Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.
Abstract
Laser Capture Microdissection (LCM) hat erlaubt Gen Ausdruck Analyse einzelner Zellen und Zell-Populationen in Gewebeschnitten bereichert. LCM ist ein großes Werkzeug für die Erforschung der molekularen Mechanismen, die Zelldifferenzierung und der Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten, einschließlich Glaukom. Glaukom, umfasst eine Familie von progressive optic Neuropathien, ist die häufigste Ursache von irreversible Blindheit weltweit. Strukturelle Veränderungen und Schäden innerhalb der trabekuläre Geflecht (TM) führt zu erhöhter Augeninnendruck (IOP), ist ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Glaukom. Die genauen molekularen Mechanismen sind jedoch noch kaum erforscht. Die Fähigkeit zur Genanalyse Ausdruck wird bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Funktion dieser Zellen und ihre Rolle bei der Regulation des IOP und Glaukom Entwicklung entscheidend sein. Um dies zu erreichen, eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von hoch angereichert TM von Gefrierschnitte Maus Augen und eine Methode für nachgeschaltete Gen Expressionsanalyse, wie RT-qPCR und RNA-Seq ist erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um hochreines TM von Maus Augen für nachgeschaltete digitale PCR und Microarray Analyse isolieren. Darüber hinaus kann diese Technik für die Isolierung von anderen hoch angereicherten okuläre Zellen und Zelle Kompartimente, die schwer zu isolieren von Maus Augen wurden leicht angepasst werden. Die Kombination von LCM und RNA Analyse kann auf ein umfassenderes Verständnis der zellulären Ereignisse zugrunde liegenden Glaukom beitragen.
Introduction
Das Glaukom ist eine Gruppe von Krankheiten, die durch optische Neuropathie und Retinopathie, die letztlich zu irreversibler Blindheit1,2gekennzeichnet. Es wird geschätzt, dass bis 2020 mehr als 70 Millionen Menschen weltweit mit irgendeiner Form der Krankheit3,4,5,6,7Leben werden werden. Primären Offenwinkelglaukom (POAG), die häufigste Form des Glaukoms, zeichnet sich durch eine Abnahme der Kammerwasser (AH) Abfluss führt zu erhöhter Augeninnendruck (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Linke unbehandelte, chronisch erhöhten Augendruck führt zur progressiven und irreversible Schäden an der Netzhaut und Sehnerv Kopf verursacht radial Blindheit1,2,19. Alle aktuellen Methoden zur Verlangsamung des Fortschreitens der Glaukom-Fokus auf die Verringerung der IOP, entweder durch Verringerung der Rate der Produktion von AH durch den ziliarkörper oder Verbesserung seiner Abfluss1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. die trabekuläre Geflecht (TM) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der primären AH Abfluss Weg aktiv und seine falsche Funktion ist ein auslösender Faktor für Hypertensive Glaukom1,2,19. Jedoch die molekularen Mechanismen, die TM Dysfunktion und wie sie AH Entwässerung regelt zugeordnet sind noch nicht vollständig geklärt und ist derzeit ein Schwerpunkt von Glaukom Forschung1,2,19, 20. während mehrere genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) eine Reihe von Genen Glaukom und erhöhte Resistenz gegen AH-Abfluss-Anlage in der TM verbunden haben, die genauen molekularen Mechanismen, die zu Krankheit führen, sind nicht noch vollständig verstanden21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Tiermodelle haben unseren derzeitigen Kenntnissen des Fortschreitens der Krankheit bei Glaukom (ausführlich rezensiert in3,15,16,26,27,28, stark verbessert. 29,30,31,32,33). Einige bahnbrechende Methoden wurden entwickelt, um die TM34,35,36 zu studieren und diese Methoden häufig verwendet wurden, um unser gegenwärtiges Verständnis der normalen und krankem Gewebe fördern. Ein Bereich, der nicht ausgiebig erforscht worden ist, ist die Verwendung von gentechnisch veränderte Mausmodelle, die molekularen Mechanismen der TM Scheitern zu studieren. Transgene Knock-in und Knock-out-Maus-Studien von TM verbundenen Gene, wie Myocilin (Myoc)37,38 und Cyp1b139, wurden die wichtigsten Tools für die Erforschung der molekularen Mechanismen der TM Funktion. Verständlicherweise, stellt die geringe Größe der TM bei Mäusen eine schwere Hürde, die überwunden werden muss, um zu beginnen, dieses Gewebe zu studieren. Maus-Modellen sind ein mächtiges Werkzeug für die Erforschung der Genetik und molekulare Mechanismen der Krankheit, während Fortschritte in der LCM Technologien die notwendigen Werkzeuge liefern, um die Studie der kleinste und zarteste Gewebe, einschließlich der TM zu befähigen.
In diesem Bericht wird eine stabile und reproduzierbare Methode für die LCM von hochangereichertem TM von Maus Augen zusammen mit nachfolgenden RNA Isolation und Verstärkung für nachgeschaltete Expressionsanalyse beschrieben. Ähnliche Methoden wurden verwendet, erfolgreich bei Mäusen um andere Arten von Auge Gewebe40,41,42,43,44zu isolieren, die hierin berichtet Methodik kann auf andere diskrete Gewebe des Auges, RNA, DNA, RNA und Proteine zu studieren. Wichtig ist, ermöglicht diese Technik den Einsatz von genetisch veränderten Mäusen zum besseren Verständnis die molekularen Pathogenese der TM Beeinträchtigung bei Glaukom und okuläre Erkrankung3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Die Fähigkeit, die TM der Maus Eyes von LCM isolieren wird eine nützliche Technik bei der Beschaffung weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen der verschiedenen okulären Erkrankungen sein.
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Protocol
Das National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) genehmigt alle Methodik dieser Studie unter den NIEHS Tier studieren Vorschlag IIDL 05-46.
1. optimale Gewebe Kollektion für Laser-Mikrodissektion
- Erhalten Sie 2 bis 3-Monate-alten Mäuse, männlich oder weiblich C57BL/6. Einschläfern Sie mit CO2 für ein Minimum von 1 min oder bis Atmung aufgehört hat. Entfernen Sie das Tier aus dem Käfig und gewährleisten Sie Tod durch zervikale Dislokation, Enthauptung oder Thorakotomie zu.
- Sicherzustellen Sie vor der Präparation, dass alle Dissektion Werkzeuge sauber und steril sind.
Hinweis: Für die Entfernung der Augen gebogen, Scheren und Pinzetten mit gezackten Spitze (bevorzugt Spitzengröße: 0,5 x 0,4 mm) benötigt werden. - Legen Sie die Maus auf einer ebenen Fläche auf die Seite, so dass das Auge leicht zugänglich ist. Greifen nach augenwinkelbereich (Ecke des Auges) mit der Zange um die Maus zu stabilisieren, dann schneiden Sie mit der gebogenen Schere, mit Blick auf die Kurve vom Auge, um das Auge mit der Augenhöhle als Leitfaden bis Augapfel leicht aus der Steckdose genommen werden kann (verwenden Sie die Kurve nicht die Tipps der Schere).
- Ziehen Sie vorsichtig und mit der gebogenen Schere schneiden den Sehnerv, der das Auge aus der orbital Steckdose freisetzt. Entfernen Sie vorsichtig die nicht-Okular Gewebe aus dem Auge und spülen in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie 1.3-1.4 für die kontralateralen Auge.
- Tupfen Sie das Auge mit einem Gewebe abwischen, keine Feuchtigkeit vor dem Einbetten zu entfernen. Legen Sie das Auge in Form der Probe (25 x 20 x 5 mm-3), so dass das Objektiv und Sehnerv parallel zur Oberkante Bank sind um sagittale Abschnitte zu erhalten. Einbetten Augen in optimale schneiden Temperatur (O.C.T.) Verbindung und legen auf das Trockeneis zu frieren. Einmal gefroren, speichern Sie die Blöcke bei-80 ° C.
(2) Gefrierschnitte Vorbereitung für Laser-Mikrodissektion
- Vor Gebrauch inkubieren Polyethylenterephthalat (PET) Folien Membran in UV-Vernetzer bei maximaler Leistung für 45 Minuten.
- Sprühen Sie RNase Dekontaminationslösung auf den Pinsel, Pinzetten, Kupplung Gläser und Montage Futter. Reinigen Sie gründlich. Mit Nuklease-freies Wasser abspülen und trocknen. Wischen Sie den Kryostaten mit 100 % Ethanol um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Anpassen der Kryostat bis-18 ° C. Entfernen Sie einen gefrorenen Block aus-80 ° C Gefrierschrank zu einem Zeitpunkt und liefern an den Kryostaten mit Trockeneis. Lassen Sie gefrorenen Block mit der Temperatur des Kryostaten für ein Minimum von 10 min equilibrate.
- Drücken Sie eine kleine Menge des O.C.T. auf den Montage-Chunk (Abbildung 1A) und entfernen Sie die Gewebe-Block aus der Form und legen Sie vorsichtig den Block auf dem Montage-Futter (Abbildung 1 b). Sobald der Gewebe Block auf dem Montage-Futter gefroren ist, fügen Sie auf der Probenhalter der Kryostat (Abbildung 2A).
- Anpassen der Kryostat schneiden 8 µm Abschnitte und Kapitel sorgfältig durch den O.C.T. Block um die Gewebeprobe zu erreichen. Sobald das Gewebe beobachtet wird, stoppen Sie, schneiden, trimmen Sie die gefrorenen Blöcke auf allen Seiten mit einer sauberen Rasierklinge und lassen Sie 3-4 mm O.C.T. rund um das Gewebe zu Umgang mit dem Pinsel (Abb. 2 b) ermöglichen. Verwenden Sie einen neuen sauberen Pinsel anstelle der Roll-Platte zwischen jedem Probenwechsel Probe Cross-Kontamination zu vermeiden.
- Schnitt durch das Auge schnell arbeiten. Fleck Fleck jeden dritten Abschnitt von Überschwemmungen der Folie mit einem schnellen Schritt Hämatoxylin und Eosin (H & E) für 60 s, mit Leitungswasser spülen, an der Luft trocknen, klar im Clearing Agent und befestigen Sie an einem geladenen Objektträger mit einem deckgläschen. Unter dem Mikroskop ansehen und weiter Schnitt bis in die Zuschnitte der TM ersichtlich ist.
- Sobald die TM beginnt zu erscheinen, 2 Abschnitte schneiden und montieren auf einen geladenen Objektträger für Routine, H & E Färbung um eine Karte für das Schneiden mit LCM bilden.
Hinweis: Siehe Abschnitt 3 für Karte und Färbung Details. - Nach der ersten H & E Dia zuordnen, schneiden und line up 6 serielle 8 µm Dicke Abschnitte in den Kryostaten und gleichzeitig auf die PET-Membran-Folie (Abb. 3A, B) einbinden. Halten Sie das Gewebe durch kurz schieben behandschuhten Daumen entlang der Rückseite der Membran. Legen Sie nach der Montage die PET Membran Folie sofort in eine Folie Box auf Trockeneis.
Hinweis: Weniger Einzelteilen montiert werden können, gleichzeitig mehrere Abschnitte auf der Folie Montage wird jedoch empfohlen, RNA-Abbau durch Begrenzung der Höhe der Zeit, die jeder Abschnitt der Raumtemperatur Luft ausgesetzt ist zu reduzieren. - Weiter zu Abschnitt des Auges, nach jeder zwei PET-Membran-Folien mit 6 Sektionen, zwei Abschnitte auf einem geladenen Objektträger erstelle ich eine andere Karte Folie für H & E Färbung zu sammeln. Weiter Schnitt, ca. 100 serielle 8 µm Dicke Abschnitte, bis TM nicht mehr sichtbar ist. Bestätigen Sie durch schnell Beflecken ein Abschnitt über einen aufgeladenen Objektträger (siehe 2.6).
- Speichern Sie alle PET-Membran-Folien bei-80 ° C für die spätere Verwendung der LCM.
3. H & E Karte Folie Färbung Protokoll und morphologische Bewertung
- Zu visualisieren und überprüfen Sie die Karte-Folien auf den geladenen Glas-Folien, destilliertem Korrektur, die das Gewebe durch die Übertragung sofort in eine Färbung Glas mit 100 mL der schnellen Befestigung Lösung für 7 S. Spülen die Folie gefüllt durch Eintauchen in Wasser 10 - 20 mal , dann die Folie auf eine Kupplung Glas mit destilliertem Wasser übertragen.
- Entfernen Sie die Folie aus Wasser und tupfen Sie trockenere Kanten mit Gewebe wischen. Pipette 200 µL geändert Harris Hematoxylin auf jedem Abschnitt gefiltert und inkubieren Sie für 30 s bei Raumtemperatur. Spülen Sie sorgfältig die Folie unter fließendem Leitungswasser bis Wasser klar ist. Tupfen Sie am Ende der Folie mit einem Gewebe abwischen zwischen den einzelnen Schritten (Fleck zwischen den einzelnen Schritten von 3,2-3,5), um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Statt Folie in 1 X PBS bei Raumtemperatur für 30 s. Dann sorgfältig abspülen die Folie unter fließendem Leitungswasser für 30 s.
- Tauchen Sie die Folie 3-4 Mal in 95 % Ethanol Bad. Wenden Sie genügend Eosin Y Farbstofflösung um das Gewebe auf der Folie abdecken und inkubieren Sie für 15 s bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Folie mit 95 % Ethanol Bad zwei Mal mit 10-20 schnelle Dips. Spülen Sie die Folie in 100 % Ethanol Bad zwei Mal mit 10-20 schnelle Dips. Dann spülen Dia zwei Mal in Xylol Bad (10-20 schnelle Dips jeder).
- Durch die Anwendung von harzigen Eindeckmedium des Gewebes montieren Sie, fügen Sie deckgläschen sorgfältig, um Luftblasen zu vermeiden und in der Kapuze über Nacht trocknen lassen hinzu.
- Lesen Sie H & E Folien, visuell oder mit einem digitalen Diascanner. Karte-Folien mit TM deutlich sichtbar und zugänglich für das Schneiden zu identifizieren. Verwenden Sie die PET Membran Folien zwischen diesen Folien für LCM zuordnen.
(4) Polyethylen Polyethylenterephthalat (PET) Membran Folien Verarbeitung und Färbung Protokoll
- Vor Entfernen von PET-Folien aus dem Gefrierschrank zuerst Cresyl violett-Stammlösung bereiten von 0,3 g Cresyl violett Acetat in 20 mL 75 % Ethanol auflösen und setzen auf Shaker für 2 h Filter die Lösung mit 0,22 µm sterile Filtereinheit und Store bei 4 ° C nicht länger als 6 Mon THS.
- Bereiten Sie Eosin Y alkoholische Lösung mit frischen 75 % Ethanol im Verhältnis 1:4. Bereiten Sie Fixierung (75 % Ethanol) und Austrocknung Lösungen (100 %, 75 % und 95 % Ethanol) sauber, Nuklease-frei, 50 mL konische Polypropylenröhrchen auf Eis. RNase-Inhibitor jede Projektmappe hinzufügen.
- Entfernen Sie die Folie Box mit gefrorenen Gewebeschnitte von-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie es auf Trockeneis. Verarbeiten Sie eine Folie zur Zeit. Folien zu beheben, indem man die Folie sofort in kaltes 75 % Ethanol für 30 s.
- Tauchen Sie sanft die Folie in Nuklease-freies Wasser für 10-15 s O.C.T. aufzulösen, ohne zu stören den Gewebeschnitten.
- Sorgfältig pipette 300 µL 1,5 % Cresyl violett-Acetat-Lösung direkt auf die Abschnitte und inkubieren 45 s bei Raumtemperatur. Dann, waschen Sie einmal zu, indem man sie in 75 % Ethanol Bad für 30 S. Pipette 200 µL Eosin Y Lösung auf den Abschnitten und inkubieren Sie für 3-5 s.
- Gewebe zu entwässern, indem man die Folie anschließend in 75 % Ethanol, 95 % igem Ethanol und schließlich 100 % Ethanol Bad für 30 s. Tupfen Sie das Ende der Folie mit einem Gewebe abwischen zwischen jedem Schritt um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Folie Luft vollständig unter der Haube für 5 min trocknen. Nach dem Trocknen, durchführen Sie LCM unmittelbar danach.
Hinweis: Es wird empfohlen, die Verwendung von Xylol für diesen Schritt zu vermeiden, können dazu führen, dass Gewebeschnitte unzureichend auf die Membran Folie binden und verringert die Leistungsfähigkeit der Gewebe erfassen.
5. Laser Mikrodissektion mit UV-Laser
- Schalten Sie den Computer und Booten lassen. Schalten Sie das Mikroskop weiße leichte Netzteil. Schalten Sie die UV-Laser-Taste und eine gelbe LED leuchtet. Starten Sie die LCM-Software, lassen Sie es vollständig zu laden und ein live-Video angezeigt wird. Drücken Sie den Knopf "Laser" auf die Controller-Box und eine grüne LED leuchtet.
- Laden Sie eine neue Glas-Folie auf den Mikroskoptisch, dann legen Sie die PET-Membran-Folie mit der gefärbten Gewebeseite nach unten direkt auf dem Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Membran und die Objektträger auf den Mikroskoptisch fest verbunden sind.
- Start-LCM durch erste Festlegung der Folie. Wählen Sie die niedrigste 4 X Vergrößerung im Bedienfeld "objektiven" (Abbildung 4). Dann definieren Sie den Arbeitsbereich der Membran Folie durch Verschieben der Mikroskope Xy-Bühne, bis die linke obere Ecke, wo das Metall und Membran treffen, in das live-Video-feed, Presse sichtbar ist, die Schaltfläche "Limit 1" und ein rotes Rechteck auf dem Fahrplan erscheint. Als nächstes gehen Sie zur Xy-Phase in die gegenüberliegende Ecke und drücken Sie die Taste "limit 2". Drücken Sie auf "Scan", um ein Fahrplan-Image der Membran und Gewebe zwischen den eingestellten Grenzwerten zu erstellen.
- Doppelklick in der Nähe der TM eines Auges Abschnitte innerhalb der Roadmap, die TM befinden sich in der Nähe von der Spitze der Kammerwinkel (Abb. 5A). Nachdem die TM identifiziert wurde, erhöhen Sie die Vergrößerung 10 X und manuell Fokus auf den TM. Mit 20 X und 40 X Ziele wiederholen. Wenn der TM im Fokus mit dem Ziel, 40 X (Abb. 5 b) ist, navigieren Sie in einen leeren Bereich in der Nähe (Schwerpunkt müssen leicht angepasst werden), wählen Sie die "Hilfsmittel" Freihand zeichnen "" und eine lange Linie auf einen leeren Bereich des Gewebes.
- Stellen Sie die Laserparameter ein, so dass die "Schnitte Geschwindigkeit" liegt bei 34 %, "Focus" 58 ist % und "macht" ist 70 % (Abbildung 4), dann drücken Sie auf "schneiden". Feine Laser Anpassungen an die Schnelligkeit, Fokus und Leistungsparameter bis eine klare und feine Schnittlinie beobachtet (siehe Abbildung 5). Zum präzisen schneiden, sicherzustellen Sie, dass die Schneidwirkung die gezeichnete Linie folgt.
- Laden Sie die Isolierung Rohr Deckel in den GAP-Halter und öffnen Sie der Tube. Der GAP-Lift befestigen Sie GAP-Halterung und sicherstellen Sie, dass das Rohr invertiert ist. Versichern Sie, dass der Klebstoff GAP Material ragt über der Spitze der Kappe um sicherzustellen, dass das gewünschte Gewebe richtig erfasst wird.
- Wählen Sie im Bedienfeld "Software" Dissektion "Handbetrieb". Prüfen Sie sorgfältig, dass der TM (Abbildung 5 b) direkt unter der Isolierung Rohr ist. Den Weißabgleich und Helligkeit um optimale Bildqualität zu erzielen (Abb. 4) zu erwerben.
- Zu schneiden beginnen, stellen den Fokus und zeichnen Sie eine Linie mit dem Hilfsmittel "Freihand", sicher sein, dass die Sammlung GAP in der oberen Position noch nicht berühren die Membran bleibt. Teilkreise Unentschieden in der Nähe trifft die TM der Sklera (Abbildung 5), und drücken Sie dann "Ausschneiden". Nach die ersten Schnitten fertig sind, positionieren Sie die Kappe in der unteren Position und einzustellen Sie den Fokus neu, dann zeichnen Sie zwei Linien in der offenen oder freien Speicherplatz, verbinden die zwei Teilkreise Abschluss des Kreis um die TM, dann drücken Sie "Ausschneiden" und sammle Gewebe von Abschnitt , dafür sorgen, dass der TM von Mikrodissektion GAP (Abbildung 5 D-F) aufgegriffen wurde.
- Positionieren Sie die Kappe wieder in der oberen Position und auf die restlichen Abschnitte (5,2-5,8) wiederholt. Richten Sie etwas aus, GAP so die isolierten Proben werden auf den Deckel passen und nicht (Abbildung 5 überschneiden). Aus Gründen der Kohärenz ist das Zeitfenster für eine Folie 20 min. Einsatz weniger Einzelteilen pro Tier zu schieben, wenn mehr Zeit erforderlich ist, für die Isolierung von TM aus allen Bereichen. Für die nächste PET-Membran einen neue Isolierung Schlauch und wiederholen Sie Abschnitt 5.
6. die Lyse der Microdissected TM Gewebe
- Frisch bereiten Sie RNA Lyse Puffer, LCM isoliert Gewebe zu lösen zu. Je 1 mL des Puffers Lyse 10 µL β-Mercaptoethanol hinzufügen. Speichern Sie die Lyse-Puffer mit β-Mercaptoethanol bei Zimmertemperatur nicht länger als 1 Monat.
- Entfernen Sie die Isolierung Rohr aus GAP Halter innerhalb von 20 min von Anfang an die Mikrodissektion. Visualisieren Sie die Kappe Oberfläche durch die Augen vor die Einnahme von TM zu gewährleisten.
- Pipette vorsichtig 10 µL Lyse Puffer auf den Deckel von dem Sammelrohr sicherstellen, dass die Lyse Puffer vollständig Microdissected TM abdeckt. Sanft schließen Sie Kleber Kappe und inkubieren Sie Sammelrohr Kopf bei Raumtemperatur für 10 min. Nach der Inkubation bei 800 X g für 2 min zentrifugieren Sie und lysate auf Trockeneis. Lysates bei-80 ° C für spätere Reinigung und Analyse zu speichern.
(7) RNA Isolierung und Analyse der Qualität
- Analysieren Sie die RNA-Qualität von Proben bei Raumtemperatur Auftauen. Pool zusammen isoliert alle Proben aus einem einzigen Mausklick in eine RNase-freie 1,5 mL Microfuge Röhre.
Hinweis: zum Beispiel für jede biologische replizieren, 10-12 Rohre mit Microdissected Kappen in 10 µL lysate erzeugt wurden und alle Lysates wurden in einer einzigen Röhre für jede biologische replizieren (100-120 µL lysate) übertragen. - Jede lysate Lösung fügen Sie ein Volumen von frisch zubereiteten 70 % Ethanol (hergestellt mit RNase-freies Wasser hinzu). Dann reinigen Sie Gesamt-RNS der RNA Isolierung Kit Benutzer Richtlinien. Die Entfernung von genomischer DNA aus einzelnen RNA-Probe zu gewährleisten.
Hinweis: Genomic DNA kann mit nachgeschalteten RNA Analyse stören. - Messung der Qualität der RNA isoliert aus dem TM durch die Zusammenlegung von Proben aus jeder Maus und Analyse der ribosomalen RNA-Integrität (Abbildung 6A).
Hinweis: Aufgrund der geringen Größe der TM ribosomaler RNA Gipfeln möglicherweise nicht zu beobachten (Abb. 6 b) auf die RNA Qualitätsprofil (zwei Gipfel zwischen 1.000-4.000 bp in Abbildung 6A, C), wird verwendet, um die RNA Integrität (RIN) berechnen 47.- Erhalten Sie ein genaueres Maß der RNA Integrität durch die Isolierung von RNA aus dem reichlicher verbleibende Gewebe auf der Membran Folie. Zu einem Vertreter RIN, isolieren RNA aus dem Okular-Gewebe auf der Membran Folie durch pipettieren 10 µL Lyse Puffer auf einem Gewebe Abschnitt und RNA Isolierung führen. Analysieren Sie RNS-Qualität zu und berechnen Sie RIN (Abbildung 6).
- Für nachgeschaltete RNA Anwendungen isoliert Nutzung ergibt sich eine niedrigere Eingang RNA-Kit für Sequenzierung und cDNA Bibliothek Generation liefern reproduzierbare von weniger als 80 Teile der LCM TM.
8. Analyse
- Um sicherzustellen, dass das Gewebe gesammelt in der Tat im TM-assoziierten Genen angereichert wird, sammeln Sie sich mehrere zusätzliche RNA aus Microdissected ganze Auge, Sklera, Iris, Netzhaut, Hornhaut und Linse aus 3 separaten Mäuse. Verwenden Sie diese RNA in Kombination mit LCM RNA aus gesammelten isoliert TM und ciliary Körper aus 4 separaten Mäuse gesammelt.
- Konvertieren die RNA aus den Microdissected Proben cDNA mittels einer cDNA reversen Transkription Kit war. Verstärken der RNS aus Proben isoliert LCM und konvertieren in cDNA mit einer low-Input RNA in cDNA-Kit.
- Alle RNA für die trabekuläre Geflecht mit dem Ausdruck ihrer Gene, Myocilin (MYOC) und Alpha-Actin-2 (ACTA2), zu analysieren und normalisieren mit HSP90a1 Zimmermädchen gen durch digitale PCR (Abbildung 7A-B).
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Representative Results
LCM gesammelt RNA aus dem TM und ziliarkörper aus 4 verschiedenen Mäusen isoliert um Genexpression zu analysieren und vergleichen Sie den Ausdruck mit, dass im ganzen Auge, Sklera, Iris, Netzhaut, Hornhaut und Linse, die aus drei separaten Mäusen isoliert. TM Gene zum Ausdruck zu bringen, wurden MYOC48 und ACTA249 in den gesammelten Geweben zu bestätigen, dass die isolierte TM Proben in TM in der Tat hochangereichertes wurden analysiert. Aufgrund der extrem niedrigen Anzahl der cDNA von LCM Proben war digitale PCR verwendet, hat sich bewährt, um mit weniger Material50mehr reproduzierbar sein. Ausdruck MYOC und ACTA2 wurde mit HSP90a1 Zimmermädchen gen normalisiert, dann jedes Gewebe war im Vergleich zu der das ganze Auge. Diese Ergebnisse zeigen, dass MYOC (Abbildung 7A) und ACTA2 (Bild 7 b) bestätigt die erfolgreiche Isolierung hochwertige RNA aus hochangereicherten TM Proben für nachgeschaltete RNA hoch in den TM-Proben ausgedrückt werden Analyse. Als Proof of Concept war diese Technik für die TM-isolierten RNA vorbereitet von WT-Mäusen und aus einem Stamm von Mäusen mit einem erhöhten Augendruck Phänotyp und analysiert von Microarray angewandt. Diese Analyse identifiziert viele Gene in Glaukom verwickelt, die zwischen der TM von WT-Mäuse und die Mäuse mit dem Glaukom Phänotyp (Abbildung 7) differentiell exprimiert werden.
Abbildung 1: Platzierung von tiefgefrorenem Gewebe blockieren in den Kryostaten. (A) O.C.T Eindeckmedium gilt für den Kryostaten Montage Brocken. (B) tiefgefrorene Probe Block befindet sich gleichmäßig auf dem Montage-Futter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verfahren der gefrorenen Augengewebe in der Kryostat schneiden. (A) Vorbereitung der Schnittfläche Augengewebe zu erreichen. (B) Trimmen O.C.T. von den gefrorenen Block vor Abschnitte für Laser-Mikrodissektion zu sammeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vorbereitung der Gefrierschnitte im Kryostaten. (A) 6 8 µm dicken Schnittserien im Kryostaten aufgereiht sind. (B) Abschnitte sind gleichzeitig auf der PET-Membran-Folie angebracht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Screenshot des Laser-Mikrodissektion-Software Hervorhebung wichtigere Eigenschaften. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Lage der trabekuläre Geflecht und UV-Laser-Parameter-Einstellungen für die richtige Isolierung der trabekuläre Geflecht. (A) Low (4 X) Vergrößerung eines einzelnen Abschnitts auf die Hervorhebung der trabekuläre Geflecht für Laser-Mikrodissektion PET-Membran. (B) hoch (40 X) Vergrößerung der trabekuläre Geflecht und der angrenzenden Gewebe. (C) erste Teilkreis schneidet der TM in der Nähe der skleralen Region mit der Kappe in der oberen Position. (D) Finale schneidet in den freien Raum, die den Kreis um die TM mit der Kappe in der unteren Position zu schließen. (E) TM entfernt aus dem Abschnitt und (F) an der Kappe befestigt. (G) mehrere Zuschnitte geschnitten aus der gleichen PET-Membran nicht überlappende eingehalten an der Kappe. S (Sklera), SC (Schlemm Kanal), TM (trabekuläre Geflecht), AC (Vorderkammer). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Gesamt-RNS Ertrag und die Qualität der Schätzung von Microdissected trabekuläre Geflecht Gewebe erhalten. (A) Gesamt-RNS von 80 Teile der trabekuläre Geflecht (ungefähre Größe war 0,8 mm2). (B) Gesamt-RNS aus 20 Teilen der trabekuläre Geflecht (ungefähre Größe war 0,2 mm2). (C) Gesamt-RNS von übrigen Augengewebe nach Laser-Mikrodissektion. RIN, RNA Integrität Anzahl; BP Basenpaare. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Downstream RNA Analyse der LCM isoliert trabekuläre Geflecht. Quantitative digitale PCR-Analyse von TM-assoziierten Genen in der TM von LCM isoliert. Die TM-assoziierte Gene erfasst (A) MYOC (B) ACTA2 hoch in die LCM ausgedrückt TM Proben im Vergleich zu anderen Augengewebe. (C) Heatmap erzeugt aus den Daten aus der Microarray Analyse der trabekulären Geflecht RNA isoliert von WT Mäuse und KO Mäuse mit einem erhöhten Augendruck Phänotyp. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Vergleich der Gewebe Vorbereitung vor und nach der Optimierung. Auge Abschnitte schneiden und auf PET Folien Membran entweder mit (A) der standard 95 % igem Ethanol Dehydrierung Vorbereitung (B) oder der optimierte 75 % Ethanol Dehydrierung Vorbereitung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die TM spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der homöostatischen IOP aktiv und seiner Dysfunktion ist weithin anerkannt als des wichtigsten ursächlichen Faktors für Hypertensive Glaukom1,2,19. Eine Reihe von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen in mehreren Genen GWAS Analyse festgestellten sind mit erhöhten Glaukom-Risiko und erhöhte Resistenz gegen AH-Abfluss-Anlage in der TM verbunden worden; Allerdings sind die genauen molekularen Mechanismen, die zu dieser Erkrankung führen noch nicht vollständig verstandenen21,22,23,24,25. Genetischer Mausmodelle bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der molekularen Mechanismen des Glaukoms. Die geringe Größe der Maus TM Gewebe stellt jedoch eine große Herausforderung für die Isolierung von hochangereichertem TM aus Maus Augen und hochwertige RNA für Genanalyse Ausdruck dar. LCM ist eine wertvolle Technik für eine Einzel- oder niedrige Anzahl von Zellen zu isolieren und kann zur Genexpression in Gewebeproben für bestimmte Zelltypen angereichert zu studieren. In dieser Studie wird eine stabile und reproduzierbare LCM-Methode beschrieben zu isolieren, hoch angereicherten TM und hohe Qualität-RNA, die verwendet werden kann, um die Regulierung der Genexpression und Zelle Signalisierung im TM zu studieren. Darüber hinaus kann die beschriebenen LCM-Methode auch auf andere Gewebe im Auge angewendet werden.
LCM-Technologie und eine hohe Aufmerksamkeit zum Detail zur Optimierung der Gewebe Handhabung spielte eine entscheidende Rolle bei der erfolgreichen Entwicklung dieser Methode. Die Methodik der Gewebe-Erhalt und Isolation ist eine Schlüsselkomponente in hoher Qualität RNA Gene Expression Profiling zu isolieren. LCM erfordert eine sehr hohe Aufmerksamkeit zum Detail seziert, Kryoschneiden, Fixierung, Färbung, Austrocknung und Zeitdauer der Laser-Mikrodissektion, bei der Beschaffung von Qualität RNA51erfolgreich zu sein. Schnittdicke Gewebe kann erhöht werden; jedoch wie die Dicke, so erhöht die UV laser-Energie benötigt. Erhöhte Laser macht Ergebnisse in einen breiteren Laser Weg, der RNA-Abbau verursachen können. Es wurde festgestellt, dass die Laser-Pfad mit 8 µm Abschnitten dünn war und genügend Gewebe für nachgeschaltete RNA-Analyse zur Verfügung gestellt. Abbildung 8 zeigt, wie Optimierung der Gewebe-Vorbereitung drastisch, die Fähigkeit verändern kann, laser-sezieren die TM aus dem Auge. Die Optimierung dieses Schrittes im Protokoll (wie in Abschnitt 4 beschrieben) ergab überlegene Okular-Gewebe Immobilisierung und vollständige Entfernung des O.C.T. (Abb. 8 b) indem Sie einfach mit 75 % anstelle von 95 % igem Ethanol (Abb. 8A) um das Gewebe zu entwässern mit anschließender Inkubation in RNase-freies Wasser, Montage Medium zu entfernen. Weitere Dehydrierung und Färbung wird erreicht, indem Alkohol basierenden Färbung Reagenzien. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Alkohol basierenden Färbung Reagenzien ergab Superior ergibt sich im Vergleich zu wässrigen Färbung Reagenzien (wässrige Cresyl violett oder Hämatoxylin) und RNA Integrität52zu bewahren hilft weiter. Alles in allem Verarbeitung Augengewebe mit optimierten Protokolls mit alkoholhaltigen Färbung Reagenzien ergab konsistente Okular-Gewebeschnitten, die voll auf der PET-Folie Membran immobilisiert wurden.
Unser Ziel für diese Studie war es, eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung von hohen Qualitäts zu entwickeln mRNA aus dem TM Maus Augen für nachgeschaltete Expressionsanalyse um Einblicke in die molekularen Mechanismen zu erhalten, die erhöhten Augendruck und Glaukom zugrunde liegen. Wie in der Heatmap in Abbildung 7dargestellt, sieht das beschriebene Protokoll der isolierenden TM von LCM eine sehr zuverlässige Methode um RNA von TM zu isolieren und Unterschiede in der Genexpression in TM von Wildtyp und Mutanten Mäusen zu studieren. Die hier beschriebene Methode ermöglicht Ermittler auf molekulare Analyse auf zentraler Bedeutung für die Pathogenese des Glaukoms Gewebe in einer in Vivo -System ausführen, die relativ einfach und zuverlässig ist und auf Genanalyse Ausdruck angewendet werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
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