります。RNA の劣化を引き起こす可能性が広いレーザー パスでレーザー パワーの結果を増加しました。8 μ m のセクションとレーザー パスが薄かったし、下流の RNA 解析のため十分な組織を提供ことがわかった。ティッシュの準備の最適化が、レーザーに能力を大幅に変更する方法を示しています図 8は、目から TM を解剖します。95% エタノール (図 8 a) ではなく、組織の脱水に 75% を使用するだけで優れた眼組織の固定化と O.C.T. (図 8 b) の完全な除去をもたらした (セクション 4 で説明されている) プロトコルではこの手順の最適化メディアをマウントを削除する RNase フリーの水で孵化が続きます。さらに脱水症状や汚損は、アルコール ベースの染色試薬を使用して実現されます。さらに、アルコール ベース染色試薬をもたらした上司水性染色試薬 (水ベース クレシル バイオレットまたはヘマトキシリン) を基準にして結果、さらに RNA の整合性52を維持に役立ちますが分かった。全体的に、最適化されたプロトコルを用いたアルコール ベース染色試薬をもたらした一貫した眼組織のセクション ペット膜スライドの完全に動員された眼の組織を処理します。
本研究の目標は高品質を隔離するための堅牢で信頼性の高い方法を開発、高眼圧、緑内障の根底にある分子メカニズムに洞察力を得るために下流の発現解析のためのマウスの目の TM から mRNA。図 7のヒートマップのように、LCM によって分離する TM の説明のプロトコルは、TM からの RNA を隔離し、野生型と変異マウスから TM の遺伝子発現の差異を検討するための非常に信頼性の高い方法を提供します。記載方法は研究者は比較的簡単で信頼性の高い体内システムで緑内障の病態の中心組織の分子分析を実行するようになります、遺伝子発現の解析に適用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
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