Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/57576
Automatic Translation
*1, *2, *1, 2, 2, 2,3, 2,4, 1
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Abstract

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) gen ifade analizi tek hücre izin ve hücre popülasyonlarının doku bölümlerde zenginleştirilmiş. LCM hücre farklılaşma ve geliştirme ve glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesini temel moleküler mekanizmaları incelenmesi için harika bir araçtır. Glokom, ilerici optik neuropathies bir ailenin oluşur, geri dönüşü olmayan körlüğü dünya çapında en sık nedenidir. Yapısal değişiklikler ve trabeküler meshwork (TM) içinde hasar glokom geliştirmek için önemli bir risk faktörü olan göz içi basınç artışı (gib), neden olabilir. Ancak, hassas moleküler mekanizmaları dahil hala kötü anlaşılır. Gen ifade analizi gerçekleştirme olanağı daha fazla bu hücreler ve rolünü IOP ve glokom gelişme Yönetmelikte işlevi anlayışlar elde etmek çok önemli olacak. Bunu başarmak için RT-qPCR ve RNA-Seq gereklidir gibi son derece izole bir tekrarlanabilir Yöntem TM fare gözler ve bir yöntemi için aşağı akım gen ifade analizi, donmuş bölümlerden zenginleştirilmiş. Burada açıklanan yöntemi son derece saf TM fare gözlerinden aşağı akım dijital PCR ve Mikroarray analiz için izole etmek için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, bu Teknik yalıtım diğer zenginleştirilmiş oküler hücreleri ve fare gözlerinden izole etmek zordu hücre bölmeleri için kolayca adapte edilebilir. LCM ve RNA Analizi kombinasyonu glokom temel hücresel olaylar daha kapsamlı bir anlayış için katkıda bulunabilir.

Introduction

Glokom optik nöropati ve sonuçta geri dönüşü olmayan körlüğü1,2' ye giden retinopati karakterize hastalıklar grubudur. Bu tarafından 2020 over 70 milyon kişi dünya çapında hastalığı3,4,5,6,7çeşit ile yaşıyor olacak tahmin edilmektedir. Birincil açık açılı glokom (POAG), glokom, en yaygın türü göz içi basınç artışı (gib)8,9,10' aönde gelen sulu mizah (AH) çıkış bir azalma ile karakterize, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sol tedavi edilmezse, kronik olarak yükseltilmiş IOP retina ve radyal körlüğü1,2,19neden optik sinir başı ilerici ve geri dönüşü olmayan zarar yol açar. Glokom gib, silier vücut tarafından Ah üretim hızını azaltarak veya bu çıkış1,8,9, artırılması tarafından azaltma konusuna önem ilerlemesini yavaşlatmak için tüm geçerli yöntemleri 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabeküler meshwork (TM) aktif olarak birincil AH çıkım yolu düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve uygunsuz işlevini hipertansif glokom1,2,19için sorumlu bir faktördür. Ancak, TM disfonksiyon ve nasıl AH drenaj düzenleyen ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmış değil ve şu anda önemli bir odak noktası glokom araştırma1,2,19, 20. çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) glokom ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç genleri bir dizi bağladığınız iken hastalığı yol değildir tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak21 anlayamadım , 22 , 23 , 24 , 25.

Hayvan modelleri büyük ölçüde geçerli bilgimizi (3,15,16,26,27,28', kapsamlı bir şekilde gözden glokom hastalığın ilerlemesinde gelişmiş var. 29,30,31,32,33). TM34,35,36 çalışmaya çeşitli öncü yöntemler geliştirilmiştir ve bu yöntemler yaygın olarak normal ve hastalıklı doku geçerli bizim anlayışı ilerletmek için kullanılmıştır. Değil kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır bir alan TM başarısızlık moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak değiştirilmiş fare modellerinin kullanımı olduğunu. Transgenik knock ve knock-out fare çalışmaları gibi Myocilin (Myoc)37,38 ve Cyp1b139, TM ilişkili genlerin TM moleküler mekanizmaları eğitim için birincil araçlar olmuştur işlev. Anlaşılır, farelerde TM küçük boyutlu bu doku çalışmaya başlamak için aşılması gereken ciddi bir engel temsil eder. Fare modelleri LCM teknolojik gelişmeler TM dahil olmak üzere en küçük ve en hassas dokuları çalışma güçlendirmek için gerekli araçları sunarken genetik ve moleküler mekanizmaları hastalık, eğitim için güçlü bir araç temsil eder.

Bu raporda, sonraki RNA izolasyon ve güçlendirme için aşağı akım ifade analizi ile birlikte fare gözlerinden zenginleştirilmiş TM LCM için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi açıklanmıştır. Benzer Yöntem başarıyla farelerde göz dokularının40,41,42,43,44diğer türleri yalıtmak için kullanılmıştır, burada bildirilen metodoloji diğerine uygulanabilir RNA, mikroRNA, DNA ve proteinler çalışmaya göz ayrı dokuların. Önemlisi, bu teknik TM bozukluğu glokom ve oküler hastalığı3,15,16,17 moleküler patogenezi daha iyi anlamak için genetik olarak değiştirilmiş fare kullanımı sağlar ,18,26,31,45,46. Yeteneğini LCM fare gözlerle TM izole etmek-ecek var olmak daha fazla birkaç oküler hastalıkların moleküler mekanizmaları anlayışlar elde yararlı bir yöntem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) NIEHS hayvan çalışma teklifi IIDL 05-46 altında bu çalışmanın tüm metodoloji onayladı.

1. en uygun doku koleksiyonu için lazer mikrodiseksiyon

  1. 3-ay-yaşlı fareler, 2'yi edinmek erkek veya kadın C57BL/6. Ötenazi CO2 en az 1 dk ya kadar solunum kesildiği tarih vardır. Kafes hayvan kaldırmak ve servikal yerinden çıkması, işten çıkarma veya torakotomi ölüm sizi temin ederim.
  2. Diseksiyon önce tüm diseksiyon araçları temiz ve steril olduğundan emin olun.
    Not: gözleri kaldırılması için eğri makas ve forseps ile tırtıklı uç (tercih edilen ucu boyutu: 0.5 x 0.4 mm) gerekli olacaktır.
  3. Göz kolayca erişilebilir olması kendi tarafında düz bir yüzeye fare yere bırak. Gözün yuvasından kolayca alınabilir kadar göz çukuru bir kılavuz olarak kullanarak göz çevresinde göz, uzak eğri bakan eğri makas kullanarak kesebilir ve daha sonra fare, stabilize etmek forseps ile kavramak canthus (göz ucuyla) (eğri değil kullanma ipuçları makas).
  4. Yavaşça çekin ve eğri makas kullanılarak, yörünge soket gözünden bültenleri optik siniri kesme. Dikkatle göz göz ve durulama 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x dokuyu. 1.3-1.4 kontralateral göz için yineleyin.
  5. Gömme daha önce herhangi bir nem kaldırmak için doku Temizleme işlemi gözle leke. Objektif ve optik sinir sagittal bölümler elde etmek için tezgah üstüne paralel göz numune kalıp (25 x 20 x 5 mm3) içine yerleştirin. En iyi kesim ısı (O.C.T. içinde) bileşik gözleri katıştırabilir ve dondurma kuru buza koyun. Donmuş bir kez blok-80 ° C'de depolayın

2. lazer mikrodiseksiyon için dondurulmuş bölümüne hazırlık

  1. Kullanmadan önce polietilen tereftalat (PET) membran slaytları UV cross-linker 45 dk için maksimum güçte kuluçkaya.
  2. RNase dekontaminasyon çözüm üzerine fırça, kavanoz kaplin ve chuck montaj forseps, sprey. İyice silin. Nükleaz ücretsiz su ile durulayın ve kuru. Cryostat ile % 100 etanol çapraz bulaşma kaçınmak için aşağı silin.
  3. Cryostat-18 ° C'ye ayarlamak Bir donmuş blok-80 ° C dondurucudan bir kerede kaldırmak ve cryostat Kuru buz ile teslim. Donmuş blok en az 10 dk cryostat sıcaklığı ile equilibrate izin verir.
  4. O.C.T. küçük bir miktar üzerine montaj yığın (Şekil 1A) sıkmak ve doku blok kalıptan çıkarın ve dikkatli bir şekilde blok montaj chuck (Şekil 1B) yerleştirin. Montaj chuck doku blokta sağlam dondurulur sonra cryostat (Şekil 2A) numune tutucu yerleştirin.
  5. 8 µm bölüm kesip dikkatle doku örneği ulaşmak için O.C.T. blok ile bölüm cryostat ayarlayın. Doku gözlenen sonra kesit durdurun, temiz bir jilet kullanarak her tarafta donmuş blok döşeme ve boya fırçası (Şekil 2B) ile işlemeyi etkinleştirmek IÇIN dokuyu çevreleyen O.C.T. 3-4 mm bırakın. Yeni bir temiz boya fırça rulo plaka örnek çapraz bulaşma kaçınmak için her örnek değişiklik arasında yerine kullanın.
  6. Bölümü hızla çalışmaya göz üzerinden. Slayt bir hızlı tek adımlı Hematoksilen ve eozin (H & E) ile sel tarafından üçüncü her bölüm için 60 leke leke s, musluk suyuyla durulayın, net Temizleme Aracısı kurutma ve mount bir coverslip ile dolu cam slayt üzerindeki. Mikroskop altında görüntülemek ve TM kesme bölümlerde belirgin olana kesit devam edin.
  7. TM görünmeye başladığında, 2 bölüm kesme ve H & E LCM ile kesme için bir harita oluşturmak için boyama için rutin bir dolu cam slayt üzerine monte.
    Not: Bölüm 3 harita ve boyama Ayrıntılar için bkz.
  8. İlk H & E slayt göster sonra kesip cryostat 6 seri 8-µm kalınlığında bölümlerde hizalayın ve aynı anda evde beslenen hayvan membran slayt (Şekil 3A, B) monte. Doku kısaca membran arka boyunca eldivenli başparmak kaydırarak uygun. Montaj sonra evde beslenen hayvan membran slayt hemen kuru buzda bir slayt kutusuna yerleştirin.
    Not: Daha az bölümleri monte, ancak, bir slayda birden çok bölüm aynı anda montaj RNA bozulması her bölüm oda sıcaklığında havaya maruz zaman miktarını sınırlayarak azaltmak için önerilir.
  9. Her iki evde beslenen hayvan membran slayda 6 bölümleri ile sonra gözlerinin, bölüm, H & E boyama için başka bir harita slayt oluşturmak için dolu cam slayt üzerindeki iki bölüm toplamak devam. Kesit, yaklaşık 100 seri 8-µm kalınlığında kesitler, TM görünene kadar devam edin. Hızlı bir şekilde şarj edilmiş cam slayt (bkz: 2.6) üzerindeki bir bölümü boyama tarafından onaylayın.
  10. Tüm evde beslenen hayvan membran slaytları daha sonra LCM kullanmak-80 ° C'de depolayın.

3. H & E harita slayt Protokolü ve morfolojik İnceleme boyama

  1. Görselleştirmek ve harita slaytlar dolu cam slaytlara İnceleme için doku hemen boyama kavanoza aktarma tarafından 100 mL hızlı sabitleme çözeltisi ile 7 s. durulama için slayt içine daldırma dolu düzeltme 10 - 20 kez distile su , slayt bir kaplin kavanoz temiz distile su ile aktarın.
  2. Slayt sudan çıkarın ve kuru kenarları doku bezle leke. Pipet 200 değiştiren µL Harris hematoksilen her bölümün filtre ve 30 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında. Dikkatli bir şekilde su açık çalıştırır kadar akan musluk su altında slayt durulayın. Aşırı sıvı kaldırmak için bir doku bezle slayt her adım (leke arasında her adım 3.2-3,5) arasında sonu leke.
  3. 1 x PBS, oda sıcaklığında 30 yer slayt s. O zaman, dikkatle durulama akan musluk su 30 altında slayt s.
  4. Slayt 3 - 4 kez % 95 etanol banyo içine daldırma. Ve doku slayt üzerinde kapağı için 15 kuluçkaya yeterli eozin Y boya çözüm geçerli s, oda sıcaklığında.
  5. Slayt % 95 etanol banyo iki kez 10-20 hızlı dips her ile yıkayın. Slayt % 100 etanol banyo iki kez 10-20 hızlı dips her ile yıkayın. Sonra slayt ksilen banyo (10-20 hızlı dips her) iki kez yıkayın.
  6. Reçineli montaj orta için doku uygulayarak mount, coverslip dikkatle hava kabarcıklarını önlemek ve mahallede gece kurumaya bırakın ekleyin.
  7. H & E slaytlar görsel olarak veya bir dijital slayt tarayıcı kullanarak gözden geçirin. Harita slaytlar TM açıkça görünür ve kesme için erişilebilir tanımlar. Evde beslenen hayvan kullanın membran slaytlar arasında bunlar LCM için slaytları göster.

4. polietilen tereftalat (PET) membran işleme ve boyama Protokolü slaytlar

  1. Evde beslenen hayvan dondurucu slaytlardan kaldırma ilk 0.3 g kresil menekşe asetat 20 mL % 75 etanol içinde eriterek tarafından kresil menekşe hisse senedi çözüm hazırlamak ve üzerine yerleştirin önce 6 Pzt'dan 2 h. filtre 0,22 µm steril filtre ünitesi ve mağaza için artık 4 ° C'de ile çözüm için sarsıcı THS.
  2. Eozin Y alkollü çözüm 1:4 oranında taze % 75 etanol ile hazırlayın. Fiksasyon (% 75 etanol) ve su kaybı çözümleri (etanol % 75, % 95 ve % 100) temiz, nükleaz bırakmayan, 50 mL konik polipropilen borular buzda hazırlayın. RNase inhibitörü her ekleyin.
  3. -80 ° C dondurucu donmuş doku bölümleri içeren slayt kutusunu çıkarın ve kuru buza yerleştirin. Bir slayt anda işleme. Slaytları Slayt hemen soğuk % 75 etanol için 30 içine yerleştirerek düzeltmek s.
  4. Yavaşça nükleaz ücretsiz su doku bölümlerle engel olmadan O.C.T. dağıtılması için 10-15 s için slayt daldırma.
  5. Dikkatle 300 µL % 1.5 kresil menekşe asetat çözüm bölümleri doğrudan üzerine pipet ve 45 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında. O zaman, 30 s. pipet 200 µL eozin Y çözüm için bölümler üzerine % 75 etanol banyo içine yerleştirerek bir kez yıkama ve 3-5 s için kuluçkaya.
  6. Daha sonra % 75 etanol, % 95 etanol ve son olarak, % 100 etanol banyo için 30 slayt yerleştirerek doku kurutmak her s. Bir doku bezle slayt aşırı sıvı kaldırmak için her adımda arasında sonu leke. 5 min için başlık altında kurumasını slayt hava girsin. Kuru bir kez LCM hemen sonra gerçekleştirin.
    Not: Bu adım için ksilen kullanımını önlemek için önerilir, yeterli ölçüde membran slayda bağ doku bölümleri neden olabilir ve doku yakalama verimliliği azaltır.

5. lazer mikrodiseksiyon UV Lazer ile

  1. Bilgisayarı açın ve önyükleme için izin verir. Mikroskop beyaz ışık güç kaynağı açın. UV Lazer anahtar ve bir sarı LED yanacaktır açın. LCM yazılımını başlatın, tam yük ve canlı video görüntüler sağlar. Denetleyicisi sille lazer düğmesine basın ve yeşil bir LED ışık yanacaktır.
  2. Mikroskop sahne alanı'na yeni bir cam slayt yük sonra lekeli doku yüzü aşağı bakacak şekilde doğrudan cam slayt üstünde evde beslenen hayvan membran slayt yerleştirin. Membran ve cam slayt mikroskop sahne alanı'nda sıkı bir şekilde eşleştirilmiş emin olun.
  3. İlk slayt sınırlarını ayarlayarak başlangıç LCM. Seçin en düşük 4 X büyütme objektif panelinde (Şekil 4). Sonra çalışma alanının membran slaydın metal ve membran kesiştiği sol üst köşesinde, canlı görüntülerin basın "Sınırı 1" düğmesini ve kırmızı bir dikdörtgen yol haritası-ecek gözükmek içinde görünene kadar mikroskoplar xy aşamalı hareket ettirerek tanımlayın. Ardından, xy-sahne alanı'na karşı köşeye taşımak ve "2 sınırla" düğmesine basın. Membran ve dokuların set sınır arasında bir yol haritası görüntü oluşturmak için "tarama" düğmesine basın.
  4. Bir yol haritası içinde göz bölümlerinin TM yakınındaki çift tıklayın, TM iridocorneal açı (Şekil 5A) tepe bulunabilir. TM saptanmıştır sonra 10 X ve el ile TM odaklanmak için büyütmeyi. 20 X ve 40 X hedefleri ile yineleyin. TM 40 X amaç (Şekil 5B) ile odak olduğunda, boş bir alana gidin (odak biraz ayarlanması için gerekebilir), "serbest çizim aracı" seçin ve doku boş bir alan üzerinde uzun bir çizgi çizin.
  5. % 34 "kesme hızı" olduğunu, "odak" % 58, "güç" % 70 (Şekil 4) sonra "Kes" tuşuna basın böylece ve lazer parametrelerini ayarlamak. Bir açık ve iyi kesme hattı (bkz: Şekil 5C) görülmektedir kadar hız, odak ve güç parametreleri iyi lazer ayarlamaları yapın. Hassas kesme, kesme hareketi çizilmiş çizgiyi takip emin olun.
  6. Yalıtım tüp kapak kap yuvasına yükleyin ve tüp açın. Cap-tutucu kap asansörü iliştirin ve tüp ters emin olun. Yapışkanlı kap malzeme kapağı istenen doku düzgün yakalanır emin olmak için belgili tanımlık uç protrudes sizi temin ederim.
  7. "El ile" diseksiyon modu yazılım panelinde seçin. TM (5B rakam) doğrudan yalıtım tüp altında olduğunu dikkatle gözden geçirin. Beyaz ayarını ve en iyi görüntü kalitesi (Şekil 4) elde etmek için parlaklığını ayarlayın.
  8. Kesme başlar, el ile odak ayarlamak ve serbest çizim aracını kullanarak bir çizgi çizmek için koleksiyon kap henüz dokunmadan membran yukarı konumda kalır emin olun. TM (Şekil 5C), sklera buluştuğu yakınındaki kısmi daireler çizmek sonra basın "kes." Bir kez ilk kesim yapılır, kapağı aşağı pozisyona getirin ve odağı yeniden ayarlayın, daha sonra basın "Kes" ve doku bölümünden toplamak sonra TM, Çember tamamlanıyor iki kısmi daire bağlanmak için açık veya serbest uzayda iki çizgiler çizmek , TM mikrodiseksiyon kap (Şekil 5 D-F) tarafından tutuklanmıştı emin olun.
  9. Kapağı yukarı pozisyona getirin ve kalan bölümlerde (5.2-5,8) tekrarlayın. Böylece tüm izole örneklerini kap uygun ve (Şekil 5G) üst üste değil biraz kap pozisyonunu ayarlayýn. Tutarlılık sağlamak için bir slayt için zaman penceresi 20 dk. kullanım TM bütün bölümlerden yalıtmak için daha fazla zaman gerekirse hayvan başına daha az bölümleri slayt olduğunu. Sonraki evde beslenen hayvan membran için yeni bir yalıtım tüp takın ve Bölüm 5 tekrarlayın.

6. lizis Microdissected TM doku

  1. Taze RNA lizis arabellek izole LCM doku koşullar için hazır olun. 10 µL β-mercaptoethanol lizis arabellek için her 1 mL ekleyin. β-mercaptoethanol en fazla 1 ay için oda sıcaklığında lizis önbellekle saklayın.
  2. Mikrodiseksiyon başlangıcından 20 dk içinde kap sahibinden yalıtım tüpü çıkarması. Cap yüzey TM yakalanması emin olmak için göz tarafından görselleştirin.
  3. Dikkatle 10 µL lizis arabellek lizis arabellek tamamen microdissected TM kapsar sağlanması koleksiyonu tüpün kapağı üzerine pipet. Yavaşça yapışkanlı kapağı kapatın ve toplama tüp ters, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Kuluçka sonra vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi ve kuru buza lysate yerleştirin. Lysates daha sonra arıtma ve çözümleme-80 ° C'de depolayın.

7. RNA izolasyon ve kalite Analizi

  1. RNA kalitesi örnekleri, oda sıcaklığında çözdürme tarafından analiz. Havuzu birlikte tüm örnekleri tek bir fare--dan bir RNase free 1.5 mL microfuge tüp izole.
    Not: Örneğin, 10-12 tüpler 10 µL lysate microdissected kapakları biyolojik her çoğaltma için oluşturulan ve tüm lysates her biyolojik Çoğalt (100-120 µL lysate) için tek bir tüp içine transfer edildi.
  2. Bir taze hazırlanmış % 70 etanol (RNase free su ile yapılan) hacmi lysate her ekleyin. Sonra toplam RNA RNA izolasyon kiti Kullanıcı yönergeleri izleyerek arındırmak. Genomik DNA RNA örnekleri'kaldırılmasını sağlamak.
    Not: Genomik DNA aşağı akım RNA analizi ile etkileyebilir.
  3. Birlikte her fare örnekleri havuz ve ribozomal RNA bütünlüğü (6A rakam) analiz TM izole RNA kalitesini ölçmek.
    Not: TM küçük boyutu nedeniyle, ribozomal RNA doruklarına observable (Şekil 6B) RNA kalite profili (iki doruklarına 1.000-4.000 bp Şekil 6A, C'arasındagözlenen) üzerinde olmayabilir RNA bütünlük numarası (RIN) hesaplamak için kullanılan 47.
    1. RNA bütünlüğünü daha doğru bir ölçü RNA membran slayda daha bol kalan dokusundan izole ederek elde edilir. Bir temsilci RIN, pipetting 10 membran slaytta vizörün dokusundan izole RNA elde etmek için µL lizis bir doku bölümü tampon ve RNA izolasyon gerçekleştirmek. RNA kalite analiz ve RIN (Şekil 6C) hesaplar.
  4. Aşağı akım RNA uygulamalarda kullanım tekrarlanabilir verim sıralama ve cDNA Kütüphanesi üretimi için alçak giriş RNA seti LCM kadar az 80 bölümlerden sonuçları TM izole.

8. analiz

  1. Toplanan doku aslında TM ilişkili genler zenginleştirilmiştir doğrulamak için birden çok ek RNA microdissected bütün göz, sklera, Iris, retina, kornea ve 3 ayrı fareler objektiften toplamak. LCM ile birlikte bu RNA RNA üzerinden toplanan kullanımı TM ve silier vücut 4 ayrı fareler toplanan izole.
  2. Convert RNA microdissected örneklerinden cDNA cDNA Ters transkripsiyon kiti kullanılarak yapıldı. RNA izole LCM örneklerinden yükseltmek ve düşük giriş RNA cDNA Kit kullanarak cDNA dönüştürmek.
  3. Tüm RNA trabeküler meshwork genler, myocilin (MYOC) ve Alfa-aktin-2 (ACTA2), ifade etmek için analiz ve dijital PCR (Şekil 7A-B) tarafından HSP90a1 temizlik gen kullanarak normalleştirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LCM RNA TM toplanan ve 4 farklı fareler vücuttan silier gen ekspresyonu analiz ve bu ifadeyle bütün göz, sklera, Iris, retina, kornea ve objektif üç ayrı fare izole karşılaştırmak için izole edildi. TM, genlerin ifade izole TM örnekleri gerçekten son derece TM zenginleştirilmiş onaylamak için toplanan tüm dokularda MYOC48 ve ACTA249 analiz edildi. CDNA LCM örneklerinden son derece düşük miktar nedeniyle dijital PCR, hangi kanıtlanmıştır daha az malzeme50ile tekrarlanabilir için kullanıldı. MYOC ve ACTA2 ifade HSP90a1 temizlik gen kullanarak normalleştirilmiş, sonra her doku tüm göz kıyasla. MYOC (7A rakam) ve ACTA2 (7B rakam) son derece TM örnekleri, yüksek kaliteli RNA zenginleştirilmiş TM örneklerinden başarılı yalıtımı için aşağı akım RNA teyit ifade edilir bu sonuçları göster analiz. Kavram kanıtı TM izole RNA WT fareler ve fareler bir yükseltilmiş IOP fenotip ile bir tür hazırlanan ve Mikroarray tarafından analiz bu tekniği uygulandı. Bu analiz glokom içinde karıştığı differentially WT TM fareler ve bu glokom fenotip (Şekil 7C) ile fareler arasında ifade edilir birçok gen tespit edilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: dondurulmuş doku yerleşimini engellemek cryostat. (A) O.C.T montaj orta cryostat montaj yığın için uygulanır. (B) dondurulmuş numune blok montaj chuck üzerinde eşit olarak yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: yordam cryostat donmuş göz dokusunun kesit. (A) göz doku ulaşmak için kesme yüzeyi hazırlanması. (B) O.C.T. lazer mikrodiseksiyon için bölümleri toplama önce dondurulmuş blok kesme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: cryostat donmuş bölümlerinde hazırlanması. (A) 6 seri 8 µm kalınlığında bölüm dizilmiş içinde cryostat. (B) bölümlerinde aynı anda evde beslenen hayvan membran slayda monte edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Screenshot-in önemli özellikleri vurgulayarak lazer mikrodiseksiyon yazılım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: konumunu trabeküler meshwork ve UV Lazer parametre ayarları trabeküler meshwork uygun yalıtım için. (A) düşük (4 X) büyütme için lazer mikrodiseksiyon trabeküler meshwork vurgulayarak evde beslenen hayvan membran üzerinde tek bir bölümün. (B) yüksek (40 X) büyütme trabeküler meshwork ve bitişik doku. (C) TM yukarı konumda kapaklı scleral bölge yakınında, ilk kısmi daire keser. (D) TM aşağı pozisyonda kapaklı çember tamamlamak boş alan Final keser. (E) TM bölümü ve kap bağlı (F) kaldırıldı. (G) birden fazla kesme bölümleri için cap değil üst üste aynı evde beslenen hayvan membran yapıştırılır kesti. S (sklera), SC (Schlemm'ın kanal), TM (trabeküler Meshwork), AC (ön kamara). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Toplam RNA verim ve kalite tahmini elde microdissected trabeküler meshwork dokudan. (A) 80 trabeküler meshwork bölümlerini gelen toplam RNA (yaklaşık alanı boyutu 0.8mm2idi). (B) toplam RNA trabeküler meshwork 20 bölümlerden (yaklaşık alanı boyutu 0.2 mm2idi). (C) toplam RNA lazer mikrodiseksiyon sonra kalan göz dokusundan. RIN, RNA bütünlük numarası; BP, baz çifti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Downstream RNA Analizi LCM izole trabeküler meshwork. TM ilişkili genlerin LCM tarafından izole TM dijital kantitatif PCR analizi. TM ilişkili genlerin (A) MYOC (B) ACTA2 son derece LCM içinde ifade edilen diğer göz dokulara kıyasla TM örnekleri ele geçirdi. (C) trabeküler meshwork RNA Mikroarray analizinden elde edilen verilerden oluşturulan Heatmap WT fareler ve KO fareler bir yükseltilmiş IOP fenotip ile izole. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: doku hazırlık öncesi ve sonrası en iyi duruma getirme karşılaştırılması. Kesmek ve yerleştirilen göz bölümleri membran slaytlar ya (A) (B) standart % 95 etanol dehidratasyon hazırlanması veya en iyi duruma getirilmiş % 75 etanol dehidratasyon hazırlık ile evde beslenen hayvan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TM aktif olarak homeostatik IOP korumada önemli bir rol oynar ve onun disfonksiyon yaygın hipertansif glokom1,2,19ana etken faktör olarak kabul edilir. Tek nükleotid polimorfizmleri çeşitli genlerde GWAS analiz tarafından tanımlanan bir dizi artan Glokom riski ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç bağlantılı olmuştur; Ancak, bu hastalığın ortaya çıkmasına kesin moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılır21,22,23,24,25değildir. Genetik fare modelleri glokom moleküler mekanizmaları eğitim için güçlü bir araç sağlar. Ancak, fare TM doku küçük boyutlu yüksek oranda zenginleştirilmiş TM yalıtım için müthiş bir meydan okuma fare gözleri ve yüksek kaliteli RNA gen ifade analizi için temsil eder. LCM hücre tek veya düşük sayısı izole için değerli bir teknik ve gen ekspresyonu doku örneklerinde belirli hücre tipleri için zenginleştirilmiş çalışma için kullanılabilir. Bu çalışmada, sağlam ve tekrarlanabilir LCM yöntemi zenginleştirilmiş TM ve gen ekspresyonu ve hücre içinde TM sinyal Yönetmeliği okumak için kullanılan yüksek kaliteli RNA izole etmek için tanımlanır. Buna ek olarak, diğer dokulara göz içinde açıklanan LCM yöntemi de uygulanabilir.

LCM teknoloji ve doku işleme duruma getirilmesi için yüksek detaylara bu yöntem başarılı gelişiminde önemli bir rol oynadı. Doku koruma ve yalıtım metodolojisi gen ifade profil oluşturma için yüksek kaliteli RNA izole içinde önemli bir bileşenidir. LCM anatomi, cryosectioning, fiksasyon, çok yüksek detaylara boyama, dehidratasyon ve kalite RNA51elde başarılı olmak için lazer mikrodiseksiyon zaman süresi gerektirir. Doku bölümü kalınlığı artırılabilir; Ancak, kalınlığı kadar arttıkça UV güç gerekli lazer gelmektedir. Lazer güç sonuçlar RNA azalmasına neden daha geniş bir lazer yolundaki arttı. Lazer yolu 8 µm bölümlü ince ve aşağı akım RNA analizi için yeterince doku sağlanan bulundu. Şekil 8 gösterir nasıl en iyi duruma getirme doku hazırlanması büyük ölçüde lazer yeteneği değiştirebilir göz TM incelemek. Sadece % %75 95 etanol (Şekil 8A) yerine doku dehydrate kullanarak üstün göz-doku immobilizasyon ve O.C.T. (Şekil 8B) tümüyle kaldırılmasını Protokolü (4 bölümde açıklandığı gibi) Bu adımda optimizasyonu vermiştir Kuluçka RNase free su montaj medya kaldırmak için takip. Daha fazla su kaybı ve boyama alkol bazlı boyama reaktifler kullanarak sağlanır. Buna ek olarak, bu alkol bazlı boyama vermiştir reaktifler üstün göre sulu boyama reaktifler (su bazlı kresil mor veya hematoksilen) neden olur ve daha fazla RNA bütünlük52korunmasına yardımcı olur bulundu. Genel olarak, oküler dokular evde beslenen hayvan membran slaytta tam immobilize alkol bazlı boyama vermiştir reaktifler tutarlı göz-doku bölümleri ile en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralını kullanarak işleme.

Amacımız bu çalışma için yüksek kaliteli izole için sağlam ve güvenilir bir yöntem geliştirmekti mRNA fare gözler yükseltilmiş IOP ve glokom altında yatan moleküler mekanizmaları anlayışlar elde etmek için aşağı akım ifade analizi için TM üzerinden. Şekil 7Cheatmap gösterildiği gibi izole TM LCM tarafından açıklanan protokol RNA TM dan ayırmak ve vahşi türü ve mutasyona uğramış fareler TM gen ifadesinde farklılıklar çalışma çok güvenilir bir yöntem sağlar. Burada açıklanan yöntemi müfettişler nispeten kolay ve güvenilir bir vivo içinde sisteminde bir doku glokom patogenezinde merkezi moleküler analiz gerçekleştirmek izin verir ve gen ifade analizi için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Tags

Biyoloji sayı: 136 glokom trabeküler meshwork lazer yakalama mikrodiseksiyon lazer mikrodiseksiyon RNA izolasyon gen ekspresyonu LCM LMD
Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R.… More

Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter